利用秀麗隱桿線蟲培養木霉厚垣孢子的方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及利用秀麗隱桿線蟲培養木霉厚垣孢子的方法及應用。本制劑（10%T11-W厚垣孢子顆粒劑）在施加有效孢子量為2×107時，防效達85.96%，高于10%T11-W分生孢子顆粒劑的防效（73.32%）。在施加有效孢子量為2×106時，本制劑的防效為68.96%，明顯高于T11-W分生孢子顆粒劑的47.15%，且兩者差異顯著。表明T11-W厚垣孢子顆粒劑對根結線蟲的防治效果明顯優于其分生孢子顆粒劑。
【專利說明】利用秀麗隱桿線蟲培養木霉厚垣孢子的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及利用秀麗隱桿線蟲培養木霉厚垣孢子的方法及應用。
【背景技術】
[0002]木霉(Trichoderma spp)菌,廣泛存在于土壤、植物殘體、植物根圍、植物葉片及種子、球莖表面及動物糞便上。該類真菌因能產生拮抗物質和寄生有害植物病原菌，而被人們廣泛應用。(楊春平，張晉康，等。綠色木霉L24菌株分生孢子可濕性粉劑的研制[J]。西北農業學報，2010，19(9):43-47)。目前生產上常用的木霉菌劑多為它的分生抱子制劑，如美國的ToPshield(哈茨木霉T-22)、以色列Trichodex (哈茨木霉T39)及中國的根友(哈茨木霉LTR-2)等。
[0003]木霉Tll-W是從黃瓜根結線蟲卵上分離所得，菌種保藏號CGMCC N0.7938，經鑒定是哈茨木霉。該菌是一種具有應用潛力的線蟲生防真菌，不但能夠寄生根結線蟲(Meloidogyne spp.)卵和雌成蟲，還能寄生秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)成蟲，并能在其蟲體上產生大量厚垣孢子。厚垣孢子是木霉抵抗逆境條件而產生的，人工發酵培養要求條件苛刻且產孢量低，因而國內外對其研究應用少。但厚垣抱子具有耐干燥、耐低溫、對土壤抑菌作用不敏感等特點，因此，研究利用秀麗隱桿線蟲生產木霉厚垣孢子方法，對研制以木霉厚垣孢子為主體的生防制劑具有重要意義。
[0004]秀麗隱桿線蟲，是一種模式線蟲。它生活在世界各地的泥土中，以細菌為食，容易人工養殖，生長周期短，從卵到成蟲只需三天半(劉恩岐，倉林讓。模型動物一秀麗隱桿線蟲研究進展[J].動物科學與動物醫學，2003，20 (10):23 — 25)，故能迅速大量繁殖，供Tll-W
作培養基生產厚垣孢子。
【發明內容】
[0005]1.利用秀麗隱桿線蟲培養Tll-W厚垣孢子
[0006]本發明提供一種對根結線蟲卵和秀麗隱桿線蟲成蟲有高效寄生率的菌株T11-W，分類命名為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Tll-ff,已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏，其保藏號為CGMCC N0.7938，保藏時間為2013年7月19日，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0007]本發明并提供一種利用秀麗隱桿線蟲培養木霉Tll-W厚垣孢子的方法。將秀麗隱桿線蟲成蟲和木霉菌Tl1-W分生孢子共同加到0.8%瓊脂培養基上，于20~25°C的環境，黑暗靜止培養8~10天，即可收集厚垣孢子。
[0008]2.Tll-W厚垣孢子制劑研究與應用
[0009]本發明生產的Tll-W厚垣孢子在農業上的應用是防治土傳的線蟲病害，這決定了該菌劑的施藥方式為澆施、撒施或穴施。綜合考慮多方面因素選擇以Tll-W厚垣孢子粉為有效成分配制一種顆粒劑，組分如下:[0010]
厚垣孢子10重量份
娃藻土70重量份
4，47_二羥基二苯甲酮8重量份
糊精10重量份
[0011]將上述組分置適宜的容器內混合均勻，加入適量蒸餾水，并用醋酸和/氨水調節PH為6，制成“手捏成團，壓之即散”的軟材，再以擠壓方式通過14~22目篩網(板)，制成均勻的顆粒。
[0012]上述組分中硅藻土為吸附劑，4，4' -二羥基二苯甲酮為穩定劑，糊精為粘合劑，醋酸和氨水為PH調節劑，蒸餾水為潤濕劑。
[0013]上述顆粒劑的應用效果如下:
[0014]對番茄根結線蟲的防治(溫室盆栽)
[0015]表1本制劑對番茄根結線蟲的防治效果
[0016]
【權利要求】
1.利用秀麗隱桿線蟲培養木霉厚垣孢子的方法，其特征在于將秀麗隱桿線蟲成蟲和木霉菌Tll-W分生孢子共同加到0.8%瓊脂培養基上，于20~25°C的環境，黑暗靜止培養8~.10天，即可收集厚垣孢子。
2.如權利要求1所述的培養木霉厚垣孢子的方法，其特征在于秀麗隱桿線蟲成蟲和木霉菌Tll-W分生孢子的用量比例為線蟲800~1000條:分生孢子
lX106cfu。
3.如權利要求1所述的培養木霉厚垣孢子的方法，其特征在所述秀麗隱桿線蟲成蟲的培養方法包括懷卵成蟲的培養，其中包括E.coli 0P50的培養及菌體收集、線蟲的平板培養、線蟲的搖瓶大量培養；大量卵的制備；成蟲的培養及收集各步驟；其中: 所說的E.coli 0P50的培養采用的培養基為固體LB培養基和液體LB培養基； 所說的線蟲的平板培養采用的培養基為含有E.coli 0P50的改良NGM培養基，其配方為:氯化鈉3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，膽固醇0.005g，氯化鈣0.llg，七水硫酸鎂0.25g，磷酸氫二鉀0.76g，磷酸二氫鉀2.96g，瓊脂20g，水1000mL ； 添加色氨酸0.2g對秀麗隱桿線蟲的生長發育有促進作用；
所說的線蟲的搖瓶大量培養采用的培養基為含有E.coli 0P50的改良液體NGM培養基，其配方為:氯化鈉3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，膽固醇0.005g，氯化鈣0.llg，七水硫酸鎂0.25g，磷酸氫二鉀0.76g，磷酸二氫鉀2.96g，水1000mL ；
所說的大量卵的制備過程中，采用新鮮的改良bleach溶液進行反復洗滌； 改良Bleach溶液的配方為:6%NaC10 20 ml,NaOH lg，低溫蛋白酶0.2g，水定容至100ml ； 所說的成蟲的培養采用的培養基為含有E.coli 0P50的改良液體NGM I其配方為:氯化鈉3g，蛋白胨2.0，色氨酸0.2g，膽固醇0.005g，氯化鈣0.llg，七水硫酸鎂0.25g，磷酸氫二鉀 0.76g，磷酸二氫鉀 2.96g，水 1000mL。
4.如權利要求1所述的培養木霉厚垣孢子的方法，其特征在于所說的木霉菌Tll-W分生孢子的培養方法為:將木霉菌株Tll-W接種于PDA培養基上，置于28°C下培養一周，將培養所的分生孢子用無菌水洗下，并過濾，并將其稀釋至目標濃度IXlO6 cfu/mL。
5.如權利要求4所述的木霉菌Tll-W分生孢子的培養方法，其特征在于所說的木霉菌T11-W，分類命名為哈茨木霉，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏，其保藏號為CGMCC N0.7938，保藏時間為2013年7月19日，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
6.如權利要求1所述的木霉厚垣孢子的應用，其特征在于用于防治土傳的線蟲病害。
7.如權利要求6所述的木霉厚垣孢子的應用，其特征在于應用木霉厚垣孢子為有效成分配制防治土傳的線蟲病害的顆粒劑，具體組成如下: 厚垣孢子10重量份 娃藻土70重量份 . 4，47—二羥基二苯甲酮8重量份 糊精10重量份。
【文檔編號】C12N3/00GK103555648SQ201310377872
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年8月27日 優先權日:2013年8月27日
【發明者】王貽蓮, 亞平, 李紀順, 楊合同, 扈進冬, 李紅梅, 郭凱, 陳穗云, 孫文向, 許銀連, 尹忠仁 申請人:云南省煙草公司臨滄市公司, 山東省科學院中日友好生物技術研究中心, 昆明保騰生化技術有限公司