無飼養細胞培養基和系統的制作方法

專利名稱：無飼養細胞培養基和系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞培養。更具體地，本發明涉及用于飼養細胞非依賴型細胞培養系 統的培養基、系統和方法。
背景技術：
人胚胎干(hES)細胞來源于胚囊(4-5天大的早期胚胎)的內層細胞團(ICM)。hES 細胞是多能細胞類型，其能夠產生三種主要的胚層，即外胚層、內胚層和中胚層[1，2]。換言 之，當給予必要的分化刺激時，這些細胞可發育成成人體內的超過200種細胞類型。或者， 當不給予分化刺激時，這些細胞將自我更新，產生多能子代細胞。有鑒于此，認為可以操縱hES細胞的多能行為以便更加有效地產生用于治療適應 癥的細胞和組織例如用于治療帕金森氏病[3]、糖尿病[4]或脊髓損傷[5]。不過，這些潛 在用途并不僅僅限于產生用于移植的組織。最近，已經操縱hES細胞形成特定組織類型以 便測試新的藥物和化合物[6]。可盡管有這些進展，在建立安全的培養方法之前，hES細胞 仍不具有治療活性。1998年首次成功實現對hES細胞的衍生化[1]。Thomson等(1998)發現，采用有 絲分裂滅活型飼養層和胎牛血清(FBS)可成功繁殖hES細胞。不過，使用異基因產物，例如 人或動物血清和小鼠成纖維細胞，可能會在培養系統中引入污染產物，例如牛綿狀腦病[7，
8]。后來，還證明加入這些動物成分可引入免疫原性物(例如，N-羥乙酰神經氨酸，Neu5Ac) (Martin等2005 ；Heiskanen等2007)，提示生長于這些條件下，細胞的表型會受到微環境的 調控。顯然，需要建立改進的hES細胞培養方法，同時又能為hES細胞的體外擴增提供必要 的條件。有鑒于此，許多研究者在研究使用人飼養細胞，包括人包皮成纖維細胞[9，10]和 成人骨髓細胞[11]。已經證明這兩種細胞均支持hES細胞生長，由此可消除動物衍生的飼 養細胞造成污染的危險。不過，研究發現，經長期增殖后會出現分化率升高和異常核型[12，
9]。例如，經細胞遺傳學分析，一些hES細胞出現非整倍型[12]，包括獲得染色體17q[13] 和20三體[14]。為解決這一問題，許多研究者一直嘗試建立完全每不含動物產物的hES細胞培養 條件。具體而言，Xu等(2005)鑒定到堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)信號對于hES細胞 自我更新是至關重要的[15]，而其他研究者則推測調變轉化生長因子(TGF)-i3信號途徑 對于防止默認分化是必需的[16]。后來，Ludwig等(2006)使用復雜蛋白質混合物和大量 的純化人血清白蛋白成功實現對hES細胞的物飼養細胞培養[17]。不過，這一研究發現，當 hES細胞培養數月后出現了 47XXY核型。盡管這已經取得了顯著的進步，但hES細胞的成功 增殖顯然仍需要飼養細胞。有趣的是，Xu等(2001)證實，來自小鼠胚胎成纖維細胞(MEF) 的條件培養基(CM)可支持hES細胞生長達130代倍增，而仍保持細胞的正常核型[18]。另一種需要依賴小鼠成纖維細胞飼養細胞才能存活并擴增的細胞類型是原代人 角化細胞。實際上，用于增殖hES細胞的許多培養技術，即血清和飼養細胞，均與角化細胞培養類似。已經證實，原代角化細胞需要依賴小鼠成纖維細胞飼養細胞才能進行體外非分 化擴增(Dawson 等 2006)。目前還不了解MEF對hES細胞培養物具有何種功能。不過已經證實這些飼養細胞 提供了多種對hES細胞以及角化細胞維持非分化狀態而言至關重要的蛋白質。

發明內容
現有細胞培養系統依賴于無有絲分裂活性的飼養細胞層為細胞生長和/或增殖 提供生長和條件因子，這些細胞培養系統在治療用途中具有嚴重的潛在缺陷。更具體地，使 用異基因產物可引入污染和感染因子，例如BSE和HIV。因此，本發明人認為需要一種新的改進的細胞培養系統，其能夠消除或至少降低 對飼養細胞的需求。不僅如此，本發明人出乎預料地發現，包含IGF-I氨基酸序列和成熟玻 連蛋白的第1至64位氨基酸殘基的合成嵌合蛋白在細胞培養基這展現出更高的活性，且特 別是能夠刺激細胞遷移和/或增殖達到高水平。寬泛而言，本發明涉及用于取代或替代飼養細胞的無血清非條件細胞培養基，其 包含一或多種分離的飼養細胞替代因子。預期所述一或多種分離的飼養細胞替代因子可以 是任何蛋白質或其生物學活性片段，其通常由飼養細胞分泌和/或產生，以促進飼養細胞 依賴型細胞的生長。在第一個方面，本發明提供細胞培養基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰島素樣生長因子(IGF)氨基酸序列和玻連蛋白(VN) 氨基酸序列；(ii)選自以下一組中的一或多種分離的飼養細胞替代因子人生長激素(hGH)、 骨形態發生蛋白15ΦΜΡ-15)、生長分化因子9(GDF-9)、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷 曲相關蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細胞生 長因子(HGF)、轉化生長因子-α (TGF-α)、轉化生長因子-β (TGF-β )、神經生長因子、 血小板衍生的生長因子-β (PDGF-β)，PC-衍生的生長因子(progranulin)、白細胞介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 和激活素-A(Activin-A)；和(iii)不含血清或含有明顯減少量的血清，所述明顯減少量的血清在缺乏IGF時 不能支持細胞的生長。優選地，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子選自以下一組hGH、BMP-15、 ⑶P-9、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子和激 活素-A。甚至更優選地，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子是激活素-A。在優選的實施方式中，所述細胞培養基還包含選自以下一組的一或多種額外的生 物學活性蛋白堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、IGF-I、IGF-II和層 粘連蛋白。在更優選的實施方式中，所述一或多種額外的生物學活性蛋白選自bFGF和層粘 連蛋白。優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。
在優選的實施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟玻連蛋白的第1至64位氨基酸殘基。優選地，所述合成嵌合蛋白還包含接頭序列，所述接頭序列為一或多個甘氨酸殘 基，且在特別優選的實施方式中，所述接頭序列還包含一或多個絲氨酸殘基。更優選地，所述接頭序列為(Gly4Ser)4t5在另一優選的實施方式中，所述細胞培養基還包含分離的含IGF的復合物，其中 IGF 選自 IGF-I 禾口 IGF-II。在另一優選的實施方式中，其中所述分離的含IGF的復合物包含IGF-I，所述細胞 培養基還包含胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)和VN。在另一優選的實施方式中，其中所述存在于所述分離的含IGF的復合物中的IGF 是IGF-II，所述細胞培養基還包含VN。優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約0. lng/ml和50 μ g/ml之 間。更優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約5ng/ml和1500ng/ml之 間。甚至更優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約25ng/ml和 1000ng/ml 之間。進一步更優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約150ng/ml和 600ng/ml 之間。進一步甚至更優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約250ng/ml 和400ng/ml之間。合適地，所述細胞培養基用于培養飼養細胞依賴型細胞。可以容易地理解，飼養細胞依賴型細胞是任何需要飼養細胞進行增殖的細胞。非 限制性的實例包括小鼠和人胚胎干細胞、人胚胎生殖細胞、人胚胎癌細胞和角化細胞。優選地，所述飼養細胞依賴型細胞選自人胚胎干細胞和角化細胞。在第二方面，本發明提供胚胎細胞培養基，其包含大約250ng/ml和lOOOng/ml之 間的包含IGF氨基酸序列和VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約50ng/ml和lOOng/ml之 間的bFGF，大約25ng/ml和50ng/ml之間的激活素-A和大約10 μ g/ml和50 μ g/ml之間的 層粘連蛋白。優選地，所述胚胎干細胞培養基包含大約lOOOng/ml的所述合成嵌合蛋白，大約 100ng/ml的bFGF，大約35ng/ml激活素-A和大約40 μ g/ml的層粘連蛋白。優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。在優選的實施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟玻連蛋白的第1至64位氨基酸殘基。在第三方面，本發明提供細胞培養系統，其包含培養容器以及第一方面的細胞培 養基或第二方面的胚胎干細胞培養基。在第四方面，本發明提供細胞培養方法，其包括在第一方面的細胞培養基、第二方 面的胚胎干細胞培養基和/或第三方面的細胞培養系統中培養一或多種細胞的步驟。
優選地，所述一或多種細胞是飼養細胞依賴型細胞類型。更優選地，所述一或多種細胞是hES細胞或角化細胞。在第五方面，本發明提供藥物組合物，其包含一或多種根據第四方面的方法產生 的細胞以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在優選的實施方式中，所述藥物組合物包含一或多種選自以下一組的細胞hES 細胞、角化細胞和角化細胞前體細胞。在第六方面，本發明提供輸送根據第四方面培養的一或多種細胞的方法，其包括 將第五方面的藥物組合物輸送給個體以便促進所述個體中的一或多種細胞的更新、細胞遷 移和/或增殖。可以理解，在上述個方面中，一或多種飼養細胞替代因子包括其生物學活性片段。在說明書全文中，除非另有說明，否則“包含”應被理解為指的是包括所述的元素 或元素的組，但并不排出任何其他元素或元素的組。


為了使得本發明易于理解并易于付諸實施，以下通過參考所附附圖通過舉例的方 式描述優選的實施方式，在附圖中，相同的附圖標號指的是相同的部分，其中圖1 剔除血清替換(KSR) (Invitrogen)培養基與玻連蛋白 IGFBP3 IGF-I bFGF (VN GF-hES)培養基 SDS-PAGE 分析。用于比較 VN GF-hES 培養基與 KSR 培養基的10%梯度聚丙烯酰胺凝膠。泳道含有M)250kDa標記物；1)0. 1 μ L KSR ；2) IOyL VN:GF-hES培養基。分子量標記物來自Amersham Biosciences。圖2 生長于KSR和VN:GF-hES培養條件中的hES細胞和MEF細胞的形態學。使 用含A)KSR和E) VN:GF-hES的培養基增殖MEF細胞。使用含B) KSR和F) VN:GF-hES的培養 基增殖hES細胞。當培養于含C) KSR和G) VN:GF-hES的培養基中時，hES細胞表達小鼠抗 Oct-4抗體識別的標記物。當培養于含D)KSR和H) VN:GF-hES的培養基中時，hES細胞表達 小鼠抗Tra 1-81抗體識別的標記物(標度線= 200um)。圖3 =RT-PCR分析分離自hES細胞的mRNA，所述hES細胞生長于KSR和VN:GF-hES 培養條件。(A) RT-PCR分析來自生長于KSR培養條件的hES細胞的mRNA。泳道含有M) IOObp DNA 梯；l)18sRNA 內標(151bp 條帶)；2) ISsRNA 陰性對照；3) AP (177bp 條帶)；4) AP 陰性對 照；5)0ct-4(169bp條帶)；和6) Oct-4陰性對照。(B)RT-PCR分析來自生長于VN: GF-hES 培養條件的hES細胞的mRNA。泳道含有M) IOObp DNA梯；1) 18sRNA內標(151bp條帶)； 2) ISsRNA 陰性對照；3)AP(177bp 條帶)；4)AP 陰性對照；5)0ct_4(169bp 條帶)；6)和 0ct_4 陰性對照。圖4 二維分離僅收集自MEF細胞的條件培養基。(A)收集自MEF細胞的條件培養 基(CM)的第一維分離。第一維分離包括注入濃縮自MEF CM的0. 8mg蛋白質并使用0_500mM NaCl梯度分離。(B)然后收集隨后的級份并進行使用0-100%ACN梯度的第二維分離，如材 料和方法部分所述。所示數據代表所進行的一式三份的分析。圖5 二維分離收集自MEF:hES細胞培養物的條件培養基。(A)收集自MEF:hES細 胞的CM的第一維分離。第一維分離包括注入濃縮自MEF:hES細胞CM的0. 8mg蛋白質并使 用0-500mM NaCl梯度分離。(B)然后收集隨后的級份并進行使用0-100% ACN梯度的第二維分離，如材料和方法部分所述。所示數據代表所進行的一式三份的分析。圖6 使用玻連蛋白IGFBP3:IGF-I:EGF(VN:GF -KC)培養基增殖用于蛋白質
組學分析的第二代角化細胞的形態學和細胞表面標記物表達。無血清分離原代角化細胞， 隨后使用(A)含有血清的培養基和飼養細胞層增殖，或(B)使用VN:GF-Kc培養基并結合飼 養細胞層進行無血清分離。第4天，以針對(C)角蛋白6和(D)角蛋白14的抗體探測角化 細胞，以評價使用VN:GF-Kc增殖的原代角化細胞是否仍然是未分化的。每兩天自三份不同 的患者樣品收集條件培養基(標度線=IOOum) (η = 3，圖像來自所分析的3個不同患者樣 品這的代表性培養物)。圖7 二維分離條件培養基。培養基收集自(A)僅飼養細胞和(B)飼養細胞角化 細胞培養物。第一維分離包括將濃縮自條件培養基的Img蛋白質注入到0-500mMNaCl梯度 上。隨后，收集級份并進行使用0-100% ACN梯度的第二維分離，如材料和方法部分所述。 (匯集了來自3個不同患者培養物的條件培養基)。圖8 無飼養細胞和血清的hES細胞的形態學和標記物分析。hES細胞增殖15 代，并通過以下指標監測細胞分化=A)形態學、B)DAPI, C)SSEA-4、D)0ct4、Ε) SSEAl和F) TRA1-60。圖9 實時PCR分析表達于未分化的干細胞中的轉錄物。hES細胞增殖15代，針對 以下指標進行實時 PCR :Dppa、REX、TERT, UTF1、S0X2、F0XD4、Nanog 和 0ct4。發明詳述通過對飼養細胞依賴型系統中的旁分泌相互作用進行蛋白質組學分析而產生本 發明。更具體地，本發明人假設對飼養細胞依賴型系統的體外微環境進行表征可能會鑒定 到由飼養細胞產生的飼養細胞依賴型細胞生長所需的因子。這種蛋白組學方法的關鍵在于 使用VN:GF培養基檢測條件培養基，所述VN:GF培養基成分清楚并具有最小的蛋白含量。使 用這種細胞培養基消除了外源性蛋白質對飼養細胞所分泌的關鍵因子的“掩蓋”，所述關鍵 因子對飼養細胞依賴型細胞生長可能具有重要作用。利用這種分析方法，本發明人在上述體外微環境中鑒定到由飼養細胞分泌的一些 因子。因此，可使用這些因子來配制出明確定義的非細胞條件培養基來培養細胞，由此消除 了對飼養細胞的需求。因此本發明使得對細胞生長所用的飼養細胞非依賴型細胞培養系統 和培養基的研發取得的重大進展。本領域人員可以理解，本發明可廣泛用于任何細胞培養系統，用于生長來自人類 和非人類細胞的細胞，使之能夠以飼養細胞非依賴型方式生長。僅舉例而言，本發明可用于 鼠ES細胞。在本發明中，“飼養細胞替代因子”指的是這樣的蛋白質，當其被納入細胞培養基 中時，其模擬、取代或代替飼養細胞的一或多種功能和/或特性。更具體地，感興趣的功能 包括促進飼養細胞依賴型細胞的粘附、增殖和/或保持其活力，但不限于此。本發明也預期飼養細胞替代因子的生物學活性片段的用途。術語“蛋白質”指的是氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，D-或 L-氨基酸，這是本領域人員所熟知的。術語“蛋白質”包括并涵蓋“肽”和“多肽”，“肽”通常用于描述不超過五十(50)個 氨基酸的蛋白質，“多肽”通常用于描述超過五十(50)個氨基酸的蛋白質。
在一個實施方式中，所述“生物學活性片段”的生物學活性不低于衍生出該片段的 蛋白質的生物學活性的10%、優選地不低于25%、更優選地不低于50%且甚至更優選地不 低于 75、80、85、90 或 95%。部分由于飼養細胞依賴型系統旁分泌相互作用的復雜性，對在此所述的條件培養 基的蛋白組學分析證實，存在大量適合用作飼養細胞替代因子的蛋白質。僅舉例而言，合適 的飼養細胞替代因子包括細胞外基質蛋白質類、生長因子、細胞信號和信號轉導蛋白和生 長因子受體，但不限于此。在優選的實施方式中，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子選自以下一組人 生長激素、骨形態發生蛋白15、生長分化因子9(GDF_9)、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷 曲相關蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細胞生 長因子(HGF)、轉化生長因子-a (TGF-a)、TGF-i3、神經生長因子、血小板衍生的生長因 子-β (PDGF-β)、PC-衍生的生長因子(progranulin)、白細胞介素(IL)-U IL-2、IL-4、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 和激活素-A。更優選地，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子選自以下一組人生長激素、 骨形態發生蛋白15、生長分化因子9、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白2、 Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子和激活素-A。甚至更優選地，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子是激活素-A。在其他通用的實施方式中，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子可選自表1、表 2、表3、表4和表5中所列的蛋白質。因此，本發明提出將一或多種上述飼養細胞替代因子納入細胞培養基用于培養飼 養細胞依賴型細胞。預期基于使用一或多種(本文所述的)飼養細胞替代因子或其他分離 的和/或合成的蛋白質成分配制本發明的細胞培養基。在本發明中，術語“分離的”指的是物質已經從其天然狀態中取出或已經以其他方 式進行人工處理。分離的物質可以基本上或實質上不含那些天然狀態下通常與其伴隨的成 分，或者可以被操控使得其與那些天然狀態下通常與其伴隨的成分一起處于人工狀態。分 離的物質可以是天然或重組形式的。在本發明中，術語"合成的"指的是非天然存在的，而是通過人工技術干預制備 的。就合成的蛋白質而言，這包括通過重組或化學合成以及本領域人員熟知的組合技術而 產生的分子。本發明的一個特別的優勢在于，在優選的實施方式中，所述細胞培養基和系統可 以添加生長因子而非所述一或多種飼養細胞替代因子。有利地，此類生長因子在缺乏血清的情況下刺激離體(ex vivo)原代細胞培養物 產生顯著的增殖應答。在通用的方面中，本發明的細胞培養基包含合成嵌合蛋白通過結合并共活化生長 因子受體(例如IGF-I受體)和VN-結合整聯蛋白受體而刺激細胞遷移和/或增殖。在優 選的實施方式中，所述合成嵌合蛋白包含IGF氨基酸序列和VN氨基酸序列。典型地，但不 限于此，所述合成嵌合蛋白包含成熟VN的結合整聯蛋白受體的結構域以及IGF或至少可結 合的IGF受體的IGF結構域。國際公開文本W004/069871給出了合適的合成嵌合蛋白的非 限制性實例，通過引用將該文獻并入本申請。
優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。在優選的通用實施方式中，VN氨基酸序列是VN(且特別是成熟VN)上能夠結合 αν整聯蛋白的任何部分或結構域。在優選的實施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟VN的1至64位氨基酸殘基。本發明還預期將接頭序列納入上述合成嵌合蛋白(但不限于此)，如國際公開文 本TO04/069871所描述的那樣，其提供了合適的接頭序列的通用實例，通過引用將該文獻 并入本申請。優選地，所述接頭序列包含一或多個甘氨酸殘基。更優選地，所述接頭序列還包含一或多個絲氨酸殘基。在優選的實施方式中，所述接頭序列包含Gly4Sert5在特別優選的實施方式中，所述接頭序列為(Gly4Ser)4。在特別優選的實施方式中，所述合成嵌合蛋白包含IGF-I、(Gly4Ser)4接頭序列和 成熟玻連蛋白的第1至64位氨基酸殘基(以下稱為IGF-I/1-64VN)。在特別優選的實施方 式中，IGF-I/1-64VN是單一的連續的蛋白質。在優選的實施方式中，本發明的所述細胞培養基還包含分離的含IGF的蛋白質復 合物形式的生長因子，其中IGF選自IGF-I和IGF-II。在另一優選的實施方式中，其預期加入分離的含IGF的蛋白質復合物，其中IGF是 IGF-II，所述細胞培養基還包含玻連蛋白。在另一優選的實施方式中，預期加入IGF-I，所述細胞培養基還包含IGFBP和VN。適當地，IGFBP選自 IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 和 IGFBP-6。優選地，所述IGFBP 是 IGFBP-3 或 IGFBP-5。在存在IGF-II和VN或IGF-I、IGFBP和VN的實施方式中，這些蛋白質可被納入蛋 白質復合物中，例如見國際公開文本W002/24219所述的那樣。根據上述內容可以容易地理解，本發明的分離的蛋白質復合物可以是非共價結合 的寡蛋白復合物形式，或寡蛋白復合物已經被共價交聯(可逆性或不可逆性)，但不限于 此。適當地，所述一或多種飼養細胞替代因子以促進細胞生長和增殖的濃度存在于細 胞培養基中。在通用的優選實施方式中，所述或每一分離的飼養細胞替代因子的終濃度適合 于支持細胞活力、維持、再生和/或增殖且優選地在0. lng/ml和50μ g/ml之間。更優選 地，所述或每一分離的飼養細胞替代因子的終濃度可以在0. lng/ml和50 μ g/ml之間，且 更優選地為 lng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、25ng/ml、30ng/ ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、lOOng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ ml、350ng/ml、400ng/ml 500ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、lOOOng/ml、1500ng/ml ,且甚至更 優選地為 2 μ g/ml>3 μ g/ml>4 μ g/ml>5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml、25 μ g/ml、 30 μ g/ml>35 μ g/ml、40 μ g/ml, 45 μ g/ml 禾口 50 μ g/ml。可以容易地理解，本發明適合用于依賴飼養細胞或其他飼養細胞替代技術(例 如，基質膠或高細胞外基質濃度)而增殖的任何細胞類型。
通常，此類飼養細胞依賴型細胞需要復雜的營養，其生長需要血清，并需要來自飼 養細胞的分泌和可溶性因子才能生長和增殖。例如參照多能細胞或原代細胞培養物，其還 希望將細胞維持在未分化狀態用于進一步的用途，特別是治療用途。在一個優選的實施方式中，所述飼養細胞依賴型細胞是人胚胎干細胞。在另一優選的實施方式中，所述飼養細胞依賴型細胞是角化細胞。本發明的一個特別的優勢是飼養細胞非依賴型細胞培養系統，其不需要血清或僅 需要極少的血清。因此在特定方面中，本發明提供細胞培養基和系統，其包含一或多種飼養細胞替 代因子，由此不需要外源性的動物來源的因子，例如飼養細胞和血清，或者對其需求僅為顯 著降低的水平，由此仍維持細胞生長和/或活力。因此可以理解，“不含血清或血清的量在缺乏IGF時不能支持細胞的生長〃指的 是沒有血清，或血清的量或濃度顯著低于細胞體外生長和/或增殖通常所需的最佳的量或 濃度。術語"血清"指的是來自血液的成分，其包含大量的大分子、脂類物質和微量元 素的載體蛋白、細胞粘附和擴散因子、小分子量營養物以及激素和生長因子。在操作上，血 清可被定義為是去除紅細胞、血小板和血漿中的凝結成分之后所剩的蛋白質性無細胞血液 成分。細胞培養最常用的血清成分是胎牛血清，即FBS，不過也可使用成體牛血清、馬血清及 其蛋白質成分(例如Fraction V血清白蛋白)。典型地，哺乳動物細胞需要5-10%之間的血清，這取決于細胞類型、培養時間、是 否存在飼養細胞和/或培養系統的其他細胞成分以及本領域人員已知的其他因素。因此，在優選的實施方式中，本發明預期了低于5%的血清，更優選地低于2%的 血清，甚至更優選地低于的血清或有利地不超過0. 5%、0. 4%、0. 3%或0. 2%的血清 (ν/ν)。在特別有利的實施方式中，本發明預期了無血清或不超過0.5%或0.25%的血清 (ν/ν)。適當地，本發明的培養基可包含其他明確的成分。非限制性的且在一些情況中任 選的成分包括一些熟知的基礎培養基，例如DMEM或Ham' s培養基，抗生素例如鏈霉素或青 霉素、人血清白蛋白(HSA)、磷脂類(例如，磷脂酰膽堿)、鞘磷脂、激活素-A、氨基酸補充物 例如L-谷氨酰胺、抗氧化劑例如β -巰基乙醇、緩沖液例如碳酸鹽緩沖液、HEPES和二氧化 碳源，后者通常由細胞培養箱提供。本發明也預期使用額外的生物學活性蛋白或其片段，它們可調節細胞生長、分化、 存活和/或遷移，例如胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、胰島素樣生長因子-II (IGF-II)、層 粘連蛋白、表皮生長因子(EGF;Heldin等，1981，Science 41122-1123)、成纖維細胞生長 因子(FGF ；Nurcombe 等，2000，J. Biol. Chem. 275 30009-30018)、堿性成纖維細胞生長因 子(bFGF ；Taraboletti 等，1997，細胞生長.Differ. 8471-479)、骨橋蛋白(Nam 等，2000， Endocrinol. 141 1100)、凝血酶敏感蛋白(Nam等，2000，見上文)、腱糖蛋白-C(Arai 等，1996，J. Biol. Chem. 2716099)、PAI-I (Nam 等，1997，Endocrinol. 1382972)、纖溶酶原 (Campbell 等，1998，Am. J. Physiol. 275E321)、纖維蛋白原(Campbell 等，1999，J. Biol. Chem 27430215)、纖維蛋白(Campbell 等，1999，見上文)或轉鐵蛋白(Weinzimer 等，2001，J. Clin. Endocrinol. Metab. 861806)。優選地，本發明提供細胞培養基還包含選自以下一組的一或多種額外的生物學活 性蛋白EGF、bFGF、IGF-I、IGF-II和層粘連蛋白。更優選地，所述一或多種額外的生物學活性蛋白選自bFGF和層粘連蛋白。本領域人員了解層粘連蛋白是真核細胞細胞外基質糖蛋白家族，它們由至少三種 不完全相同的鏈(α、β、和Y鏈)組成，并通過α、β、和Y鏈的不同組合而產生一些不 同的亞型。不同層粘連蛋白亞型的非限制性實例包括層粘連蛋白-1、層粘連蛋白_2、層粘 連蛋白_3、層粘連蛋白_4、層粘連蛋白-5、層粘連蛋白-5Β、層粘連蛋白-6、層粘連蛋白-7、 層粘連蛋白_8、層粘連蛋白-9、層粘連蛋白-10、層粘連蛋白-12、層粘連蛋白-13、層粘連蛋 白-14和層粘連蛋白-15、但不限于此。也預期在優選的實施方式中，所述層粘連蛋白是前 述層粘連蛋白亞型的組合。還應進一步理解，層粘連蛋白可以是任何來源的，但要合適納入 細胞培養基中，特別是具有治療用途的細胞培養培養基，例如來源于小鼠、豬、人、羊，但不 限于此。在特別優選的實施方式中，層粘連蛋白是來自Millipore的CatalogueNo. CC095。在優選的實施方式中，所述一或多種額外的生物學活性蛋白的終濃度可以在 0. lng/ml 直至 50μ g/ml、60y g/ml、70y g/ml、80y g/ml、90y g/ml 或 ΙΟΟμ g/ml 之間。優 選地，所述一或多種額外的生物學活性蛋白的終濃度可以在0. lng/ml和50μ g/ml之間， 且更優選地為 50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、lOOOng/ml、1500ng/ml 和甚至更優 選地為 2 μ g/ml>5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml、25 μ g/ml、30 μ g/ml、35 μ g/ml、 40 μ g/ml 禾口 45 μ g/ml。在包括層粘連蛋白的特別優選的實施方式中，層粘連蛋白的濃度可達50 μ g/ ml (或有利地每IOcm2細胞培養皿面積25-100 μ g)，且優選地在10 μ g/ml和40 μ g/ml之 間。在通用的方面中，本發明提供胚胎干細胞培養基。具體而言，所述胚胎干細胞培養 基包含大約250ng/ml和lOOOng/ml之間的包含IGF氨基酸序列和VN氨基酸序列的合成嵌 合蛋白，大約50ng/ml和100ng/ml之間的bFGF，大約25ng/ml和50ng/ml之間的激活素-A 和大約10和大約50 μ g/ml之間的層粘連蛋白。在優選的實施方式中，本發明的細胞培養基包含大約lOOOng/ml的IGF氨基酸序 列與VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約lOOng/ml的bFGF，大約35ng/ml激活素-A和大 約40 μ g/ml層粘連蛋白。在特別優選的實施方式中，所述合成嵌合蛋白是IGF-I/1-64VN。根據前述內容，本領域人員可容易地理解，可通過本領域人員熟知的任何合適方 法產生任何蛋白質，且特別是所述分離的飼養細胞替代因子。本發明也預期所述分離的飼養細胞替代因子的變體。在一個實施方式中，“變體” 的一或多個氨基酸已經被不同的氨基酸取代。本領域人員熟知，可以將一些氨基酸改變為 具有大體相似特性的其他氨基酸，而不改變蛋白質的活性的性質(保守性取代)。在一個實施方式中，變體與在此所述的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、優 選地至少80 %、更優選地至少90 %且有利地至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的序列相同 性。
優選地，在本發明的合成蛋白質的至少60%、更優選地至少75%、甚至更優選地 至少90%和有利地在本發明的合成蛋白質的基本上全長范圍測量序列相同性。為了確定百分比序列相同性，可通過計算機化運行的算法(Geneworksprogram by Intelligenetics ；GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in theffisconsin Genetics Software Package Release 7. 0, Genetics Computer Group,575Science Drive Madison, WI, USA, 通過引用將其并入本申請)或通過觀察而進行氨基酸和/或核苷酸序列的最佳比對，并通 過所選擇的任一方法產生最佳比對(即，在比較窗上產生最高的百分比同源性)。可參考 BLAST程序，例如Altschul等，1997，Nucl. Acids Res. 253389，通過引用將其并入本申請。在另一實例中，“序列相同性”可以理解為指的是通過DNASIS計算機程序 (Version 2. 5for windows ；可獲自 Hitachi Software engineering Co. , Ltd. , South San Francisco, California, USA)計算出的“匹配百分比”。有關序列分析的詳細討論可參見Unit 19. 3of CURRENT PR0T0C0LSIN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel 等(John Wiley & Sons Inc NY，1995-1999)。本發明還預期在此所述的任何蛋白質的衍生物且特別是飼養細胞替代因子的衍 生物。在本發明中，“衍生物”已經通過例如添加、綴合其他化學部分或與之復合或通過 本領域人員已知的翻譯后修飾技術而改變。“添加”氨基酸可包括與其他肽或多肽融合。其他肽或多肽例如可以輔助該蛋白質 的純化。例如這包括多組氨酸標簽、麥芽糖結合蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)、A蛋白或谷胱甘 肽S-轉移酶(GST)。本發明預期的其他衍生物包括，但不限于，修飾側鏈、加入非天然氨基酸和/或蛋 白質合成過程中的其他衍生物以及使用交聯劑和其他對蛋白質造成構象限制的方法。本發 明預期的側鏈修飾的非限制性實例包括修飾氨基酸，例如通過乙酸酐進行酰化；以丁二酐 和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基進行酰化；以乙酰亞氨基甲酯進行脒基化；以氰酸鹽對氨基進 行氨甲酰化；以5-磷酸吡哆醛對賴氨酸進行pyridoxylation，隨后以NaBH4還原；通過與 醛反應隨后以NaBH4還原進行還原烷基化；以及以2，4，6_三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基進 行三硝基芐化作用。可通過多種方法修飾氫硫基，例如以過甲酸氧化為磺基丙氨酸；使用4-氯汞基苯 磺酸、4-氯汞苯甲酸、2-chloromercuri-4-nitrophenol、氯化苯汞和其他汞制劑形成汞衍 生物；與其他巰基化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其他取代的馬來 酰亞胺反應；以碘乙酸或碘乙酰胺進行羧甲基化；和以氰酸鹽在堿性PH進行氨甲酰化。通過以焦碳酸二乙酯進行N-乙氧甲酰基化或通過以碘乙酸衍生物進行烷基化而 修飾組氨酸殘基的咪唑環。在肽合成過程中摻入非天然氨基酸和衍生物的實例包括但不限于使用4-氨基丁 酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、叔丁甘氨酸、 正亮氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構 體。對蛋白質進行化學衍生化的其他實例參見Chapter 15of CURRENTPR0T0C0LS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan 等，John Wiley & Sons NY(1995-2001)。
根據本發明，可通過本領域人員已知的任何合適的方法制備蛋白質。本發明的蛋白質可以是基本上純的天然形式。在其他實施方式中，可以通過化學合成產生蛋白質。化學合成技術是本領域人 員已知的，合適的方法學的實例可參見Chapter 18 of CURRENTPR0T0C0LS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan 等，John Wiley & Sons NY(1995-2001)。在其他實施方式中，制備的蛋白質可以是重組蛋白。本領域人員熟知如何產生重組蛋白，標準方案的實例例如可參見Sambrook等， MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold SpringHarbor Press，1989)，通過引用 將其并入本申請，特別是 16 和 17 節；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel等，(Johnffiley & Sons, Inc. 1995-1999)，通過引用將其并入本申請，特別是10和 16章；和CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan等，(John Wiley & Sons， Inc. 1995-1999)，通過引用將其并入本申請，特別是第1、5和6章。重組蛋白可還包含融合配偶體。熟知的融合配偶體的實例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，人IgG的 Fc部分、麥芽糖結合蛋白(MBP)和六組氨酸(HIS6),它們對于通過親和層析來分離融合蛋 白特別有用。為了通過親和層析純化融合蛋白，有關的親和層析基質分別為以谷胱甘肽_、 直鏈淀粉_、和鎳_或鈷_綴合的樹脂。許多此類基質可以“試劑盒”的形式獲得，例如使用 (HIS6)融合配偶體的QIAexpress 系統(Qiagen)以及Pharmacia GST純化系統。在一些情況中，融合配偶體還具有蛋白酶裂解位點，例如因子Xa或凝血酶的位點， 這允許通過相關的蛋白酶對本發明的融合蛋白進行部分消化，由此從中釋放出重組蛋白。 經隨后的層析分離可從融合配偶體分離釋放出的蛋白質。本發明的融合配偶體還包括“表位標簽”，它們通常是短肽序列，具有相應的特異 性抗體。熟知的表位標簽的實例包括c-myc、血細胞凝集素和FLAG標簽，可容易地獲得針對 它們的特異性單克隆抗體。適合用于表達的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，例如大腸桿菌 (Escherichia coli)(例如DH5 α )、酵母細胞、利用桿狀病毒表達系統的Sf9細胞、CHO細 胞、COS、CV-I、NIH 3T3和HEK293細胞，但不限于此。可通過向飼養細胞依賴型細胞中弓I入表達構建體而實現重組蛋白表達。典型地，表達構建體包含可操作地連接于啟動子的待表達核酸(編碼重組蛋白)。啟動子可以是組成型或誘導型的。組成型或誘導型包括，例如，四環素-阻抑型、蛻皮激素-誘導型、酒精-誘導型和 金屬硫蛋白-誘導型啟動子。啟動子可以是天然存在的啟動子(例如α晶狀體蛋白啟動 子、ADH啟動子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、人延伸因子α啟動子和病毒啟動子例如SV40、 CMV, HTLV-衍生的啟動子)，或是合成的雜合啟動子，它們組合了一種以上啟動子的元件 (例如SRa啟動子)。在優選的實施方式中，所述表達載體包含選擇標記物基因。選擇標記物可用于選 擇轉化的細菌(例如bla、kanR和tetR)或轉化的哺乳動物細胞(例如潮霉素、G418和嘌 呤霉素)。可通過熟知的技術將表達構建體引入飼養細胞依賴型細胞，且特別是哺乳動物細胞，例如電穿孔、微粒轟擊、病毒介導的基因轉移、磷酸鈣沉淀、DEAE-Dextran、陽離子脂質 體、脂轉、陽離子脂質體(lipofectamine)等等，但不限于此。可用于將核酸輸送至hES的技術的非限制性實例可參見Kobayashi等，2005， Birth Defects Research Part C Embryo Today :Reviews,7510—18。適合于在角化細胞中表達重組生長因子蛋白的方法的非限制性具體實例可參見 Supp 等，2000，J. Invest. Dermatol. 1145 和 Supp 等，2000，WoundRepair Regen. 826—35。藥物組合物本發明還提供藥物組合物，其包含使用本發明的培養基和/或系統產生的一或多 種細胞，例如hES細胞和角化細胞，但不限于此，以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發明的藥物組合物可用于促進或有助于細胞遷移、組織更新和傷口愈合。通常，本發明的組合物可按需用于治療或預防用途。例如，可施用治療或美容制劑 形式的包含hES細胞、角化細胞或角化細胞前體細胞的藥物組合物用于修復皮膚、傷口愈 合、燒傷愈合和其他皮膚病治療。優選地，所述藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑適合用于施用給哺乳動物，優選 地施用給人。在具體的實施方式中，藥物組合物包含按照本發明培養的自體或同種基因hES細 胞或角化細胞。術語“藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”指的是固體或液體填充物、稀釋劑或 包囊化物質，它們可安全地用于全身施用。根據具體的施用途徑，可使用本領域人員已知的 多種載體。這些載體可選自蔗糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽瓊脂、明膠、滑石粉、硫酸 鈣、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸緩沖液、乳化劑、等滲鹽水和鹽例如礦物鹽(包括 鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽)、有機酸例如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽以及無熱源的水。描述藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的參考文獻可見 Remington' sPharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991),通過弓|用將 其并入本申請。可采用任何合適的施用途徑給患者提供本發明的組合物。例如，可采用口服、直 腸、胃腸外、舌下、含服、靜脈、關節內、肌肉內、皮內、皮下、吸入、眼內、腹腔內腦室內、經皮 等途徑。劑量形式包括片劑、分散劑、混懸劑、注射劑、溶液、糖漿、含片、膠囊、栓劑、氣霧 劑、經皮貼片等等。這些劑量形式還可包括專用的注射或植入式控釋裝置或在此基礎上改 進的其他植入形式。可通過包衣實現控釋制劑，例如，使用疏水性聚合物，包括丙烯酸樹脂、石蠟、高碳 脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸，以及某些纖維素衍生物，例如羥丙基甲基纖維素。可通過采用 其他聚合物基質、脂質體和/或微球體而實現控釋。控釋制劑和輸送裝置的非限制性實例 包括滲透泵、基于聚丙交酯共乙交酯(PLG)聚合物的微球體、基于水凝膠的聚合物、化學交 聯的葡聚糖凝膠例如OctoDEX 和dex-lactate-HEMA。可采用適合劑量配制品的施用方式和藥用有效量來施用上述組合物。在本發明 中，給患者施用的劑量應該足以使得患者在合適的時間段內產生有益的應答。藥物施用的 量取決于待治療的個體，包括其年齡、性別、體重和一般健康狀況、以及從業者所要考慮的因素。就用于傷口愈合的藥物組合物而言，可具體參考美國專利5，936，064和國際公開 文本W099/62536，通過引用將它們并入本申請。在涉及角化細胞的一個具體實施方式
中，本發明的組合物適合于原位噴霧施用。術語〃噴霧〃涵蓋并包括例如〃氣溶膠〃或〃霧〃或〃冷凝物〃等通常描述小 滴形式的液體混懸物的術語。治療用途本發明的用于增殖飼養細胞依賴型細胞的細胞培養基、系統和方法的一個漢族要 用途是治療用途。在特定方面，本發明預期用于輸送根據前述方法培養產生的一或多種細胞的方 法，其包括給個體輸送前述藥物組合物的步驟。本方法特別用于治療哺乳動物且特別是人。不過，本領域人員可以理解本發明也 可用于獸醫領域，用于治療寵物、家畜和表演動物。按照本發明的方法培養的hES細胞的治療用途包括，但不限于，組織再生、組織移 植或組織更新，但不包括產生有可能被認為是人類的實體的方法。此類方法的非限制性實 例包括使卵子受精的方法、通過分裂在4細胞階段進行克隆的方法以及通過置換核DNA進 行克隆的方法。ES細胞且特別是hES細胞的治療用途的非限制性實例包括Shufaro等，2004, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 18(6) :909_27。在一個優選的實施方式中，本發明提供用于離體增殖原代角化細胞的培養基、培 養系統和培養方法，根據本發明，可將所述細胞施用于個體。在具體的實施方式中，所述角化細胞是按照本發明培養的自體或同種基因角化細 胞。此類方法包括施用前述藥物組合物，可以通過微針注射至特定組織部位，例如參 見美國專利6，090, 790，以局部乳劑、洗劑或密封敷料的形式施用于創傷、燒傷或潰瘍處， 例如參見美國專利6，054，122，或是釋放所述組合物的植入物，例如參見國際公開文本 W09/47070。還可通過其他方法對皮膚細胞進行遺傳學修飾以便產生皮膚替代物，例如通過對 所需生長因子表達進行遺傳工程化(Supp等，2000，J. Invest. Dermatol. 1145)。這一領域 的綜述例如參見 Bevan 等，Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16231。還預期將轉染或轉化的細胞“種植”于受者，例如參見國際公開文本W099/11789。還可使用這些方法刺激細胞遷移并由此促進或加快傷口和燒傷愈合、修復皮膚病 變例如潰瘍、組織替代和移植例如通過體外培養自體皮膚、內部器官例如腎臟和肺的上皮 重新生成以及修復損傷的神經組織。皮膚替代治療已經為本領域人員所知，其可采用共培養上皮/角化細胞細胞系， 例如參見Kehe等，1999，Arch. Dermatol. Res. 291600，或體外培養原代(通常是自體)表 皮、真皮和/或角化細胞。這些技術也使用工程化的生物材料和合成的聚合物“支架”。這一領域的綜述例如可參見Terskikh & Vasiliev, 1999, Int. Rev. Cytol. 18841 禾口 Eaglestein & Falanga, 1998, Cutis 621。
更具體地，Izumi等，2000，J. Dent. Res. 79 798描述了如何產生可用于顱面手術 的替代口腔粘膜。可體外擴增胎角化細胞和皮膚成纖維細胞產生用于移植的皮膚來治療皮 膚病變，例如參見Fauza等，J. Pediatr. Surg. 33 357，同時已經發現體外培養于透明質酸 衍生的生物材料上的來自真皮和表皮皮膚元件的皮膚替代物可用于治療燒傷(Zacchi等， 1998，J. Biomed. Mater. Res. 40187)。聚合物支架也可用于促進替代皮膚工程化，例如參見Sheridan等，2000， J. Control Release 14 91和Fauza等，1998，見上文，例如使用微球體作為將皮膚細胞輸 送至傷口和燒傷處的藥劑(LaFrance & Armstrong，1999，TissueEng. 5153)。通常為治療目的而產生的角化細胞皮片負責燒傷創面的最后閉合。這種皮片移植 技術適合于所有部分皮層燒傷，且最適合用于治療大面積傷口，在該情況中沒有外界的幫 助幾乎不可能使得傷口和供者部位實現早期永久性閉合。這種類型的損傷是造成不久前巴 厘島爆炸案中燒傷患者死亡的原因。目前無法從來自患者的5角硬幣大小的皮膚活檢樣品生長出足以覆蓋成人全身 的皮膚。這一培養給出需要17天。不過，降低患者創傷、感染風險、結痂以及當前需要在永 久皮膚移植之前進行昂貴的臨時皮膚替代等問題均急需進行早期皮膚替代。此外，培養皮 膚的皮片包含多種皮膚細胞，有效是成熟的，而有些不成熟。單純讓培養的角化細胞達到匯 合(這是產生皮片所必需的)導致細胞提前喪失其原始特征，即發生分化。當施加培養的 皮膚皮片時，僅那些未成熟的細胞能夠粘附并在患者上存活。由于粘附面積小，皮片極易于 因患者的摩擦或運動而損傷，有時可造成整個移植物的脫落，皮片上成熟皮膚細胞越多，移 植物越有可能不成功，而細胞本身在創面上將無法增殖和遷移。因此，早期使用不成熟的細 胞顯然可導致更好的移植物存活并降低疤痕形成。本發明因此提供噴霧或氣溶膠輸送方法將離體培養的皮膚細胞輸送至患者的燒 傷、潰瘍或損傷皮膚處，與現有的皮片移植技術相比，可使得患者有更多的面積被更多的不 成熟皮膚細胞所覆蓋。這最早可以在7天時實現。這將顯著降低疤痕形成、休克和熱損失， 并能夠快速恢復部分皮層燒傷乃至全皮層燒傷的皮膚功能。本發明所預期的另一種治療是治療燒傷患者以實現全皮層傷口的早期閉合，因為 同時失去皮膚的表面(表皮)和深層(真皮)的傷口對培養皮膚的接受性很差。本發明預 期通過噴霧于皮膚上而使用真皮替代物以便實現早期永久閉合這些最為可怕的損傷。同時 預期生物學真皮替代物和合成的真皮替代物。例如，可在包含本發明的分離的蛋白質復合 物的來自尸體的去表皮化、去細胞化真皮支架上覆蓋合成的表皮(敷料)。大約7天后，本 發明人假設這種真皮將被自體的內皮細胞大量浸潤。此時，去除合成的真皮，并將患者自身 的離體擴增成纖維細胞和角化細胞施加到異體真皮(allo-dermis)上。預期噴霧于皮膚上會獲得成功，而表皮皮片不能，這是因為真皮替代物會起到營 養穩定化支架的作用，促進皮膚細胞和正常出現于皮膚中的其他重要細胞的遷移和錨定。 這將導致全層皮膚損傷處更好地接受培養的細胞。因此，本領域人員能夠容易地理解并實施本發明。以下為非限制性實施例。 實施例實施例1 分析人胚胎干細胞體外微環境
材料和方法小鼠胚胎成纖維細胞培養物MEF(SCRC-1046 細胞系，Cryosite, Lane Cove, Sydney, NSW, AUS)在 80cm2 培養 瓶中擴增 6 代(Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA)，使用 85% Dulbecco' s Modification of Eagle' s 培養基(DMEM) (Invitrogen,MountWaverley, VIC,Australia), 添加了 10%胎牛血清(FBS) (Invitrogen)，2xl(T3M L-谷氨酰胺(Invitrogen)和 1000IU/ mL青霉素/鏈霉素(Invitrogen)，5% C02，37°C。隨后向含有MEF的瓶中加入絲裂霉 素-C(Sigma-Aldrich, CastleHill, NSW, AUS)，將細胞在 37°C,5% CO2 培養 2. 5 至 3 小時。 給培養皿(10cm2) (Nalge Nunc International)覆蓋 0· 明膠(Sigma-Aldrich)，至少 1 小時后加入MEF。MEF細胞以20，000細胞/cm2接種于0. 明膠(Sigma-Aldrich)覆蓋的 IOcm2 (Nalge Nunc International)組織培養皿中，每孔 2. 5mL MEF 培養基。使預粘附的MEF細胞血清饑餓2小時，隨后改變為無血清培養基，VN:GF_hES。 該培養基的組成為:K0-DMEM (Invitrogen)，含有 0. 6 μ g/mLVN (Promega, Annandale, NSW, AUS),0. 6μ g/mL IGFBP-3(Tissue TherapiesLtd, Brisbane, QLD, AUS)，0. 2 μ g/ mL IGF-I (GroPep, Adelaide, SA, AUS)，0. 02 μ g/mL 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) (Chemicon，Boronia，VIC，AUS)，2xl(T3M L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1000IU/mL 青 霉素 / 鏈霉素(Invitrogen)，1 μ L/mL β -巰基乙醇(Sigma-Aldrich)和 12ng/mL 白血病抑制因子(LIF) (Chemicon)。培養的MEF細胞總共為5個IOcm2/孔培養皿 (NalgeNunc-International)，添加了 2. 5mL VN:GF_hES/ 孔，培養于 5% C02，37°C。接種細 胞后48小時后每日更換培養基。細胞培養96小時后，收集到大約150ml的CM。人胚胎干細胞培養物將BGOlV hES細胞(ATTC，Manassa, VA, USA)培養于第6代絲裂霉素-C滅活的 MEF上，培養基為 hES 細胞培養基，含有K0-DMEM，0. 02 μ g/uLbFGF (Chemicon)，2xl(T3M L-谷 氨酰胺，1000IU/mL青霉素/鏈霉素，1 μ L/mL β-巰基乙醇，12ng/mL LIF和剔除血清替換 (KSR) (Invitrogen)。根據hES細胞的生長速度和匯合程度，按1 1至1 6將其分至 IOcm2培養皿中，其中使用了 0.05%胰蛋白酶/EDTA (Invitrogen)消化30秒，37 °C，5 % CO2。 然后將細胞重懸于hES細胞培養基中，500-600g離心5分鐘，并轉移至IOcm2培養皿，培養 皿以0. 1 %明膠預包被，含有第6代絲裂霉素-C滅活的MEF飼養層。從轉移后48小時開 始，每天給hES細胞和飼養細胞換液。hES細胞的無血清培養涉及使用預先鋪板于IOcm2培養皿 (NalgeNunc-International)中的前述滅活的MEF細胞，使用前血清饑餓2小時。然后將 hIES細胞轉移至前述2. 5mL VN:GF_hES培養基中的血清饑餓的MEF中。生長培養物，37°C， 5% C02，從最初轉移后48小時開始每天換液。待細胞匯合后收集到大約75ml的CM。凝膠分析KSR與VN GF-hES培養基使用10%恒組成聚丙烯酰胺凝膠比較含有KSR的培養基與含有VN:GF_hES的培 養基中的蛋白質含量。簡言之，將樣品稀釋至其合適的濃度，與樣品緩沖液(50mL甘油/5g SDS，溶于45mL TRIS-HCl/溴酚藍)混合，100°C變性10分鐘。泳道中加入250kDa Amersham 分子量標記(AmershamBiosciences, Piscataway, New Jersey, USA), 0. IuL KSR 培養基 (Invitrogen)和 10 μ L VN:GF_hES 培養基。使用 IX 電泳緩沖液(25mM Tris/200mM 甘氨酸)100伏分離蛋白質 1-1.5小時。使用0610)(!6 SilverSNAP Stain Kit II (Pierce, Rockford，IL, USA)將凝膠銀染30分鐘直至條帶顯現，然后使用G =BOX chemi (Syngene， Fredrick, Massachusetts, USA)觀察。免疫熒光階段特異性胚胎抗原-1 (SSEA-I)、腫瘤抑制抗原1_81 (Tra 1-81)和八聚體結合 轉錄因子-4(0ct-4)是hES細胞全能性的標記物[1，2]。監測這些標記物的存在以確保 CM是從未分化hES細胞中收集的。以2%多聚甲醛/提取緩沖液(0. 5% triton X-100， 0. IM Pipes緩沖液，5mM MgCl2禾Π ImM EGTA, ρΗ 7. 0)固定hES細胞培養物10分鐘。去除 固定劑，將培養物在Dulbecco' s磷酸緩沖鹽水(PBS) (Sigma-Aldrich)中洗滌3次，每次 5分鐘，以去除多余的多聚甲醛。將培養物在4%山羊血清中溫育1小時，25°C。去除該溶 液，并將以1 50稀釋于4%山羊血清中的針對SSEA-I、Tra 1-81和0ct_4的初級抗體 (Chemicon)與培養物在25°C溫育1小時。去除初級抗體并重復洗滌步驟。然后將抗小鼠第 二抗體(Chemicon)以1 100稀釋于PBS并溫育1小時。去除第二抗體，重復洗滌步驟， 以 Nikon TE-2000 熒光顯微鏡(Nikon，Lidcombe, NSW, AUS)采集集落圖像。RT-PCR 分析進行逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析以檢測Oct-4和堿性磷酸酶 (AP)基因的轉錄產物，以進一步分析hES細胞的分化狀態。使用tri-reagent及其 方案(Sigma-Aldrich)自hES細胞集落分離RNA。RNA樣品與寡dT 18聚體雜交以產 生 cDNAo Oct-4 引物為有義，5，-CTTGCTGCAGAAGTGGGTG-GAGGAA-3，(SEQ ID NO 1)； 反義，5’ -CTGCAGTGT-GGGTTTCGGG-CA-3’ (SEQ ID NO :2)。堿性磷酸酶引物為有義， 5，-TCAGAAGCTCAACACCAACG-3，(SEQ ID NO 3)；反義，5，-TTGTACGTCTTGGAG-AGGGC-3，(SEQ ID NO 4) ο 18sRNA 內標引物為有義，5’ -TTCGGAACTGAGGCCATGA-T-3，(SEQ ID NO 5)；反 義，5，-CGAACCTCCGACTTTC-GTTCT-3，(SEQ ID NO :6)。將 1 μ g 的 cDNA 加至這 4 個引物組 中的每一組，進行最初的變性步驟94°C，5分鐘，隨后是35個循環的94°C變性30秒，55°C 退火30秒和72°C延伸30秒，隨后在72°C最后延伸5分鐘。然后在2%瓊脂糖凝膠上分析 10 μ L的RT-PCR產物，100伏，1小時。然后使用溴乙啶(Sigma-Adlrich)顯現產物。二維液相層析蛋白組學分析采用二維液相層析對CM樣品進行分級，其中使用BioLogic Duo-flow系 統(Bio-rad，Hercules, California, USA)進行第一維分離，第二階段使用 Beckman Coulter，s ProteomeLab PF 2D(Beckman Coulter, Gladesville, NSW, AUS)平臺進行第 二維分離。首先，使用1. 2mL的100%乙酸將CM酸化至ρΗ 4，并使用體相SPE苯基硅吸 附劑(Alltech-Australia, Dandenong South, VIC, AUS)濃縮。簡言之，將基質在 100% 甲醇預處理并傾倒至IOcm3自流柱(Bio-radLaboratories)中，并使用3倍柱體積的含 有0. 乙酸的超純水平衡。隨后將樣品加至柱上(Bio-rad Laboratories)，通過疏水 性相互作用將蛋白質結合于樹脂。蛋白質洗脫使用2倍柱體積的溶于含0. 三氟乙 酸(TFA) (Sigma-Aldrich)的超純水中的80 %乙腈(ACN)。然后使用eppendorf離心機 5301 (Eppendorf South Pacific, North Ryde, NSW, AUS)將洗脫的樣品凍干。使用 20mM Tris-HCl重建濃縮的樣品，并使用Coomassie Plus Protein分析試劑(Pierce)估計蛋白 質濃度。然后使用結合于BioLogic DuoFIow高效液相層析系統(Bio-rad Laboratories)的UNO-Q(Bi0-rad Laboratories)陰離子交換層析柱對蛋白質樣品進行第一維解析。簡言 之，使用鹽梯度(20mM Tris-HCL至500mM NaCl含有的20mM Tris-HCL)對多肽進行分級， 每2分鐘收集ImL級份，流速為0. 5mL/分鐘第一維分離完成后，含有蛋白質的陰離子交換級份在第二維中被進一步分離，其 中在30x 4. 2mm無孔硅C18柱上進行高效反相液相層析。將來自每一級份的200 μ L樣品 注入 ProteomeLab PF 2D (Beckman Coulter)進行反相層析。使用 0-100 % ACN/0. 1 % TFA梯度在30分鐘內獨立地將注入的樣品級份化，在4到24分鐘之間收集每1分鐘的樣 品。對于所有分離，流速和柱溫度均分別維持在0. 75mL/分鐘和50°C。使用ProteoVue軟 件(Eprogen, Darien, Illinois, USA)為 MEF CM 和 MEF:hES 細胞 CM 樣品產生二維圖像。樣品制備和MALDI-T0F-T0F質譜樣品在2D層析工作流分級后，自其相應的第二維96孔板中收集400 μ L每一級 份，如前述凍干。然后將凍干樣品還原、烷基化并胰蛋白酶消化。通過將凍干蛋白重懸 于100 μ L的還原緩沖液(0. IM NH4C03/20mM DTT pH7. 9)中，然后在56°C溫育樣品1小時 進行還原。通過向還原的樣品中加入IOyL的50mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)并37°C 避光溫育樣品30分鐘進行烷基化。使用2.2yL測序級改良的胰蛋白酶(Promega)消化 蛋白質并37°C溫育過夜。樣品以微C18ZipTips(Millipore，Bedford, MA, USA)脫鹽，直 接以5mg/ml的溶于60% ACN/0. 1 % TFA的α -氰基-4-羥基桂皮酸(CHCA)將肽洗脫至 Matrix-Associated Laser Desorption Ionization (MALDI) |&巾。i^ffi 10白勺fe 準校正混合物作為以胰蛋白酶消化的樣品點樣的MALDI板的校準物。使用的樣品基質為 CHCA,濃度為5mg/ml，溶于5mM磷酸銨和0. 1 % TFA (Sigma-Aldrich)中的50 %乙腈中。使用 4700Proteomics AnalyserMALDI—TOF—TOF(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)在 Institute forMolecular Bioscience (St Lucia, QLD, Australia)分豐斤樣品。激光能量為 3200 μ J/脈沖，以正反射模式記錄所有質譜(MS)譜。對于MS數據，對每一獲自4700T0F-T0F MS/MS的譜累積1000個點。使用默認的IkV MS/MS方法以4500 μ J/脈沖的激光能量獲取 來自T0F-T0F的所有MS數據。使用來自未解釋的TOF-MS和T0F-T0F MS/MS數據的信息在 MSDB數據庫中查詢哺乳動物輸入項，并以GPS Explorer (Applied Biosystems)自動化詢 問MASCOT數據庫進行。當搜索肽質量時，設置以下參數不完全酶解位點數目=2 ；肽質量 誤差=+/-0. 5 ；酶=胰蛋白酶；變量修飾包括甲硫氨酸氧化；固定修飾包括半胱氨酸的脲 甲基化。選擇最大命中數，并利用蛋白質評分、蛋白質評分可信限、總離子評分(TIS)和總 離子評分可信限來分析蛋白質。簡言之，首先通過TIS將蛋白質分級。評分代表該蛋白質與獲自MS/MS分析的序 列數據基礎匹配程度，評分> 38被認為具有顯著意義(該蛋白質序列數據隨機匹配的ρ < 0. 05)。評分彡38的蛋白質匹配，納入進一步分析，不過，當沒有獲得MS/MS數據時，基于 蛋白質評分來分級蛋白質。這一評分代表肽質量與預測的胰蛋白酶裂解的肽序列的皮片程 度，評分>60被認為具有顯著意義(該質量隨機匹配的ρ <0.05)。基于最高蛋白質評分 選擇蛋白質，不過，報告了大量蛋白質評分<60。這些級份仍被納入進一步分析。此外，使 用 Swiss-Prot，PubMed 禾口 Online Medelian Inheritance in Man (OMIM)搜索來檢查每一 蛋白質的被報道的功能。 樣品制備和使用LC/ESI/MS和LC-MALDI分析的LC/MS
首先，使用印pendorf離心機5301 (Eppendorf South Pacific)將第一維級份和 原始樣品(濃縮條件培養基)凍干，分別用于LC/ESI/MS和LC/MS。如前所述將凍干樣品 還原、烷基化并以胰蛋白酶消化。然后將用于液相層析(LC)的樣品溶解于50/50溶劑A/ B中(溶劑A 0. 甲酸)(溶劑B 90%乙腈，溶于0. 甲酸)。樣品加載于C18300A柱 (150mmx0. 5mmx5 μ m 粒徑)(Vydac, Hesperia, California, USA)，使用 40/60 溶劑 Α/Β,流 速為 300 μ L/分鐘。使用 Agilent IlOOBinary HPLC 系統(Agilent，Inc Santa Clara, California, USA)實現溶劑遞送。電噴射質譜在 Institute of Molecular Biosciences 進行，使 用了 4000ESI_QqLIT質譜儀(Applied Biosystems),其裝備有大氣電離源 (AppliedBiosystems)。使用 Analyst 1. 4. 1 軟件(Applied Biosystems)獲取數據。如前 所述使用MASCOT數據庫GPS Explorer 軟件(version 4.0)進行蛋白質分析，從MS和MS/ MS譜均獲得質量/離子峰信息。簡言之，評分是_10*Log(P)，其中P觀察到的匹配屬于隨 機事件的可能性。各個離子評分> 38代表相同或廣泛同源(ρ < 0. 05)。或者，將收集自LC相的樣品點樣于MS板上，其中使用1 1體積的5mg/ ml 的 CHCA(Sigma-Aldrich)蛋白質樣品用于 LC-MALDI 分析。使用 4700Proteomics Analyser (Applied Biosystems)在 Institute for Molecular Bioscience對板進行分析。 使用MS/MS Mass Standards試劑盒(Sigma-Aldrich)所含的質量標準品對MS和MS/MS數 據進行板寬校正。如前所述使用GPS Explorer 蛋白質分析軟件(version 4.0)自動化搜 索MASCOT數據庫鑒定可能的蛋白質匹配，從MS和MS/MS譜中均獲得了質量/離子峰信息。 如前所述檢查每一蛋白質的功能。結果VN:GF-hES培養基與含KSR的培養基中的蛋白質含量首先從凍存儲備中復蘇hES細胞，然后培養于MEF細胞上，使用含20 % KSR的培養 基。不過，認識到血清中的高豐度蛋白質，例如血清白蛋白，可通過掩蓋重要的因子而影響 所計劃的蛋白組學分析。因此，使用無血清培養基，即VN:GF-hES，來培養細胞。為了比較 KSR與VN:GF-hES的總蛋白質含量，使用10%恒組成聚丙烯酰胺凝膠進行PAGE分析。該分 析發現VN:GF-hES(圖1泳道2)含有極少的蛋白，而與之相比KSR(圖1泳道1)顯然含有 大量未鑒定的蛋白質。生長于VN:GF_hES培養基中的hES細胞和MEF細胞的形態學已經證實，當使用VN:GF_hES培養基作用無血清培養基時，hES細胞可以未分化狀 態粘附、擴增并存活(Richards 2003，數據未發表)。為了確保待分析的條件培養基(CM) 是收集自未分化的hES細胞，對細胞進行了形態學檢查。本實驗發現，VN:GF-hES中增殖的 hES細胞保持了致密的集落，類似于生長在含KSR的培養基的細胞的情況(分別為圖2F和 2B)。此外，在無血清培養基中增殖的MEF細胞表現出與KSR中增殖的細胞具有相似的形態 學(分別為圖2E和2A)。生長于VN:GF_hES培養基中的hES細胞的標記物表達目前尚無用于表征hES細胞的多能性的確定標記物。不過，hES細胞表達多種標記 物，例如SSEA-4、0ct-4和TRA1-81，它們均是未分化hES細胞所特有的。這些標記物一起被 常規用來驗證hES細胞在表型上是未分化的[29]。為了確定生長于VN:GF-hES培養基中的細胞是未分化的，選擇針對TRA1-81和Oct-4的抗體來分析hES細胞的分化狀態。Oct-4 (綠 色)和TRA1-81 (紅色)均顯示在KSR條件和VN:GF-hES條件下培養的hES細胞上有高水平 的蛋白質表達(分別為圖2C和2G以及圖2D和2H)。此外，選擇熒光標記的針對SSEA-4 (未 分化細胞表達)的第二抗體以及熒光標記的針對SSEA-I (未分化細胞不表達)的第二抗體 來進一步分析hES細胞的分化狀態。這一分析發現SSEA-4表達于在KSR或VN:GF_hES培 養基中培養的細胞(數據未顯示)。類似地，SSEA-I不表達于在KSR或VN:GF-hES培養基 培養基中培養的細胞(數據未顯示)。當hES細胞僅與第二抗體溫育時未觀察到免疫反應 性(數據未顯示)。對生長于VN GF-hES中的hES細胞進行RT-PCR分析TRA l-81、0ct_4和SSEA-4 —起表達并不確定是未分化的hES細胞集落。因此，對 Oct-4和AP (堿性磷酸酶)這兩種基因的表達進行RT-PCR分析以進一步驗證hES細胞的分 化狀態。為了確定樣品沒有被互補性脫氧核糖核酸(cDNA)或基因組脫氧核糖核酸(gDNA) 污染，在一系列陰性對照中省卻了模板(數據未顯示)。設計引物使得它們與基因內部的 不同外顯子退火，這樣一來，PCR反應中存在的任何基因組脫氧核糖核酸(gDNA)污染將會 導致出現大于cDNA的分子量條帶。該分析顯示，生長于KSR(圖3A)和VN:GF_hES培養基 (圖3B)中的hES細胞集落表達Oct-4、AP和18sRNA (作為內標對照)的mRNA。該實驗進 一步證實所收集的用于蛋白組學分析的CM是收集自未分化的hES細胞。僅收集自MEF和收集自MEF:hES細胞培養物的條件培養基的二維分離采用新型二維液相層析分離法分離來自MEF細胞(圖4A和4B)和MEF:hES細 胞(圖5A和5B)的CM中存在的蛋白質。該方法涉及在第一維中通過鹽梯度分離蛋白 質。然后以采用H2O ACN梯度的第二維分離方法分析第一維級份含有的蛋白質。然后使用 ProteomeLab 軟件包ProteoVue顯示蛋白質。僅有MEF細胞的CM(圖4B)與MEF:hES細 胞的CM(圖5B)之間顯然在蛋白質譜上有明顯區別。通過這種蛋白組學方法在CM中觀察 到多種蛋白質，不過，在此僅討論那些可能與hES細胞體外微環境有關的蛋白質。從3份二 維層析譜中總共鑒定到來自僅有MEF細胞的192種蛋白質和來自MEF:hES細胞的247種蛋 白質(分別為圖4B和5B)。然后分離、消化這些蛋白質并進行MALDI-T0F-T0F分析。此外， 從第一維分離中分離出來自MEFCM的35級份和來自MEF:hES細胞CM的38級份，經消化后 轉移至LC/ESI/MS (分別為圖4A和5A)。此外，處理來自MEF CM的1份原始樣品(濃縮、凍 干并胰蛋白酶消化)和來自MEF:hES細胞CM的1份原始樣品并進行LC-MALDI。自MEF細胞和MEF:hES細胞條件培養基中鑒定的蛋白質采用三種方法分析MEF CM和MEF:hES細胞CM中的蛋白質，MALDI-TOF-TOF、LC/ ESI/MS和LC-MALDI。使用Mascot數據庫分析CM中存在的蛋白質，結果被歸納為7種蛋白 質ECM、膜、核、分泌型、分化和生長因子、和來源于血清。此外，利用登錄號、分子量、蛋白質 評分和離子評分將蛋白質分離。使MALDI-T0F-T0F與蛋白質評分相關聯。MEFCM培養基的 MALDI-T0F-T0F結果發現了 3種ECM蛋白、3種膜蛋白、3種核蛋白、1種細胞漿蛋白、4種分泌 型蛋白和7種分化和生長因子蛋白(表1)。此外，
發現4種膜蛋白、4種核蛋白和6種分泌型蛋白(表2)。所有MALDI-T0F-T0F結果，除了核 蛋白外源性核核糖核蛋白M(表2)之外，通過測定它們的蛋白質評分沒有被證實。LC/ESI/ MS結果與離子評分相關聯。MEF CM的 /ESI/MS結果發現了 11種ECM蛋白、4種膜蛋白、5種核蛋白、1種細胞漿蛋白、3種分泌型蛋白和3來自血清的蛋白(表1)。此外，MEF:hES細 胞CM的LC/ESI/MS結果發現了 12種ECM蛋白、4種膜蛋白、6種核蛋白、6種細胞漿蛋白、1 種分泌型蛋白和2來自血清的蛋白(表2)。LC-MALDI結果也與離子評分相關聯。MEF CM 的LC-MALDI結果發現了 1種ECM蛋白、1種膜蛋白、2種細胞漿蛋白和1種分泌型蛋白(表 1)。此外，MEFihES細胞CM的LC-MALDI的結果發現了 1種細胞漿蛋白和2種分泌型蛋白 (表2)。通過LC/ESI/MS分析發現的所有蛋白質均被通過它們的離子評分確定為被證實或 表現出廣泛的同源性。進行所有上述三種分析以便增加所得結果的正確性。討論自1998年首次獲得之后[1]，hES細胞已經成為最有希望的組織替代和修復的體 外細胞來源。不過，這些“原始的”細胞需要外來的成分，例如MEF細胞和牛血清，來維持未 分化增殖。這帶來了嚴重的問題，因為接受來自這些細胞的產物的患者可能無意中感染一 些疾病，例如“新變體Creutzfeldt-Jakob病”，其可能存在于這些不能明確定義的和/或外 來的培養成分中。不僅如此，Dr. Ajit Varki證實在這些異基因培養條件下增殖的hES細 胞系獲得了非人類唾液酸Neu5Gc，其被認為是來源于MEF飼養細胞[30]。這一發現無疑證 明hES細胞十分容易受到存在于其體外微環境中的因素的影響。因此，如果要實現這些細 胞的治療潛能，顯然需要將外來成分從現有的培養系統中清除。有鑒于此，許多研究人員在嘗試建立完全定義的無異基因的培養系統。近來， Ludwig等(2006)發現了一種方法，即TeSRl，可用于無飼養細胞衍生和增殖hES細胞系 [17]。盡管TeSRl方法被證明可成功體外增殖hES細胞，但其仍需要大量的蛋白質，例如 13mg/ml HAS和23 μ g/ml的胰島素。這是非常不理想的，因為高濃度的生長因子可誘導 hES細胞具有腫瘤性。此外，鑒于白蛋白是載體蛋白，因此高濃度的純化HSA很可能攜帶其 他的未知蛋白質。因此，這種TeSRl技術并未在商業上達到規模增殖hES細胞的能力。此 外，Ludwig等(2006)發現當hES細胞在TeSRl培養系統中培養5個月后出現了 47XXY核 型，這使得這些細胞在治療上不具有活力[17]。用于連續增殖hES細胞的完全定義的無血 清培養基，即VN:GF-hES，能夠以未分化狀態長期增殖hES細胞[31]。不過，hES細胞的自 我更新仍需要MEF，足見這些細胞對hES細胞體外微環境的重要性。目前仍不知道MEF細胞對hES體外微環境具有何種作用。不過，已經證實i3T3， 一種用于擴增角化細胞的小鼠胚胎成纖維細胞細胞系，分泌大量的IGF和ECM蛋白[32]以 及各種其他成分。因此，可以認為MEF也分泌對hES細胞自我更新具有重要作用的類似蛋 白質。已經逐漸評價了大量這些ECM蛋白質促進hES細胞的自我更新環境的作用。這些蛋 白質包括純化的膠原蛋白[33]、層粘連蛋白[18，33]、纖連蛋白[20，33]和基質膠"[33]。 不過，這些ECM培養技術僅在向培養基中加入其他生長促進成分時才能取得成功。就此而 言，Xu等(2001)發現層粘連蛋白和基質膠 僅在與MEF條件培養基相結合時才能成功增 殖hES細胞[18]。這提示對hES細胞的存活十分重要的生長促進成分可能是由MEF分泌至 CM中的。有鑒于此，本發明人假設MEF飼養細胞分泌對hES細胞的自我更新具有重要作用 的新蛋白質，且這些蛋白質可通過蛋白組學技術而被鑒定。近來，Prowse等(2005)和Wee Eng Lim和Bodnar (2002)分析了成纖維細胞飼養細胞及其相應的CM的蛋白組學譜。這些 研究初步探討了成纖維細胞對hES細胞體外微環境的影響。不過，本研究通過不僅分析來自MEF的CM，而且還分析來自MEF與hES細胞的共培養物的CM，使得這方面有了進一步的進展。如本文所述，再次證明完全定義培養基，即VN:GF_hES，支持hES細胞的未分化生 長(圖1-3)。本研究證明，在VN:GF-hES中而非含KSR的培養基中培養細胞，有助于解析 CM中的蛋白質(圖1)。此外，這一分析清楚地證明VN:GF-hES培養基具有極少的蛋白質含 量。相反，SDS-PAGE分析發現KSR培養基中存在許多高豐度蛋白質；其中一些可能已經掩 蓋了細胞所分泌的重要因子(圖1泳道1)。不過，盡管VN:GF-hES培養基的蛋白質含量極 低，但后續的質譜分析發現，在從VN:GF-hES培養基中無血清培養的細胞收集的CM中仍存 在一些牛血清蛋白，例如o-2-HS-糖蛋白和白蛋白。這并不完全出乎預料，因為在將細胞轉 移至VN:GF-hES培養基之前，這些細胞培養在含牛血清的培養基中。此外，高豐度的血清蛋 白質，例如白蛋白，通常具有粘附性并結合細胞外表面和培養容器，因此使得它們難以通過 洗滌步驟而完全被去除。不僅如此，Prowse等(2005)和Lim和Bondar (2002)的蛋白組學 分析也發現一些牛血清蛋白，即使他們在將細胞在無血清培養基中培養之前也采取了一系 列洗滌步驟也是如此。不過，他們的研究和本研究所采取的在將細胞轉移至無血清條件下 之前的一系列洗滌和血清饑餓步驟，顯著極低了這些血清來源的成分在CM中的存在。因 此，這些牛蛋白沒有顯著干擾蛋白組學譜的解析(圖3B和圖4B)。不過，應該指出本方法 與其他蛋白組學分析相比的具有重要的不同；即本發明收集的CM采用了對細胞生長最佳 的培養基，即含有VN:GF-hES。相反，Prowse等(2005)和Lim和Bondar (2002)的蛋白組學 策略采用基礎的不含促有絲分裂補充物的無血清培養基，即先前研究中的CM收集自“饑餓 的”和/或“應激的”細胞，且因此并非處于最佳的生長條件。分析在此所述的CM，也在CM中鑒定到大量通常與細胞分泌相關的蛋白質，例如來 自單獨MEF細胞和MEF:hES細胞培養物的細胞外基質蛋白質類(ECM)。存在這些蛋白質可 能是蛋白裂解事件所致。例如，在MEF:hES細胞CM中隱約鑒定到膠原酶3活性。此外，本 研究證實的一些ECM蛋白質通常用于無血清培養系統并支持hES細胞粘附和增殖。這些 包括膠原蛋白I和IV、纖連蛋白1[20]、層粘連蛋白M、層粘連蛋白α 1、4和5[21，18，34] 和蛋白聚糖[18](表1和2)。此外，一些上述ECM蛋白類似于Prowse等(2005)和Lim和 Bondar (2002)在人和動物飼養細胞CM中鑒定的ECM蛋白，因此再次證實這些蛋白在CM中 的重要性。此外，在MEF CM中證實的凝血酶敏感蛋白1也被Prowse等(2005)在人飼養細 胞CM中鑒定到其在細胞粘附、遷移和增殖具有作用[35，36]。凝血酶敏感蛋白1基因已知 與血小板衍生的生長因子(PDGF) [37]、bFGF[37]和轉化生長因子-β (TGF-β) [38]協同作 用，這三種生長因子對hES細胞自我更新具有重要作用。其他感興趣的ECM蛋白包括膠原 蛋白V、VII、XI、XII和XV、腱糖蛋白X和多能聚糖核心蛋白(versican core protein)。盡 管沒有在hES細胞培養物中研究這些蛋白質，但它們各自具有重要的功能，例如細胞粘附、 增殖和遷移，且因此也可構成支持hES細胞自我更新的環境。如前所述，ECM蛋白僅在補充生長促進劑時才能成功支持hES細胞擴增。重要 的是，MEF細胞CM發現了一些與hES細胞自我更新相關的生長因子，例如IGF-I、IGF-II, TGF-β 2、PDGF、骨形態發生蛋白15 (ΒΜΡ15)、表皮生長因子(EGF)和肝細胞生長因子(HGF) (表1)。迄今為止，加入到hES細胞培養物中的最為重要的生長成分是胰島素[39]。有趣 的是，已經證實IGF-I能夠替代角化細胞培養過程中對胰島素的需求[26]。確實，IGF-I是VN:GF_hES無血清培養基的重要成分，且已經證實其在hES細胞培養基中可替代對胰島 素的需求[31]。此外，先前的研究證實IGF-II和玻連蛋白(VN)之間的協同相互作用導致 細胞遷移增加[40，41]。初步的研究提示IGF-II也可促進hES細胞增殖和自我更新[31]。 還證實TGF-β和PDGF在維持hES細胞處于未分化狀態中具有作用[16，23]。有趣的是， Hollier等(2005)和Schoppet等(2002)證實這兩種肝素結合生長因子能夠結合VN并與 VN相互作用[26，42]。通過本蛋白組學分析在CM中觀察到的其他生長因子包括EGF和HGF。 它們被報道可激活hES細胞的分化[43]。不過，bFGF，作為加入到hES細胞培養物中的常 見自我更新成分[44，45] ,Schuldiner等(2000)也報道其誘導hES細胞分化。這些數據提 示生長因子對分化可具有相反的作用，這取決于它們的濃度和/或表達水平。因此，EGF和 HGF這兩種顯示促進分化的生長因子，當以合適的濃度使用時也可促進hES細胞的自我更 新環境。就CM中觀察到的BMP15而言，目前還沒有研究該生長因子和hES細胞之間的關系。 不過，BMP4已被證實促進hES細胞分化[46]。因此，如果BMP15與BMP4具有類似的作用， 則可以在培養基中加入拮抗劑例如noggin[47]、卵泡抑素[48]、激活素A[49]和bFGF[22]， 為hES細胞提供自我更新微環境。因此，通過本蛋白組學方法觀察到的許多蛋白質顯然可 以成為可與VN:GF-hES培養基相結合的候選因素，用于消除hES細胞對與MEF細胞共培養 的需求。如果這些生長因子被證明可用于增殖hES細胞，它們相應的受體必然也被表達。 本發明對CM的蛋白組學分析發現了一些生長因子受體，包括成纖維細胞生長因子受體 (FGFR)和胰島素受體(IR)，它們均與hES細胞生長相關[50，39]。不過，本研究還發現生長 因子受體-結合蛋白14(Grbl4)，已經證明其抑制FGF[51，52]和胰島素[53-55]受體的活 性。因此，Grbl4在hES細胞中表達可調節由FGF和胰島素受體觸發的重要信號途徑的失 活并間接調節hES細胞的自我更新。在無飼養細胞的系統中鑒定到支持細胞生長的各個蛋白質的同時，顯然許多這些 候選物參與了復雜的途徑和信號事件。例如，MEF CM中所見的Wnt2b和分泌型卷曲相關蛋 白2已知在Wnt/β-連環蛋白信號中發揮作用，該信號對于hES細胞自我更新具有重要作 用[56]。Wnt2b似乎可以通過穩定β-連環蛋白而引發這一功能，由此通過抑制限制Wnt信 號途徑的分泌型卷曲相關蛋白1而活化Tcf/LEF靶基因[57]和分泌型卷曲相關蛋白2的 轉錄[58]。此外，在MEF:hES細胞CM中發現的酪蛋白激酶1(亞型α)已經被證實可增強 β-連環蛋白的穩定化并增強誘導Wnt信號的靶基因[59]。酪蛋白激酶I (亞型α)也被報 道可結合并增強蓬亂蛋白(dishevelled)的磷酸化[60]，已知蓬亂蛋白是Wnt途徑的成分 并存在于MEF:hES細胞CM中。在MEF CM中鑒定到的轉錄因子TBX20也被證實正調節Wnt 途徑[61]。顯然，在這一途徑中存在復合物相互作用；不過將來的研究和分析可發現Wnt/ β -連環蛋白信號活化過程中可能驅動hES細胞自我更新的成分。此外，腫瘤排斥抗原I(Tral)同系物和卵泡抑素相關蛋白1在CM(表1，2)中均被 鑒定到，它們在調節人端粒酶反轉錄酶(hTERT)中具有作用，因此與hES細胞的自我更新有 關[62]。Tral同系物和myc-結合蛋白2在MEF:hES細胞CM中被鑒定到，已經報道它們可 通過調節c-myC而活化hTERT[63]。有趣的是，卵泡抑素相關蛋白1已經被證明可滅活激 活素-A [64]和TGF-β，后兩種蛋白質被證明可抑制hTERT [65]。反過來，激活素/TGF-β / 節分支(nodal branch)被證實可誘導hES細胞自我更新[16]。因此以上研究提示盡管TGF-β抑制hTERT，且因此誘導分化，但其也可與激活素一起作用促進hES細胞的全能性， 這表明調控途徑中存在的復雜性。對胚胎干(ES)細胞自我更新十分重要的另一途徑是信號轉導和轉錄3活化 (STAT3)途徑[66]。本研究已經在CM中發現了已知參與調控STAT3的兩種蛋白質即 E3SUM0(抑制)和EGF(活化)。E3 Sumo似乎可通過阻斷STAT3的DNA結合活性而抑制 STAT3途徑的調節[67]，而EGF似乎在小鼠肝細胞中誘導STAT3的酪氨酸磷酸化和核轉移 [68]。其他一些研究發現加入細胞因子例如白細胞介素(IL)-6可在小鼠ES細胞中活化 gpl30受體并誘導STAT3磷酸化[69]。不過，IL-6未能在hES細胞中引發相同的應答[70]。 不過，發現一些細胞因子例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-8、IL-13被分泌到MEF和MEF: hES細胞 CM中。因此，有理由預期一或多種這些細胞因子可結合gpl30受體并觸發STAT3途徑，由此 支持hES細胞的自我更新。總之，本初步研究首次清楚地揭示了對hES細胞體外微環境的有趣的認識。已經 證明新的技術不僅可鑒定分離的MEF細胞可分泌什么，還可鑒定它們應答于與hES細胞的 相互作用中出現的旁分泌相互作用而分泌什么。本研究揭示的一些候選蛋白質對分化、增 殖和細胞生長具有作用。因此，將來的研究將致力于在hES細胞培養系統中證實這些候選 蛋白質的存在以及評價其體外生物學活性。本研究可能是邁向完全了解hES細胞體外微環 境的第一步，并有可能首次為hES細胞產生完全定義的、合成的培養系統。這一進展開啟了 通往移植用治療性活組織源的大道。實施例2 蛋白組學分析體外培養的角化細胞條件培養基本研究的目的在于對角化細胞體外微環境進行全面檢查。具體而言，采用蛋白組 學方法鑒定由飼養細胞產生的角化細胞生長所需的主要因子。此外，使用上述無血清培 養基，該培養基被完全定義并具有極低的蛋白含量。該無血清培養基的極低蛋白含量的 顯著優勢在于其不會“掩蓋”飼養細胞所分泌的那些能夠支持角化細胞生長的主要因子。 此外，含血清培養基在進行蛋白組學分析之前通常需要前期處理步驟，例如“Multiple Affinity RemovalSystem “ (MARS) (Agilent Technologies)。該 MARS 免疫耗竭技術涉及 去除含血清培養基中的高豐度蛋白質，這可能會導致丟失一些對原代角化細胞自我更新十 分重要的候選因子。類似地，不需要在無血清基礎培養基上生長細胞(該方法被常規納入 “條件”培養基的集合中)，而是自培養細胞的“生長”培養基中收集待分析的培養基；因此 細胞是活躍生長的，而非處于營養饑餓和應激狀態。總之，這些特征為鑒定由體外角化細胞 培養微環境所產生的重要因子提供了理想的獨特的平臺。方法分離原代角化細胞原代角化細胞分離自從巨乳縮小手術和腹壁成形術中獲得的中厚皮膚活檢物， 如Goberdhan等所述(1993)。簡言之，該方法涉及將皮膚活檢物切成0. 5cm2的片狀，隨 后是一系列抗生素洗滌步驟。將皮膚與0. 125%胰蛋白酶(Invitrogen，Mulgrave, VIC, Australia)在4°C溫育過夜。然后表皮與真皮層分離并分離到角化細胞。將角化細胞懸浮 于 DMEM(Invitrogen)，過濾(IOOym)和離心。VN: GF-Kc 培養物新鮮分離的角化細胞先培養于75cm2培養瓶中，密度為2xl06細胞，然后以每個75cm2培養瓶中2xl05個細胞的密度接種用于傳代。接種角化細胞之前，先預接種Y _照射 的(25Gy，兩劑)(Australian Red Cross BloodService, Brisbane, QLD, Australia)小鼠 i3T3細胞飼養層(2xl06細胞)4小時。接種后使飼養層血清饑餓3小時。角化細胞在VN:GF 培養基中增殖，該培養基含有無酚紅DMEM/HAMS培養基(Invitrogen) ；0. 4 μ g/mL氫化可 的松；0. InM霍亂毒素；1. 8χ10_4Μ腺嘌呤；2x 10_7M三碘-I-甲狀腺素；5 μ g/mL轉鐵蛋白； 2xlO_3M 谷氨酰胺(Invitrogen) ； 1000IU/mL 青霉素/1000 μ g/mL 鏈霉素(Invitrogen)； 0. 6μ g/mL VN(Promega, Annandale, NSW, Australia) ；0. 6 μ g/mL IGFBP-3 (N109D 重組突 變體)(Auspep, Parkville, VIC, Australia) ；0. 2 μ g/mL IGF-I (GroPep, Adelaide, SA, Australia)；和 0. 2 μ g/mLEGF(Invitrogen) (VN:GF_Kc)。角化細胞培養物在 37°C，5%二氧 化碳溫育，隔日更換VN:GF-Kc培養基。利用形態學和標記物表達來確保本實驗所使用的角 化細胞在表現上類似于在有血清條件下培養的細胞。簡言之，這涉及以針對角蛋白6(未分 化角化細胞表達的一種標記物)的抗體檢測培養物。二維蛋白組學采用如實施例1所述的方法，通過二維液相層析分級條件培養基樣品，使用 BioLogic Duo-flow 高效液相層析(HPLC) (Bio-rad,Hercules,California,USA)進行第一 維分離，而使用Beckman Coulter's ProteomeLab PF 2D平臺的第二階段進行第二維分罔。樣品制備和使用LC/ESI/MS和LC-MALDI分析的LC/MS采用如實施例1所述的方法，采用兩種LC/MS方法，即LC/ESI/MS和LC-MALDI鑒 定飼養細胞和飼養細胞角化細胞條件培養基樣品中存在的蛋白質。樣品制備和MALDI-T0F-T0F質譜采用如實施例1所述的方法，將蛋白質峰轉移至質譜板用于T0F-T0F分析。數據庫分析和解析使用自MS和MS/MS數據庫分析獲得的蛋白質評分、蛋白質評分可信限、總離子評 分(TIS)和總離子評分可信限，根據潛在匹配列表來分級蛋白質。結果使用VN:GF-Kc培養基增殖的第二代角化細胞上出現的形態學和細胞表面標記物 表達進行蛋白組學分析。利用形態學和標記物表達來確保待分析的條件培養基是收集自未分化原代角化 細胞。目前還沒有確定的分析法能夠確定培養的原代角化細胞是否保持未分化狀態。不 過，可使用角蛋白標記物來提供與細胞增殖狀態以及細胞是否是基底角化細胞有關的有用 信息。因此使用識別角蛋白6(存在于高度增殖的角化細胞)、角蛋白14(存在于基底細胞) 和角蛋白1/10/11(存在于更加分化的細胞，見上文-基底細胞，數據未顯示)的抗體來評 價培養的細胞的分化狀態，用于蛋白組學研究。該分析發現，使用VN:GF-Kc培養基增殖的 細胞與使用血清生長的細胞相比維持正常的形態學(分別為圖6B和A)。此外，在VN:GF-Kc 培養基中培養的角化細胞持續表達角蛋白6和14(分別為圖6C和D)，因此提示這些細胞保 持其未分化原代角化細胞形態學。收集自單獨的飼養細胞培養物和飼養細胞角化細胞培養物的條件培養基的二維 分離
采用新形式的二維液相層析分離法分離來自單獨飼養細胞的條件培養基和來自 飼養細胞角化細胞共培養物的條件培養基中存在的蛋白質(分別為圖7A和B)。這包括在 第一維通過鹽梯度分離蛋白質，隨后使用乙腈梯度進行第二維分離。因該平臺的第一維分 辨率低，因此標準的 BeckmanCoulter ProteomeLab 的第一維被 Bio-rad，s Duo-flow HPLC 替代。使用ProteoView軟件顯示蛋白質。顯然，在飼養細胞角化細胞培養條件培養基中 表達的不同蛋白質點的數目較多(圖7B)，高于單獨飼養細胞的條件培養基。此外，單獨飼 養細胞的條件培養基(圖7A)與來自飼養細胞角化細胞培養物的條件培養基(數據未顯 示)在表達水平之間似乎存在可察覺的改變。隨后，分離、消化并使用MALDI T0F-T0F分析 了圖7A所示的187種蛋白質和圖7B所示的238種蛋白質。在飼養細胞和飼養細胞角化細胞條件培養基中鑒定的蛋白質首先，對蛋白質點進行MALDI-T0F-T0F分析，但沒有發現單獨飼養細胞或飼養細 胞角化細胞條件培養基(CM)具有顯著的離子評分。隨后，使用兩種液相層析方法分析CM 第一種使用QTRAP MS/MS系統(LC/ESI/MS)(在來自第一維分離的級份上進行)，而第二種 使用LC-MALDI (在濃縮CM樣品上進行)(表3和4)。然后使用Mascot數據庫分析條件培 養基中的蛋白質。LC/ESI/MS和LC-MALDI結果被歸納為7個主要的組細胞外基質(ECM)、 膜、核、分泌型、來自血清的和雜蛋白質/因子。此外，采用登錄號、分子量、總評分和肽計數 來分離蛋白質。通過離子評分確定，表3和4中所鑒定的所有蛋白質是已鑒定的或表現出 廣泛的同源性。單獨飼養細胞的結果過揭示12種ECM蛋白質、2種生長因子、17種雜蛋白 質、14種膜蛋白質、10種核蛋白、5種分泌型蛋白質和3種來自血清的蛋白質(表3)。飼養 細胞角化細胞結果過揭示3種細胞漿蛋白質、22種ECM蛋白質、30種雜蛋白質、21種膜蛋 白質、19種核蛋白、9種分泌型蛋白質和4種來自血清的蛋白質。通過分級歸納LCMS結果， 其與總離子評分相關(表4)。飼養細胞和飼養細胞hES/角化細胞條件培養基中發現的蛋白質表達差異在獲自單獨飼養細胞或飼養細胞角化細胞條件培養基(CM)的液體級份上使用 LC-ESI、LC-MALDI和MALDI-T0F-T0F分析鑒定的蛋白質。使用Mascot數據庫分析這些處 理中存在的蛋白質。然后將潛在的候選物和感興趣的蛋白質按其相應的類別分類，包括細 胞外基質、生長因子和細胞因子、分泌型和細胞內蛋白質。兩種處理組的蛋白質之間存在重 疊，包括膠原蛋白I、IV和VII ；纖連蛋白I ；層粘連蛋白V ;TGFa和β ；VEGF ；白細胞介素 1、10和15 ；端粒酶-結合蛋白ESTlA JfTral同系物。不過，在單獨飼養細胞處理組中也 發現了獨特的蛋白質，包括Wnt-2b、Wnt-12、膠原蛋白V和VI ；骨形態發生蛋白1 (BMP 1)； bFGF ；人生長激素(HGH) ；FGF 3 ；胰島素；IGF-I和-II ；白細胞介素_8 ；白血病抑制因子和 巨核細胞-CSF.此外，在飼養細胞角化細胞處理組中也發現了獨特的蛋白質，包括纖連 蛋白III ；層粘連蛋白I和III ；神經生長因子(NGF)；肝細胞生長因子(hgf)、PC細胞-衍 生的生長因子；血小板-衍生的生長因子β (PDGF)；白細胞介素4和6 ;PDGF-誘導型JE糖 蛋白；卵泡抑素相關蛋白5 ；生長抑制因子；生長分化因子9和端粒酶反轉錄酶(表5)。討論治療產業正在研發許多涉及原代角化細胞的新技術以幫助皮膚再生和愈合皮膚 損傷[75，76]。不過，離體增殖這些細胞所采用的技術仍需要不確定的成分，例如血清和/ 或飼養細胞，且通常使用無法清楚定義的培養系統。盡管可支持分離、建立和連續增殖未分化角化細胞的完全定義的無血清技術(VN:GF-Kc)是一大進步，但該培養方法仍需要使用 經照射的i3T3飼養層以便成功地連續增殖和體外擴增。已經證實，照射的i3T3飼養細胞分泌大量IGF和ECM蛋白[77]，以及大量其他蛋 白質。不僅如此，還證實角化細胞也表達的受體s for many許多生長因子和ECM蛋白的受 體[78-83]。確實，其他實驗室研究了使用這些蛋白質來培養角化細胞。例如，Dawson等 (1996)證實角化細胞可應答于VN包被的表面而粘附并增殖[84]。不過，最有效的角化細 胞培養系統仍需要使用飼養細胞層[85]。對飼養細胞層的需求說明飼養細胞在培養系統中 的重要性。最近，其他小組證實，當培養系統中補充了獲自MEF的條件培養基時，其他細胞 類型，例如人胚胎干細胞，可利用ECM蛋白進行無血清增殖，這提示飼養細胞所提供的重要 成分是飼養層分泌的可溶性因子[18]。因此，本發明人假設可采用蛋白組學技術來鑒定條件培養基中的新蛋白質，且有 可能將這些蛋白質與VN:GF-Kc培養基相結合，用于支持角化細胞的無血清且無飼養細胞 增殖。此外，鑒于VN:GF-Kc培養基不含血清或高豐度蛋白質例如白蛋白，即它是一種低蛋 白含量的培養基，因此其提供了用于鑒定對角化細胞的存活具有重要作用的關鍵因子的獨 特平臺。而通常加入至含血清或高蛋白質含量培養基中的高豐度蛋白質常常會掩蓋這些因 子。目前，這一領域和相關領域中進行的絕大多數蛋白組學分析是在單獨的飼養細胞 層上進行的[24，25，86]，用于揭示成纖維細胞向培養基中分泌了什么。不過，本研究通過建 立如下系統而使得這一研究更進了一步，在該系統中可以分析由飼養細胞與角化細胞的旁 分泌相互作用而觸發的分泌。為了檢驗這一假設，檢查了單獨飼養細胞和飼養細胞角化細 胞培養物向培養基中分泌了什么。對這兩種處理組的研究有助于對不僅應答于自分泌相互 作用，而且也應答于旁分泌相互作用而分泌的因子獲得更加全面的了解，并更加了解角化 細胞的最佳體外微環境。盡管本發明所使用的系統采用的是無血清VN:GF-Kc培養基，但在單獨飼養細胞 和飼養細胞角化細胞處理組中鑒定到了一些血清來源的蛋白質；即，牛血清白蛋白、胎球 蛋白和轉鐵蛋白家族成員。這些蛋白質均是通常添加至培養基中用于增殖飼養細胞和角化 細胞的血清和補充物中的常見組分。在本分析中出現這些蛋白質提示，盡管本蛋白組學研 究使用的是VN:GF-Kc無血清培養基，但原始擴增成纖維細胞時盡管進行了充分洗滌和血 清饑餓步驟，但仍有一些產物被攜帶進來。此外，這些數據提示來源于血清的蛋白質是由分 離角化細胞過程中由供者的皮膚攜帶進來的，因為角化細胞本身完全是在無血清條件下分 離和培養的。此外，在本研究的兩個處理組中均觀察到一些細胞內蛋白。存在這些蛋白質 很可能是細胞裂解將其細胞內成分泄漏至培養系統而導致的。盡管這些細胞內蛋白不是本 研究的首要焦點，但所鑒定的一些蛋白質值得進一步研究，例如端粒酶反轉錄酶、端粒酶結 合蛋白、c-myc和Tral。也要注意到，從表3和4省卻了一些蛋白質，因為無法對它們加以 鑒定，即，假定的蛋白質、未知蛋白質和功能未知蛋白質。分析單獨飼養細胞條件培養基(圖7A和表3)和飼養細胞角化細胞培養條件培 養基(圖7B和表4)揭示了一些對原代角化細胞的存活具有重要作用的蛋白質。鑒定了一 些ECM蛋白，包括；膠原蛋白I、V、VI和VII、纖連蛋白1和3、Lamb3、層粘連蛋白α 1、3、5 和腱糖蛋白X (表3和4)。重要的是，這些ECM蛋白在體內存在于表皮和真皮的細胞外基質[87]。此外，這些蛋白質通常參與角化細胞的粘附、遷移和/或增殖，且也認為它們對傷口 愈合具有作用[88-91]。參與建立hES細胞無血清和無飼養細胞培養方法的研究小組最近開始嘗試在其 培養系統中使用ECM蛋白，例如前面提到的那些。例如，當在存在小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF)條件培養基的情況下生長[18]或具有剔除血清替換(KSR) +激活素-A的條件下生長 [21]時，層粘連蛋白可替代對飼養細胞層的需求。不僅如此，Amit等(2006)發現了使用纖 連蛋白基質與多種生長因子相結合而增殖這些細胞的方法，這些生長因子包括轉化生長因 子β 1 (TGF β 1)、白血病抑制因子(LIF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) [20]。由于原 代角化細胞培養類似于hES細胞培養，這些基于ECM蛋白的技術有可能會被轉變為培養角 化細胞。有趣的是，目前為增殖角化細胞和hES細胞而建立的所有ECM技術也包括使用某 些形式的促細胞分裂原。在此所報告的結果證實條件培養基中存在一些生長因子和促細胞分裂原，包括 IGF-I, IGF-II、胰島素、轉化生長因子(TGF) α和β、血小板-衍生的生長因子(PDGF)和 bFGF，所有這些均存在于這兩個處理組的條件培養基中(表3和4)。胰島素是許多哺乳動物 細胞培養基的重要成分，且也已經添加至角化細胞培養物中。通常，胰島素以高濃度存在于 這些角化細胞培養基中，不過，我們近來證實低濃度的IGF-I可替代對胰島素的需求[26， 41]。確實，已經報道，當存在高濃度的胰島素時，其生長刺激作用實際上是由IGF-I受體 介導的[92]，因此能夠以IGF-I替代胰島素并不意外。類似地，我們小組的早期研究發現， 當IGF-I和IGF-II與VN結合使用時，導致在hES細胞中產生促細胞分裂效應。不僅如此， bFGF,TGF-β和PDGF是肝素結合生長因子，已經證實它們增強飼養細胞依賴型hES細胞的 增殖和自我更新[16，23，44，45]。此外，已經證實TGF蛋白可增強上皮和角化細胞的遷移 (Li等2006)和增殖[93，94]，因此認為其可有效介導傷口愈合事件[95]。有趣的是，這些 肝素結合生長因子似乎能夠通過其肝素結合結構域結合VN[26，42]。因此，本蛋白組學分析 中鑒定的生長因子均具有與角化細胞生長有關的作用，因此可與VN:GF-Kc培養基相結合， 以便為體外擴增用于臨床治療目的的可移植細胞提供無血清無飼養細胞的培養基。此外，還鑒定了飼養細胞CM中存在的Wnt-12和人生長激素和飼養細胞角化細胞 CM中存在的生長分化因子_9 (⑶F-9)和PC-衍生的生長因子(PC-DGF)(表5)。目前還不 太清楚這些蛋白質對hES細胞的生長和存活的影響。不過，Wnt途徑和某些Wnt蛋白證明 可以維持hES細胞處于自我更新狀態[56]。人生長激素也可通過活化JAK/STAT途徑而在 hES細胞自我更新中發揮重要作用[66，72]。此外，發現PC衍生的生長因子在胚胎發育過 程中廣泛表達，并證實其在細胞例如3T3成纖維細胞的增殖中發揮作用[71]。此外，GDF-9 被證實能夠活化SMAD-2/3信號[73]，后者對于維持hES細胞的未分化狀態具有重要作用 [74]。這些因子因此對那些培養方式類似于hES細胞的其他細胞，即原代角化細胞，可能具 有重要作用。除了以上討論的蛋白質，端粒酶反轉錄酶(TERT)端粒酶-結合蛋白(ESTlA)JP 泡抑素樣5和腫瘤排斥抗原1 (Tral)同系物，也表達于這兩個處理組的條件培養基中(表 3和4)。端粒酶-結合蛋白通過人端粒酶反轉錄酶參與體外端粒復制。有趣的是，hTERT 或端粒酶表達的下調與胚胎干細胞分化有關[62]。因此，如果在角化細胞培養物中該蛋白 能被直接或間接誘導，可能會促進原代角化細胞的長期增殖。另一感興趣的核蛋白是Tral同系物，其在c-Myc轉錄活化中具有關鍵作用，也參與細胞轉化。此外，c-Myc已經證實對 hTERT的活化和調節具有重要作用[63]。分泌型蛋白質卵泡抑素樣5也存在于所檢測的條 件培養基中。值得注意的是，該蛋白中存在的卵泡抑素樣結構域被認為參與滅活激活素-A 和TGF-β [96，97]，這兩種蛋白質被證實對人胚胎干細胞自我更新具有重要作用[16]。總 之，這些數據提示這些蛋白質在維持其他原代細胞例如原代角化細胞的未分化狀態中也可 能具有重要作用。總之，本蛋白組學研究揭示了來自單獨飼養細胞和飼養細胞角化細胞培養處理 組的多種蛋白質的表達。鑒于皮膚成纖維細胞和角化細胞之間存在旁分泌關系[98，99]，本 研究不僅鑒定了分離的飼養細胞在分泌什么，也鑒定了飼養細胞與角化細胞因它們之間的 旁分泌相互作用而分泌什么。理想地，如果同時檢查單獨角化細胞的條件培養基以確定當 它們在無飼養細胞情況下培養時分泌什么或許會有極大的收獲。不過，本研究一個關鍵問 題在于，角化細胞在缺乏飼養細胞層時生長很差。前述數據已經提供了關于原代角化細胞 體外微環境的有趣的初步認識，并對有可能與無血清培養基相結合使用的那些候選蛋白質 提供了有用的初始信息。實施例3 :hES細胞在無飼養細胞和血清條件下的生長在以下培養基配方中生長并測試hES細胞lug/mL IGF_I/1_64VN嵌合蛋白， 0. lug/mL bFGF，35ng/mL 激活素-A 和 40 μ g/mL 層粘連蛋白。使用針對0ct4、TRA1-60、SSEA-4、SSEA-I抗原的抗體進行免疫熒光(IF)。IF研 究(圖8)證實了 0ct4、TRA1-60和SSEA-4表達，但SSEA-I僅低表達。hES細胞也表現出 大核質比，代表hES表型。Rexl異常，這一結果證實在我們的培養系統中大幅下調。不過，當檢查0ct4和 Nanog時，在我們的培養系統中這些擴增子表現出表達幾乎升高了 2倍(圖9)。這些數據放在一起提示所述系統確實可維持這些細胞處于“未分化狀態”。整個說明書的目的在于描述本發明的優選的實施方式，而無意于將本發明限制在 任一實施方式或具體的特征集合中。因此本領域人員可以理解，鑒于所公開的內容，可以對 這些示例性的具體實施方式
做出各種修改和變化而不脫離本發明的范圍。通過引用將在此提及的所有計算機程序、算法、專利和科技文獻并入本申請。參考文獻1. Thomson, J. Α. , J. Itskovitz-Eldor, S. S. Shapiro, Μ. A. Wakni tz , J. J. Swiergiel, V. S. Marshall, and J.M.Jones· (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282 :1145—7.2. Reubinoff，B. E.，Μ. F. Pera, C. Y. Fong, A. Trounson, and A. Bongso. (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts somatic differentiation in vitro. NatureBiotechnology 18 :399_404.3. Levy, Y. S. , M. Stroomza, E. Me lamed, and D. Offen. (2004). Embryonic and adult stemcells as a source for cell therapy in Parkinson ' s disease. JMol Neuroscience 24 :353_86.4. Tutter, A. V. , G. A. Baltus, and S. Kadam. (2006). Embryonic stem cells :a great hope fora new era of medicine. Current Opinion Drug Discovery Development
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養基中鑒定的蛋白質
權利要求
細胞培養基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰島素樣生長因子(IGF)氨基酸序列和玻連蛋白(VN)氨基酸序列；(ii)選自以下一組中的一或多種分離的飼養細胞替代因子人生長激素(hGH)、骨形態發生蛋白15(BMP 15)、生長分化因子9(GDF 9)、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白2、Wnt 2b、Wnt 12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子 α(TGF α)、TGF β、神經生長因子、血小板衍生的生長因子 β(PDGF β)、PC 衍生的生長因子(progranulin)、白細胞介素(IL) 1、IL 2、IL 4、IL 6、IL 8、IL 10、IL 13和激活素 A；和(iii)不含血清或含有明顯減少量的血清，所述明顯減少量的血清在缺乏IGF時不能支持細胞的生長。
2.權利要求1的細胞培養基，其中所述一或多種分離的飼養細胞替代因子選自以下一 組hGH、BMP-15,⑶P-9、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白2、Wnt_2b、Wnt_12、 生長抑制因子和激活素-A。
3.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述一或多種分離的飼養細胞替代因子 是激活素-A。
4.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述細胞培養基還包含選自以下一組的 一或多種額外的生物學活性蛋白堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、 IGF-I、IGF-II和層粘連蛋白。
5.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述一或多種額外的生物學活性蛋白選 自bFGF和層粘連蛋白。
6.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序 列或IGF-II氨基酸序列。
7.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。
8.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述VN氨基酸序列是成熟VN的1至64位氨基酸殘基。
9.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述合成嵌合蛋白還包含一或多個甘氨 酸殘基和一或多個絲氨酸殘基的接頭序列。
10.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述接頭序列為(Gly4Ser)4t5
11.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其還包含分離的含IGF的復合物，其中IGF 選自 IGF-I 和 IGF-II。
12.前述權利要求中任一項的細胞培養基，當IGF-II存在于所述分離的含IGF的復合 物中時，所述培養基還包含VN。
13.前述權利要求中任一項的細胞培養基，當IGF-I存在于所述分離的含IGF的復合物 中時，所述培養基還包含IGFBP和VN。
14.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述IGFBP選自以下一組IGFBP-1、 IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 和 IGFBP-6。
15.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述IGFBP是IGFBP-3或IGFBP-5。
16.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述或每一飼養細胞替代因子的終濃 度在 0. lng/ml 和 50 μ g/ml 之間。
17.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述或每一飼養細胞替代因子的終濃 度在大約5ng/ml和1500ng/ml之間。
18.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述或每一飼養細胞替代因子的終濃 度在 25ng/ml 和 1000ng/ml 之間。
19.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述或每一飼養細胞替代因子的終濃 度在 150ng/ml 和 600ng/ml 之間。
20.胚胎干細胞培養基，還包含大約250ng/ml和lOOOng/ml之間的包含IGF氨基酸序 列和VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約50ng/ml和lOOng/ml之間的bFGF，大約25ng/ml 和50ng/ml之間的激活素-A和大約10 μ g/ml和50 μ g/ml之間的層粘連蛋白。
21.權利要求20的胚胎干細胞培養基，其包含大約lOOOng/ml的所述包含IGF氨基酸 序列和VN氨基酸序列的合成嵌合蛋白，大約lOOng/ml的bFGF，大約35ng/ml激活素-A和 大約40 μ g/ml的層粘連蛋白。
22.權利要求20或21中任一項的胚胎干細胞培養基，其中所述IGF氨基酸序列是 IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。
23.權利要求20至22中任一項的胚胎干細胞培養基，其中所述IGF氨基酸序列是 IGF-I氨基酸序列。
24.權利要求20至23中任一項的胚胎干細胞培養基，其中所述VN氨基酸序列是成熟 VN的1至64位氨基酸殘基。
25.細胞培養系統，包含培養容器和權利要求1至19中任一項的細胞培養基或權利要 求20至24中任一項的胚胎干細胞培養基。
26.細胞培養方法，其包含在權利要求1至19中任一項的細胞培養基、權利要求20至 24中任一項的胚胎干細胞培養基或權利要求25的培養系統中培養一或多種細胞的步驟。
27.權利要求26的方法，其中所述一或多種細胞是飼養細胞依賴型細胞類型。
28.權利要求26至27中任一項的方法，其中所述一或多種細胞是人胚胎干細胞。
29.權利要求26至27中任一項的方法，其中所述一或多種細胞是角化細胞。
30.藥物組合物，其包含根據權利要求26至29中任一項的方法產生的一或多種細胞， 以及藥用可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
31.藥物組合物，其包含選自角化細胞、人胚胎干細胞和角化細胞前體細胞的一或多種 細胞。
32.權利要求30至31中任一項的藥物組合物，其中所述一或多種細胞是人胚胎干細胞。
33.權利要求30至32中任一項的藥物組合物，其中所述一或多種細胞是角化細胞。
34.輸送根據權利要求26至29中任一項的方法培養的一或多種細胞的方法，包括將權 利要求30至33中任一項的藥物組合物輸送至個體，以便促進所述個體中的一或多種細胞再生和/或增殖。
全文摘要
本發明提供細胞培養基和系統，其消除或至少降低對飼養細胞的需求。所述細胞培養基包含通常由飼養細胞分泌和/或產生的一或多種因子和包含IGF-I和一部分玻連蛋白的合成嵌合蛋白。所述細胞培養基特別適合用于增殖人胚胎干細胞和角化細胞。本發明還涉及利用培養于本發明的細胞培養基中的細胞的組合物和方法。
文檔編號C12N5/0735GK101970642SQ200880114667
公開日2011年2月9日 申請日期2008年9月3日 優先權日2007年9月4日
發明者D·利弗斯利, D·哈金, L·B·科馬克, S·D·理查茲, Z·厄普頓 申請人:昆士蘭技術大學