嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應用。提供嗜水氣單胞菌適體以及所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法與應用。所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法的具體步驟包括：構建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設計合成相應的引物；取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進行結合；分離獲得與嗜水氣單胞菌結合的ssDNA，以該ssDNA為模板進行PCT擴增，擴增產物再次進行SELEX篩選直至獲得相應適體。本發明采用SELEX技術篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體可廣泛應用于嗜水氣單胞菌的檢測與分析。
【專利說明】嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應用【技術領域】
[0001]本發明涉及水產養殖中常見的致病病原菌一嗜水氣單胞菌，特別涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應用。
【背景技術】
[0002]嗜水氣單胞菌(Aerotnoims hydrophila)在自然界分布廣泛，是多種水生動物的原發性致病菌，可產生多種致病因子，對水產動物，畜禽和人類均有致病性，可引起多種動物的敗血癥和人類腹瀉，給人類健康帶來了威脅，同時也給養殖業造成較大的經濟損失(1.張翠娟，于宙亮，趙寶華，何宏軒.嗜水氣單胞菌研究進展[J].中國獸醫雜志，2008，42(7):46-50.)。因此，對于作為水源污染指示菌的嗜水氣單胞菌污染，其檢測力度仍需進一步加強。目前嗜水氣單胞菌的檢測一直是個棘手的問題，傳統的化學病理檢測過程繁瑣，耗費時間；酶聯免疫、多重PCR技術則成本過高(2.王利.魚類嗜水氣單胞菌的幾種檢測方法[J].內陸水產，2006，(2):22-23.)。因此，開發一種操作簡便，成本低廉，快速方便的嗜水氣單胞菌檢測方法，成為本領域技術人員迫切需要解決的技術難題。
[0003]SELEX ( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)即指數富集配體系統進化技術，是1990年由美國的Tuerk和Gold創建的一種體外合成篩選寡核苷酸適體的化學組合技術(3.孟慶玲，陳創夫.SELEX技術及其應用前景[J].塔里木大學學報，2008，20 (3):44-48.4.廖世奇，劉巍，王黎.SELEX技術應用研究進展[J].甘肅醫藥，2009，(02):96-97.)。由于適體具有特異性高、庫容量大、合成時間短(5.王聰艷，孫偉，李建國，等.SELEX技術應用研究進展[J].生物技術通報，2006，(SI):232-236.)等優點，SELEX技術現在廣泛應用在疾病防控、藥物篩選、臨床診斷等不同的【技術領域】，隨著技術的不斷創新與發展，逐漸產生了一些新的SELEX篩選方法，如導向SELEX技術、復合靶分子SELEX技術、基因組SELEX技術等新的研究手段(6.孟慶玲，陳創夫.SELEX技術及其應用前景[J].塔里木大學學報，2008，20 (3):44-48.)。
【發明內容】
[0004]本發明的第一目的在于提供嗜水氣單胞菌適體。
[0005]本發明的第二目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法。
[0006]本發明的第三目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體在檢測述嗜水氣單胞菌中的應用。
[0007]所述嗜水氣單胞菌適體的核酸序列如序列表中1-22號中的序列所示。
[0008]所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法是將指數富集配體系統進化技術(即SELEX篩選)應用于嗜水氣單胞菌適體的篩選，所述SELEX篩選的具體步驟包括:
1）構建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設計合成相應的引物；
2)取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進行結合；
3)分離獲得與嗜水氣單胞菌結合的ssDNA，以該ssDNA為模板進行PCT擴增，擴增產物再次進行SELEX篩選直至獲得相應適體。
[0009]在步驟I)中，所述 ssDNA 文庫可為::5 ' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTCAA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3'。
[0010]所述引物可為:
引物 1:5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物 II:5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'；
引物III:5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物IV:5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。
[0011]在步驟3)中，所述SELEX篩選共進行12輪。
[0012]本發明采用SELEX技術篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體為嗜水氣單胞菌的快速檢測技術的開發以及在水產病害控制方面的應用提供參考，可廣泛應用于嗜水氣單胞菌的檢測與分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為PCR產物3%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖1中，M為50bp DNA marker, 1、3、
5、7、9、11、12 分別表示第 1、3、5、7、9、11、12 輪的 PCR 產物。
[0014]圖2為適體與嗜水氣單 胞菌結合的吸光度。在圖2中，橫坐標為篩選輪數，縱坐標為A450nm時的吸光度。
[0015]圖3-圖5為本發明所篩選的核酸適體二級結構圖。圖3中的結構最小自由能為-7.60千卡/摩，圖4中的結構最小自由能為1.83千卡/摩，圖5中的結構最小自由能為-3.11千卡/摩。
【具體實施方式】
[0016]一、ssDNA文庫及引物的合成
參照文獻(7、劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應用[D].福州福建醫科大學，2007.)中公開的方法，用于SELEX篩選的隨機ssDNA文庫和引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0017]所用文庫為:5'-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCCCGG ATC-3'。
[0018]所用引物分別為:
引物 1:5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物 II:5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'；
引物III:5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物IV:5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。
[0019]上述引物在合成后用分子生物學中常用的TE緩沖液(pH8.0)稀釋至濃度為10 μ mol, -20°c保存備用。
[0020]二、實驗試劑及緩沖液制備
Dynabeads 鏈酶親和素磁珠 M-280 試劑盒、2 X Taq PCR MasterMix、50bp DNA LadderMarker、牛血清白蛋白(BSA)均購自廈門鷺隆生物技術有限公司，PCR膠回收純化試劑盒購自omega公司，抗地高辛堿性磷酸酶購自Roche公司，對硝基苯磷酸二鈉為Amresco公司產品。緩沖液參照參考文獻(劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應用[D].福州福建醫科大學，2007.)配制。
[0021]三、菌種:嗜水氣單胞菌ASl.1801購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。
[0022]四、SELEX篩選
取一定量隨機ssDNA文庫(首輪篩選用量為600pmol，隨后每輪減少用量)，加入600 μ L選擇緩沖液稀釋ssDNA，于95°C變性5min，冷卻lOmin。加入30 μ L的嗜水氣單胞菌菌懸液(菌的數量約為1.5Χ108個)，混勻置搖床室溫結合30min，15000r/min，4°C下離心lOmin。之后棄上清液，加入600 μ L選擇緩沖液重懸，如此重復洗滌3次，洗去未與嗜水氣單胞菌結合的ssDNA,結合了 ssDNA的嗜水氣單胞菌沉淀用100 μ L ddH20重懸,96°C加熱5min,離心后取上清為模板，用引物1、IV進行PCR擴增，獲得標記生物素的雙鏈DNA (dsDNA)，利用M-280磁珠通過生物素一鏈親和素之間的相互作用分離ssDNA，作為下一輪篩選的次級庫。依照上述方法，對次級庫再次進行SELEX篩選，先后進行12輪SELEX篩選。
[0023]五、各輪適體與嗜水氣單胞菌結合率的測定以及適體的序列測定與分析
將第1、3、5、7、9、11、12輪SELEX篩選的產物(即該輪的洗脫上清)，用引物III和引物IV進行PCR擴增，各輪均擴增320 μ L。PCR擴增體系為:2X Taq PCR MasterMix 10ul，上游引物(IOum)、下游引物(IOum)各0.4ul，模板lul，用去離子水補足到20ul。PCR反應條件為:95°C預變性 3min ;94°C變性 30s，58°C _70°C退火 30s，72°C延伸 20s，24 個循環；72°C延伸 3min。
[0024]將PCR擴增產物用膠 回收純化試劑盒進行純化，純化產物利用3%的瓊脂糖電泳檢測，可以看出電泳條帶越來越致密，同時彌散現象越來越少，條帶隨著篩選次數的增加越來越整齊且亮度有所增加。說明隨著篩選次數的增加，特異性適體得到了富集，其同源性可能比較高
純化后的PCR產物用鏈霉親和素磁珠將純化的dsDNA解鏈成ssDNA，此ssDNA即帶有地高辛標記，測定其含量。再按ssDNA:嗜水氣單胞菌=300pmol: 1.5 X IO8的比例，將兩者在500 μ L選擇緩沖液中結合30min，離心后加入100 μ L I: 15000稀釋的抗地高辛抗體標記的堿性磷酸酶反應IOmin,離心棄上清并用500 μ L選擇緩沖液懸浮嗜水氣單胞菌,重復洗滌3次，洗去未與嗜水氣單胞菌上ssDNA-地高辛結合的抗地高辛抗體標記的堿性磷酸酶，然后加入100 μ L對硝基苯磷酸鹽溶液顯色，顯色好后加入IOOyL 2mol/L NaOH終止反應，用酶標儀于405 nm測定吸光度值，實驗結果參見圖1。該親和力測定結果表明，隨著篩選輪數的增加，適體與菌液的親和力逐漸增大，在第九輪時達到最大，之后親和力變化不大、趨于平緩，說明適體達到了飽和。
[0025]再用引物I和引物II將第12輪的PCR產物大量擴增，純化后送于英駿生物技術有限公司克隆、克隆之后隨機取24個克隆子測序，獲得22條符合要求的適體序列。按照隨機序列堿基的數目分為A群、B群兩個群。A群(見表1)包括13條適體序列，與預期長度一致，B群(見表2)包含9條序列，均短于預期長度。測序結果見表1。用Macaw 2.05軟件包分析22個適體的同源序列，獲得4個保守序列=GTTTTX (見于Al-1、Al_8、Al-13、A1-17、Α1-20、Α1-21、Α1-26、Α1-30 號適體);GTGGGT (見于 A1-1、A1-7、A1-12、A1-15、A1-22、A1_29);GTTTX (見于 Α1-1、Α1-5、Α1-7、Α1-10、Α1-13、Α1-14、Α1-15、Α1-18、Α1-21、Α1-22、Α1-29)；XTTTT (見于Al-14、Al-26、A1-27)。有的適體中同一保守序列出現多次，如Al-18中三次
出現GTTTG ;有的適體中則出現多個保守序列，但沒有發現存在于所有適體中的保守序列ο
[0026]表1 A群嗜水氣單胞菌適體_
適體序歹瞭中的編號_核酸序歹Li_
表2 B群嗜水氣單胞菌適體
用DNAMAN軟件對所測得的22條序列進行二級結構分析，根據結構可將其分為三類:第一類:5'端的固定序列區堿基與:V端的第6個堿基起形成莖環結構，中間隨機區形成莖環結構，3'端的5個固定堿基形成一個小的口袋結構(圖3)。這種結構的適體有Α1-3、Α1-5、Α1-7、Α1-13、Α1-14、Α1-20、Α1-22 共七條；
第二類:5'端的第3個至21個堿基形成莖環結構，3'端固定序列區堿基與中間隨機區堿基形成莖環并凸起，然后再由5'端、3'端固定序列區堿基和中間隨機區形成一個口袋結構(圖 4)，這種結構的適體有 Al-1、Al-4、Al-12、Al-15、Al-17、Al-18、Al-21、A1-27、Α1-28、Α1-29、Α1-30、A1_31 共十二條；
第三類:5'端、3'端固定序列區部分堿基分別與隨機區形成莖環結構，然后由5'端、3'端固定序列區堿基和中間隨機區再形成一個大的口袋結構(圖5)。這種結構的適體有 Α1-8、Α1-10、Α1-26 三條。
[0027] 申請人:人工合成的ssDNA文庫全長78bp，中間35bp為隨機核苷酸，由于每個位點有A、G、C、T四種可能，這樣的話中間35個序列就有435個可能組合，即其庫容量達到了 IO16之多，雖然實際實驗中可能只到IO14左右，但這也滿足了篩選目的寡核苷酸的需要(8、李衛濱，蘭小鵬，楊湘越，等.SELEX技術在篩選環孢霉素A適體中的運用[J].福州總醫院學報，2007，(03):171-173)。在前兩輪篩選的過程中， 申請人:添加的文庫量比較多，這樣的目的是盡可能的獲得比較多的與嗜水氣單胞菌特異性結合的適體。但隨著篩選輪數的增加，次級文庫的量就要相應的減少，這是因為文庫的濃度越來越大的緣故。為了增加適體的特異性， 申請人:相應增加了洗脫次數，同時文庫與菌液結合的時間也相從前幾輪的30min減少到后來的20min。PCR條件的優化對適體的篩選也十分重要，每一輪篩選， 申請人:都要先做一個梯度PCR，在得到最適退火溫度的前提下再做PCR擴增，這樣有效的避免了非特異性擴增等問題。[0028] 申請人:實驗用的是鏈霉親和素磁珠來富集次級文庫，它操作簡單、不需要離心，只要在磁場的作用下即可達到分離的效果，同時它得到的次級文庫比較穩定，純度更高，不易出現不對稱PCR中的非特異性擴增的問題。通過12輪篩選、克隆測序得到的22條適體中，有13條適體與預期長度一直一致。
[0029]利用DNAMAN軟件對其二級結構分析,從結果中可以看出，這些序列的二級結構都是由莖環和口袋(勺狀)結構組成，這說明了莖環和口袋結構可能是適體與嗜水氣單胞菌結合的結構基礎，莖可能起著穩定結構的作用，環可能是其結合部位。有些二級結構中含有勺狀的口袋，這些口袋也可能起著同環一樣的作用，即可能是與受體結合的結合部位。在這些莖結構中，其堿基主要是G-C為主，由于G-C的結構能大于A-T，這一點也說明莖可能起著穩定作用。
[0030]本發明初步建立了 SELEX法篩選嗜水氣單胞菌適體的方法，同時獲得了具有特異性的嗜水氣單胞菌的適體，并對適體群的二級結構初步進行了研究，得到其二級結構的一些結構組成，這為以后研究嗜水氣單胞菌的分子結構打下了一定的基礎，同時也為嗜水氣單胞菌的檢測提供了一種新的方法。
【權利要求】
1.嗜水氣單胞菌適體，其特征在于，其序列如序列表中18號所示。
2.如權利要求1所述嗜水氣單胞菌適體在檢測嗜水氣單胞菌中的應用，所述應用為非疾病診斷目的的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468699SQ201310365220
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年1月5日 優先權日:2012年1月5日
【發明者】李元躍, 王雷, 段博文, 陳融斌, 黎中寶 申請人:集美大學