一種免疫細胞的無血清培養基的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于培養免疫細胞的無血清培養基，該培養基包括基礎培養基、牛血清白蛋白、脂肪酸、膽固醇、胰島素、轉鐵蛋白、2-巰基乙醇、丙谷二肽、甘油酯。本發明的無血清培養基成分簡單、性狀穩定、誘導CIK的效率更高，培養獲得的CIK細胞，具有批間差異小、質量穩定、便于質控、減少患者意外感染的優點，對于免疫治療的推廣應用具有重要意義。
【專利說明】-種免疫細胞的無血清培養基
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物、醫學領域，具體地說，本發明是涉及一種免疫細胞的無血清培養 基。
【背景技術】
[0002] 腫瘤過繼免疫治療（adoptive immunotherapy, ACI)是指通過向腫瘤患者輸注具 有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷或激發機體免疫反應殺傷腫瘤細胞，達到治療腫瘤的 目的。它包括非特異性激活和特異性激活的效應細胞，前者是采用非特異性刺激因子（IL2、 干擾素)刺激前體效應細胞，使其活化為具有抗腫瘤活性的效應細胞，如LAK細胞、腫瘤浸潤 性淋巴細胞（TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine induced kill cells, CIK)等；特 異性激活的效應細胞是指采用腫瘤抗原作刺激物所誘導的抗腫瘤效應細胞，如樹突狀細胞 (DC)，細胞毒T淋巴細胞（⑶8+細胞）等。ACI在惡性實體腫瘤治療中的應用已引起了人們 的普遍關注。ACI可通過體外擴增篩選出高活性的免疫效應細胞，將其轉入宿主體內并建立 長期的特異性抗腫瘤免疫效應，克服了疫苗免疫治療的諸多缺陷，具有良好的應用前景，成 為近年來腫瘤免疫治療中十分活躍的研究領域。
[0003] 目前體外培養免疫細胞主要還是用含有人AB血清或FBS的培養基。使用動物血 清的優點是有足夠的量供應，價格便宜，但是使用動物血清的缺點是有潛在傳播傳染病的 風險，以及由于異種蛋白導致過敏癥的發生，而且動物血清并不能很好的支持免疫細胞的 生長。而使用人AB血清的好處是可以很好的支持免疫細胞的生長，但是人AB血清來源困 難，供應量有限，而且也存在傳播傳染病的風險。
【發明內容】
[0004] 本發明首先提供一種用于培養免疫細胞的無血清培養基，該培養基包括基礎培養 基、牛血清白蛋白、脂肪酸、膽固醇、胰島素、轉鐵蛋白、2-巰基乙醇、丙谷二肽、甘油酯；
[0005] 其中基礎培養基是 Iscove's Modif ied Dulbecco's Media( IMDM，gibco)、或者是 RPMI-1640 (gibco)，或者是 Dulbecco's Modified Eagle Medium (gibco)和 Ham，s_F12 (gibco)按照1:1的體積比例混合而成的，優選的為Iscove's Modified Dulbecco's Media ；
[0006] 其中牛血清白蛋白的含量為5-10mg/ml，優選的含量為lOmg/ml ;
[0007] 其中脂肪酸的含量為0. 1-10μ g/ml，優選含量為10μ g/ml ;
[0008] 其中膽固醇的含量為10-20 μ g/ml，優選含量為20 μ g/ml ;
[0009] 其中胰島素的含量為10-20 μ g/ml，優選含量為20 μ g/ml ;
[0010] 其中轉鐵蛋白的含量為〇. 5-15 μ g/ml，優選含量為15 μ g/ml ;
[0011] 其中2-巰基乙醇的含量為I. 0-5.0 μ g/ml，優選含量為5.0 μ g/ml ;
[0012] 其中丙谷二肽的含量為0. 5-3mM，優選含量為2mM ;
[0013] 其中甘油酯的含量為〇· 5-20 μ g/ml，優選含量為20 μ g/ml ;
[0014] 其中pH值保持在6. 8-7. 2之間，最佳pH值保持在7. 0。
[0015] 將上述各組分混合，加水溶解，即可得到本發明的無血清培養基。
[0016] 用本發明的無血清培養基培養獲得的CIK細胞與現在常用的含血清培養基培養 獲得的CIK細胞相比，具有批間差異小、質量穩定、便于質控、減少患者意外感染的優點，對 于免疫治療的推廣應用具有重要意義。與市場上其他的無血清培養基相比，成分更簡單、性 狀更穩定、誘導效果CIK效率更高。本發明有助于提高國內細胞治療的安全性和標準化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖IAIM-V培養CIK的流式細胞術檢測結果圖；
[0018] 圖2實施例1的無血清培養基培養CIK的流式細胞術檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0020] 實施例I :1000ml無血清培養基的制備
[0021] 將一袋一升裝IMDM干粉（Gibco)UOg牛血清白蛋白（Roche)、IOmg脂肪酸 (sigma)、20mg 膽固醇（sigma)、20mg 胰島素（sigma)、15mg 轉鐵蛋白（sigma)、5mg2_ 巰基乙 醇（Amresco)、434mg 丙谷二膚（sigma)、20mg 甘油酯（sigma)、3. 024g NaHCO3 (sigma);超 純水加至1000ml，攪拌溶解，調節PH值至7. 0左右，0. 22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0022] 實施例2 :造血干細胞的分離
[0023] 無菌條件下取足月剖腹產或足月正常產乙肝病毒檢測陰性孕婦的臍帶血50? 80ml，放于含CPDAl復合抗凝劑的采血袋中，4°C保存，所有樣本均在12小時內進行分離； 將一份臍血分成三份。每份用生理鹽水1:1進行稀釋，將稀釋好的臍帶血沿管壁緩慢加入 含Ficoll Hypaque人淋巴細胞分離液上層(兩者比例為1:1)，其相對密度為1.077g/L，進 行梯度離心（2000r/minX30)，取中間云霧狀的單個核細胞層，用MDM培養液離心洗滌2 次，每次l〇〇〇r/min，離心5min。棄上清后用無血清培養基重新懸浮細胞調整密度成3? 5X10 6/ml。
[0024] CIK細胞的誘導和擴增
[0025] 在上述分離的干細胞懸液中添加重組人IFN-Y終濃度為1000u/ml，然后移入培 養瓶中，置于37°C，5%C0 2飽和濕度培養箱中培養24小時，之后，每瓶添加人⑶3單克隆抗 體,人重組白介素1和人重組白介素2,終濃度分別為100ng/ml，100u/ml和500u/ml。繼續 培養48?72小時后顯微鏡下細胞計數，然后用CIK細胞培養液調節細胞密度為3 X IO5Ail， 分裝到T25培養瓶中，進行擴大培養，此后，每隔72小時按上述相同條件擴大培養一次，培 養至第21天時收集CIK細胞待用。
[0026] 實施例3 :CIK細胞誘導及測試
[0027] 無菌條件下取足月剖腹產或足月正常產乙肝病毒檢測陰性孕婦的臍帶血50? 80ml，放于含CPDAl復合抗凝劑的采血袋中，4°C保存，所有樣本均在12小時內進行分離；將 一份臍血分成三份。每份用生理鹽水1:1進行稀釋，將稀釋好的臍帶血沿管壁緩慢加入含 Ficoll Hypaque人淋巴細胞分離液上層（兩者比例為1:1)，其相對密度為1.077g/L，進行 梯度離心（2000r/minX 30)，取中間云霧狀的單個核細胞層，用頂DM培養液離心洗滌2次， 每次1000r/min，離心5min。棄上清后，用MDM培養液調整細胞為lXIOVml，往預先加了 900 μ I AM-V (gibco) (AM-V作為對照)、900 μ 1實施例1的無血清培養基的6孔板中 各加入100 μ 1，即接種密度為IX IOfVml (2個重復)，每孔lml。再往6孔板中添加重組人 IFN- γ終濃度為1000u/ml，然后移入培養瓶中，置于37°C，5%C02飽和濕度培養箱中培養24 小時，之后，每孔添加人CD3單克隆抗體，人重組白介素1和人重組白介素2,終濃度分別為 100ng/ml，100u/ml和500u/ml。此后，每隔72小時進行一次換液，培養至第21天時收集 CIK細胞待用。
[0028] 本次實驗結果表明，在培養21天后，AM-V組的細胞擴增了 5倍左右，而本發明的 培養基擴增了 15倍左右(見表1)。同時這2組細胞存活率都在98%左右。而流式細胞術檢 測⑶3+⑶56+雙陽性細胞，AM-V組為8. 4% (圖1)，本發明培養基為23. 2% (圖2)。從本次 實驗中看出，不管是從CIK的擴增狀況，還是CD3+CD56+雙陽性細胞本發明培養基都明顯優 于 AM-V。
[0029] 表1兩種培養基培養21天的CIK細胞生長情況
[0030]
【權利要求】
1. 一種用于培養免疫細胞的無血清培養基，其特征在于該培養基包括基礎培養基、牛 血清白蛋白、脂肪酸、膽固醇、胰島素、轉鐵蛋白、2-巰基乙醇、丙谷二肽和甘油酯； 其中基礎培養基是Iscove's Modified Dulbecco's Media、或者是RPMI-1640,或者是 Dulbecco's Modified Eagle Medium和 Ham' s_F12 按照 1:1 的體積比例混合而成的。
2. 根據權利要求1所述的用于培養免疫細胞的無血清培養基，其特征在于 其中牛血清白蛋白的含量為5-10mg/ml ; 其中脂肪酸的含量為〇. 1-lOu g/mll ; 其中膽固醇的含量為10-20 ii g/ml ; 其中胰島素的含量為10-20 U g/ml ; 其中轉鐵蛋白的含量為0.5-15 yg/ml ; 其中2-巰基乙醇的含量為1. 0-5. 0 y g/ml ; 其中丙谷二肽的含量為〇. 5-3mM ; 其中甘油酯的含量為〇. 5-20 y g/ml。
【文檔編號】C12N5/0783GK104371973SQ201310357469
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月15日 優先權日:2013年8月15日
【發明者】胡少青, 劉洋, 趙靜, 邱曄, 張麗麗, 吳明遠, 王翔, 孫迎秋, 施潔琦, 范星洲 申請人:協和華東干細胞基因工程有限公司