一種免提取直接擴增極微量樣品dna條形碼的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】發明公開了一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法及試劑盒。本發明通過加入裂解液和緩沖液且所加入的緩沖液與裂解液的體積比為0～9：1，得到極微量樣品的DNA溶液，采用正向引物LCO1490和反向引物HCO2198進行PCR擴增，即得到極微量樣品的DNA條形碼序列。本發明通過優化裂解液和緩沖液的配方及兩者的使用比例，同時優化了反應體系和反應條件，能夠避免將多頭極微小動物單個個體混合提取模板DNA，從而保證了DNA模板來源的單一性，本發明的方法穩定性好、擴增效率高，具有極大的可靠性和適應性。
【專利說明】—種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法及試劑
【技術領域】:
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法及試劑盒。
【背景技術】:
[0002]螨為重要的醫學媒介生物，傳播多種疾病，對人類的身體健康威脅很大。螨的個體非常微小，通常小于1mm，利用現有的DNA提取方法或者商業試劑盒很難得到濃度足夠高的模板DNA，后續的特定基因的PCR擴增很難進行，現在普遍的做法是將多個個體甚至幾十個個體混合在一起，提取基因組DNA，不能保證模板DNA來源的種類單一性，為后續的分子分析造成很大的麻煩，因此很有必要研制一種操作簡單的、高效的一種從螨等極微小動物單個個體免提取直接擴增DNA條形碼序列的方法及試劑盒。
[0003]DNA條形碼技術是近幾年新興的利用生物本身普遍具有的一段保守性適中、容易獲得的基因片段作為標準，建立在現代先進的DNA擴增、測序和比對技術基礎之上的一種物種鑒定手段。與傳統的形態鑒定相比，利用DNA條形碼進行物種鑒定具有以下優勢:對物種的鑒定將不再受物種發育狀態的限制，克服了卵、幼蟲、蛹等無法直接鑒定的缺點；對鑒定者的經驗和專業背景知識大大降低，減少主觀判斷的干擾；物種的鑒定更加準確快速，數據共享使構建生物全球分子鑒定平臺成為可能。DNA條形碼技術由于目前數據庫中有效數據嚴重不足，在實際中的應用往往不能達到準確種類鑒定的目的，因此DNA條形碼數據庫中的數據急需補充，DAN條形碼數據的建立，憑證標本即DNA數據的來源標本非常重要，以備以后數據和標本的查證，為了保證憑證標本的形態完整性，在取組織時，盡量減小組織塊的大小。
【發明內容】
:
[0004]本發明的目的是提供一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法及試劑盒。
[0005]本發明的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006](I )、DNA模板的制備:取一只極微小動物個體或動物個體部分組織，加入裂解液，研磨，95°C放置10min，4000rpm短暫離心5s，然后加入緩沖液，所加入的緩沖液與裂解液的體積比為O?9:1,95°C放置lOmin, 12000rpm離心lmin,棄沉淀,所得的上清液即為極微量樣品的DNA溶液；所述裂解液為10?IOOmM的NaOH溶液，所述緩沖液，其成分及制備方法為:1OOmM Tris, IM KCl，IOmM EDTA，調 pH 為 9.5，高壓滅菌。
[0007](2)、DNA條形碼序列的擴增:以步驟(I)的極微量樣品的DNA溶液為模板，采用正向引物 LCO1490 (5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，)和反向引物 HC02198 (5’_TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ )進行PCR擴增，即得到極微量樣品的DNA條形碼序列。[0008]所述的步驟(I)的動物個體部分組織，其重量優選為10 μ g。
[0009]所述步驟(2)的PCR擴增，其擴增反應體系優選為:2XK0D FX DNA聚合酶buffer(含 Mg2+) 25 μ l,2mM dNTP 10 μ 1，KOD FX DNA 聚合酶 I μ l,20mM 正向引物 LC01490 和 20mM反向引物HC02198各1μ 1，DNA模板2μ 1，加ddH20補足至50 μ I。
[0010]所述步驟(2)的PCR擴增，其擴增反應條件為:95°C 3min ；98°C 10s, 50°C 30s，68°C lmin, 35 個循環；68°C 7min。
[0011]所述的緩沖液與裂解液的體積比優選為1:9。
[0012]所述的極微量樣品，優選為螨、蚤、蜱的單個個體或蠅的部分組織。
[0013]本發明的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的試劑盒，包括裂解液、緩沖液、DNA 聚合酶 buffer (含 Mg2+)、正向引物 LC01490、反向引物 HC02198、dNTP、K0D FX DNA 聚合酶，其特征在于，所述的裂解液為10?IOOmM的NaOH溶液，所述的緩沖液其成分及制備方法為:IOOmM Tris, IM KCl，IOmM EDTA，調 pH 為 9.5，高壓滅菌。
[0014]所述的裂解液，優選為50mM的NaOH溶液。
[0015]本發明通過優化裂解液和緩沖液的配方及兩者的使用比例，同時優化了反應體系和反應條件，能夠避免將多頭極微小動物單個個體混合提取模板DNA，從而保證了 DNA模板來源的單一性，本發明的方法穩定性好、擴增效率高，具有極大的可靠性和適應性。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0016]圖1是使用不同濃度裂解液制備的DNA模板擴增DNA條形碼序列的結果，其中，泳道I為陰性對照，泳道2為180 μ IlOmM裂解液+20 μ I緩沖液，泳道3為180 μ 125mM裂解液+20 μ I緩沖液，泳道4為180 μ 150mM裂解液+20 μ I緩沖液，泳道5為180 μ 175mM裂解液+20 μ I緩沖液，泳道6為180 μ IlOOmM裂解液+20 μ I緩沖液，泳道M為Marker II (購自TIANGEN公司，目錄號:MD102)；
[0017]圖2是按照不同體積比混合緩沖液和裂解液制備DNA模板擴增DNA條形碼序列的結果，其中，泳道I為陰性對照，泳道2為20μ I裂解液+180μ I緩沖液，泳道3為60 μ I裂解液+140 μ I緩沖液，泳道4為120 μ I裂解液+80 μ I緩沖液，泳道5為180 μ I裂解液+20 μ I緩沖液，泳道6僅為200 μ I裂解液，泳道M為Marker II (購自TIANGEN公司，目錄號:MD102)；
[0018]圖3是不同退火溫度下擴增DNA條形碼序列的結果，其中，泳道I為32°C，泳道2為34°C，泳道3為36°C，泳道4為38°C，泳道5為40°C，泳道6為42°C，泳道7為44°C，泳道8為46°C，泳道9為48°C，泳道10為50°C，泳道11為52°C，泳道12為54°C，泳道13為560C，泳道 14 為 58°C，泳道 15 為 60°C，泳道 16 為 62°C，泳道 M 為 Marker II(購自 TIANGEN公司，目錄號:MD102)；
[0019]圖4是不同DNA模板濃度下擴增DNA條形碼序列的結果，其中，泳道I為沒有稀釋過的DNA模板，泳道2為稀釋I倍的DNA模板，泳道3為稀釋2倍的DNA模板，泳道4為稀釋10倍的DNA模板，泳道5為稀釋100倍的DNA模板，泳道6為稀釋1000倍的DNA模板，泳道M為Marker II (購自TIANGEN公司，目錄號:MD102);
[0020]圖5是不同極微量樣品DNA條形碼序列的擴增結果，其中，泳道I為陰性對照，泳道2為蠅1/5后足跗節，泳道3為螨，泳道4為蚤，泳道5為蜱，泳道M為Marker II (購自TIANGEN 公司，目錄號:MD102)o【具體實施方式】:
[0021]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0022]KOD FX DNA聚合酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。
[0023]引物的合成由寶生物工程(大連)有限公司完成，DNA測序由上海立菲生物技術有限公司完成。
[0024]實施例1:不同濃度裂解液制備的DNA模板擴增DNA條形碼序列
[0025]分別配制濃度為10、25、50、75、IOOmM的NaOH溶液各100ml，高壓滅菌備用。
[0026]配制緩沖液:將1.22g Tris, 7.46g KCl，0.3g EDTA加去離子水定容至100ml，調pH至9.5,高壓滅菌備用。
[0027]取5個蠅1/5后足跗節(約為10 μ g)分別放入5個1.5ml離心管中，加入液氮，用研磨棒研磨成粉狀，向5個離心管中分別加入10、25、50、75、IOOmM的NaOH溶液180 μ 1，95°C放置IOmin后400·0rpm短暫離心5s，然后加入20 μ I緩沖液，95°C放置lOmin，12000rpm離心lmin，棄沉淀，所得的上清即為蠅的DNA溶液。
[0028]以本實施例所制備的蠅的DNA溶液為模板，采用正向引物LCO1490和反向引物HC02198進行PCR擴增，擴增反應體系:2XK0D FX DNA聚合酶buffer (含Mg2+) 25 μ 1，2mMdNTPlOy I,KOD FX DNA 聚合酶 I μ 1，20mM 正向引物 LC01490 和 20mM 反向引物 HC02198 各I μ 1，DNA 模板 2 μ 1，加 ddH20 補足至 50 μ I。
[0029]擴增反應條件為:95°C3min ；98°C 10s,50°C 30s，68°C lmin，35個循環；68°C 7min。
[0030]擴增結果如圖1所示，陰性對照是以ddH20為模板進行擴增的結果，為了排除PCR體系中的污染。由此可見，通過本實施例的方法制備出的極微量樣品DNA模板所擴增出的DNA條形碼序列是非常清晰準確的，而采用50mM的NaOH溶液的制備效果是最優的。
[0031]通過本實施例的方法擴增出的產物經測序得到的長度為658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登錄號為KF437544，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為FJ614823的瘦葉帶綠蜆(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性為100%。由此說明，本實施例的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法是準確可行的。
[0032]實施例2:不同體積比混合緩沖液和裂解液制備DNA模板擴增DNA條形碼序列
[0033]裂解液和緩沖液的配制方法和實施例1相同。
[0034]取5個蠅1/5后足跑節(約為10 μ g)分別放入5個1.5ml離心管中，加入液氮,用研磨棒研磨成粉狀，向5個離心管中分別加入50mM的NaOH溶液20、60、120、180、200 μ 1，95°C放置IOmin后4000rpm短暫離心5s，然后分別加入180、140、80、20、0 μ I緩沖液，95°C放置lOmin, 12000rpm離心lmin,棄沉淀,所得的上清即為蠅的DNA溶液。
[0035]PCR擴增反應體系和反應條件與實施例1相同。
[0036]擴增結果如圖2所示，陰性對照是以ddH20為模板進行擴增的結果，為了排除PCR體系中的污染。由此可見，通過本實施例的方法制備出的極微量樣品DNA模板所擴增出的DNA條形碼序列是非常清晰準確的，而緩沖液與裂解液的體積比為1:9的比例所制備出來的DNA模板擴增效果是最優的。
[0037]通過本實施例的方法擴增出的產物經測序得到的長度為658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登錄號為KF437544，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為FJ614823的瘦葉帶綠蜆(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性為100%。由此說明，本實施例的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法是準確可行的。
[0038]實施例3:不同退火溫度下擴增DNA條形碼序列
[0039]裂解液和緩沖液的配制方法和實施例1相同。
[0040]取16個蠅1/5后足跗節(約為10 μ g)分別放入16個1.5ml離心管中，加入液氮，用研磨棒研磨成粉狀，再向離心管中分別加入50mM的NaOH溶液180 μ 1，95°C放置IOmin后4000rpm短暫離心5s,然后分別加入20 μ I緩沖液，95°C放置lOmin, 12000rpm離心lmin,棄沉淀，所得的上清即為蠅的DNA溶液。
[0041 ] PCR擴增反應體系和實施例1相同。
[0042]16 個樣品的退火溫度分別為 32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62。。。
[0043]其他擴增反應 條件為與實施例1相同。
[0044]擴增結果如圖3所示，由此可見，通過本實施例的方法制備出的極微量樣品DNA模板在上述退火溫度范圍內所擴增出的DNA條形碼序列都是非常清晰準確的，而退火溫度為50°C條件下擴增出來的DNA模板擴增效果是最優的。
[0045]通過本實施例的方法擴增出的產物經測序得到的長度為658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登錄號為KF437544，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為FJ614823的瘦葉帶綠蜆(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性為100%。由此說明，本實施例的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法是準確可行的。
[0046]實施例4:不同DNA模板濃度擴增DNA條形碼序列
[0047]裂解液和緩沖液的配制方法和實施例1相同。
[0048]取I個蠅1/5后足跑節(約為10 μ g)放入I個1.5ml離心管中，加入液氮,用研磨棒研磨成粉狀，再向離心管中分別加入50mM的NaOH溶液180 μ 1,95°C放置IOmin后4000rpm短暫離心5s，然后加入20 μ I緩沖液，95°C放置lOmin，12000rpm離心lmin，棄沉淀，所得的上清即為蠅的DNA溶液。
[0049]以本實施例制備的DNA溶液為PCR擴增反應的模板，同時將該DNA溶液分別稀釋
1、2、10、100、1000倍也作為PCR擴增反應的DNA模板。
[0050]PCR擴增反應體系和反應條件與實施例1相同。
[0051]擴增結果如圖4所示，由此可見，通過本實施例的方法制備出的極微量樣品DNA模板在稀釋I?10倍范圍內所擴增出的DNA條形碼序列都是非常清晰準確的。
[0052]通過本實施例的方法擴增出的產物經測序得到的長度為658bp (去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登錄號為KF437544，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為FJ614823的瘦葉帶綠蜆(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性為100%。由此說明，本實施例的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法是準確可行的。
[0053]實施例5:擴增不同極微量樣品DNA條形碼序列
[0054]取I個蠅1/5后足跗節(約為10 μ g)、I只蚤、蜱及螨分別放入4個1.5ml的離心管中，加入液氮，用研磨棒研磨成粉狀，再分別向離心管中分別加入50mM的NaOH溶液180 μ 1，95°C放置IOmin后4000rpm短暫離心5s，然后分別加入20 μ I緩沖液，95 °C放置IOmin,12000rpm離心lmin,棄沉淀,所得的上清即為蠅、蚤、蝶及螨的DNA溶液。
[0055]PCR擴增反應體系和反應條件與實施例1相同。
[0056]擴增結果如圖5所示，由此可見，通過本實施例的方法制備出的蠅及單個個體的蚤、蜱及螨的DNA模板所擴增出的DNA條形碼序列都是非常清晰準確的。
[0057]通過本實施例的方法擴增出的螨的DNA條形碼序列經測序得到的長度為658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.1所示，GenBank登錄號為KF437544，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為FJ614823的瘦葉帶綠蜆(Hemipyrellia Iigurriens)序列相似性為100%ο
[0058]通過本實施例的方法擴增出的蚤的DNA條形碼序列經測序得到的長度為658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.2所示，GenBank登錄號為KF437545，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為JN008922的蚤(Echidnophaga sp.)序列相似性為84%。
[0059]通過本實施例的方法擴增出的蜱的DNA條形碼序列經測序得到的長度為658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.3所示，GenBank登錄號為KF437543，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為JX416325的血紅扇頭蝶(Rhipicephalus sanguineus)序列相似性為99%。
[0060]通過本實施例的方法擴增出的螨的DNA條形碼序列經測序得到的長度為658bp(去除引物序列)，如SEQ ID N0.4所示，GenBank登錄號為KF437542，與NCBI比對，最高相似結果與Genbank登錄號為JX837922的螨(Ameroseiidae sp.)序列相似性為81%。
[0061]由此說明，本實施例的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法是準確可行的。.
【權利要求】
1.一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、DNA模板的制備:取一只極微小動物個體或動物個體的部分組織，加入裂解液，研磨，95°C放置lOmin，4000rpm短暫離心5s，然后加入緩沖液，所加入的緩沖液與裂解液的體積比為O?9:1,95°C放置lOmin, 12000rpm離心Imin,棄沉淀,所得的上清液即為極微量樣品的DNA溶液；所述裂解液為10?IOOmM的NaOH溶液，所述緩沖液，其成分及制備方法為:IOOmM Tris, IM KCl，IOmM EDTA，調 pH 為 9.5，高壓滅菌； (2)、DNA條形碼序列的擴增:以步驟(I)的極微量樣品的DNA溶液為模板，采用正向引物 LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ 和反向引物 HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’進行PCR擴增，即得到極微量樣品的DNA條形碼序列。
2.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的動物個體的部分組織，重量為10 μ go
3.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的裂解液為50mM的NaOH溶液。
4.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的緩沖液與裂解液的體積比為1:9。
5.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的步驟(2)的PCR擴增，其擴增反應體系為:2XK0D FX DNA聚合酶buffer25 μ 1，2mMdNTPlOy I,KOD FX DNA 聚合酶 I μ 1，20mM 正向引物 LC01490 和 20mM 反向引物 HC02198 各I μ 1，DNA 模板 2 μ 1，加 ddH20 補足至 50 μ I。
6.根據權利要求1所述.的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的步驟(2)的PCR擴增，其擴增反應條件為:95°C 3min ；98°C 10s，50°C 30s,68°C lmin，35 個循環；68°C 7min。
7.根據權利要求1所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的方法，其特征在于，所述的極微量樣品為螨、蚤、蜱的單個個體或蠅的部分組織。
8.一種免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的試劑盒，包括裂解液、緩沖液、DNA聚合酶buffer、正向引物LC01490、反向引物HC02198、dNTP、KOD FX DNA聚合酶，其特征在于，所述的裂解液為10?IOOmM的NaOH溶液，所述的緩沖液其成分及制備方法為:IOOmMTris, IM KCl，IOmM EDTA，調 pH 為 9.5，高壓滅菌。
9.根據權利要求8所述的免提取直接擴增極微量樣品DNA條形碼的試劑盒，其特征在于，所述的裂解液為50mM的NaOH溶液。
【文檔編號】C12N15/10GK103436526SQ201310375667
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月23日 優先權日:2013年8月23日
【發明者】岳巧云, 胡佳, 邱德義, 陳健, 劉德星, 魏曉雅, 吳可量, 劉國雄 申請人:岳巧云