氨基桿菌h1及在氧化錳離子中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株氨基桿菌H1（Aminobacter?sp.H1）及在氧化錳離子中的應用，所述應用為：將氨基桿菌H1經種子培養后的菌懸液以體積比1%的接種量接種至含鐵PYCM培養液中，并向所述含鐵PYCM培養液中加入MnCl2，所述MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養液體積計0.25～50mmol/L，于25～35℃、160r/min振蕩箱中培養5～7d，從而將錳離子氧化為氧化錳；本發明Aminobacter?sp.H1取自成熟錳砂，是除錳濾池中常見的優勢菌種，能適應復雜的環境條件，因而該菌株在水體和固體基質中氧化除Mn2+的應用前景廣闊。
【專利說明】氨基桿菌H1及在氧化錳離子中的應用
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一株具有猛氧化能力的新菌株-氨基桿菌(Aminobacter sp.)H1及其應用。
(二)【背景技術】
[0002]隨著我國近些年經濟的飛速發展，工業用水量快速增加，使得目前國內各大地表水系和地下水均遭到不同程度污染，其中錳便是主要污染元素之一。不僅是我國，在世界其他國家，地下水中鐵、錳含量超標現象也很普遍，如美國、法國、意大利、瑞典、同本、德國、芬蘭等許多國家和地區。錳(Mn)是地殼中僅次于鐵(Fe)的第二大過渡金屬，廣泛存在于淡水、海水、沉積物和各種礦物中，是所有生物體必需的微量元素，是某些金屬酶如過氧化物岐化酶、精氨酸酶和磷酸鹽轉移酶的成分。但錳攝入過量則可造成中毒，引起多種神經功能紊亂等癥狀，如嗜睡、頭痛、乏力、記憶力減退，甚至出現末梢神經損害，四肢僵直等癥狀。此外，在人類生產生活中過量的錳也可導致一系列不利影響，如增加水的濁度和色度、使工業品著色等，不僅嚴重影響水的使用價值，而且還降低了某些工業產品的質量。因此研究水體中錳的凈化技術便顯得十分迫切和重要。
[0003]生物凈化技術具有去除效率高、處理費用低、二次污染小等特點，逐漸被廣泛應用于有毒污染物的降解和凈化。采用生物技術氧化去除錳的關鍵之一便是獲得具有高效氧化降解Mn2+能力的菌株。目前，國內外學者已對錳的生物去除進行了大量研究，迄今分離獲得的猛細菌主要包括生盤纖發菌(Leptothrix discophora)、芽胞桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)等。大量研究表明，從環境中分離篩選的高效錳氧化菌，仍然是消除環境中錳污染的重要方法之一。
[0004]本發明中的氨基桿菌(Amino`bacter sp.)是一種常見的短桿菌,經檢索專利和其他相關文獻，尚未發現利用該菌種氧化去除水體中Mn2+的報道。該菌株的發現對于工業廢水中錳等重金屬的高效凈化具有重要意義，同時也豐富了微生物錳氧化的理論研究。
(三)
【發明內容】
[0005]本發明目的是提供一株高效、耐受能力強的具有Mn2+氧化能力的氨基桿菌及其應用。
[0006]本發明采用的技術方案是:
[0007]本發明涉及一株氨基桿菌Hl (Aminobacter sp.Hl),保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號:CCTCC NO:M2012296，保藏日期2012年7月19日，保藏地址為中國武漢武漢大學，郵編:430072。
[0008]所述氨基桿菌(Aminobacter sp.)H1來源于沈陽某開發區水廠運行穩定的生物除錳濾池中成熟錳砂，經馴化、分離、純化得到。菌株為革蘭氏染色陰性菌，好氧，氧化酶陽性，生長在含鐵PYCM固體培養基呈白色、邊緣整齊、表面光滑的圓形菌落。透射電鏡下觀察該菌體的形態為短桿菌，有鞭毛。Aminobacter sp.Hl的GenBank登錄號為JX457318,其16SrDNA序列為SEQ.1D.NOl所示。
[0009]本發明還涉及一種所述氨基桿菌Hl在氧化錳離子中的應用，所述應用為:將氨基桿菌Hl經種子培養后的菌懸液以體積比1%的接種量接種至含鐵PYCM培養液中，并向所述含鐵PYCM培養液中加入MnCl2,所述MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養液體積計0.25~50mmol/L (不高于50mmol/L均可，MnCl2加入量的計量中不包括菌懸液的體積，防止MnCl2在高溫滅菌時被氧化，待已滅菌的培養基冷卻至室溫后通過0.22 μ m微孔膜過濾除菌后加入培養基中)，于25~35°C、160r/min振蕩箱中培養5~7d,從而將猛離子氧化為氧化錳；所述含鐵PYCM培養液的終濃度組成為:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L，K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.1g/L，(NH4)2CO30.05~0.15g/L和檸檬酸鐵銨0.5~2g/L，溶劑為去離子水，ρΗ6.8~7.2。
[0010]進一步，本發明所述的應用，優選所述MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養液體積計
0.25 ~30mmol/L。
[0011]進一步，所述含鐵PYCM培養液中檸檬酸鐵銨的終濃度優選為I~2g/L。
[0012]進一步，所述菌懸液中細胞光密度(OD6J為1.0。
[0013]進一步，優選所述培養溫度為35°C，培養時間為5天，所述含鐵PYCM培養液中檸檬酸鐵銨終濃度為lg/L，所述MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養液體積計為lmmol/L，培養液pH值為7。
[0014]進一步，所述菌懸液按如下方法制備:
[0015](I)斜面培養:將氨基桿菌Hl接種至斜面培養基，并向斜面培養基內加入以斜面培養基體積計0.25~10mmol/L的MnCl2,在25~35°C下培養48~72h，獲得斜面菌體；所述斜面培養基終濃度組成為:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L，K2HPO40.05~
0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.lg/L 和(NH4)2CO30.05~0.15g/L，瓊脂質量終濃度1.5~2.0%、溶劑為去離子水，pH6.8~7.2 ;
[0016](2)種子培養:從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，在30°C下培養60~72h，獲得種子液，即菌懸液；所述種子培養基終濃度組成為:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉 0.1 ~0.2g/L, K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L，CaCl20.05 ~0.lg/L, (NH4)2CO30.05 ~0.15g/L 和檸檬酸鐵銨 0.5 ~2g/L，溶劑為去離子水，pH6.8 ~7.2。
[0017]本發明的有益技術效果主要體現在:
[0018]本發明提供一株新菌株一氨基桿菌(Aminobacter sp.)H1,以體積比1%的接種量將氨基桿菌Hl菌懸液接種至含鐵PYCM培養基中，并在培養基中加入Mn2+，當培養基中存在lg/L檸檬酸鐵銨時，在30°C，160r/min，pH值為7.0的條件下，培養3d內可以將IOmmol/L的Mn2+完全去除，5d內可將60%左右的lmmol/L Mn2+氧化生成高價態不溶性的生物氧化錳；在Mn2+初始濃度高達50mmol/L的含鐵PYCM培養基中，菌株能保持生長活性，并在Mn2+初始濃度高達40mmol/L含鐵PYCM培養基中有Mn2+氧化活性，最佳溫度為35°C，最佳pH值為7.0 ;本發明Aminobacter sp.Hl取自成熟猛砂,是除猛濾池中常見的優勢菌種，能適應復雜的環境條件，因而該菌株在水體和固體基質中氧化除Mn2+的應用前景廣闊。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】[0019]圖1為Aminobacter sp.Hl的革蘭氏染色照片；
[0020]圖2為Aminobacter sp.Hl的透射電鏡照片；
[0021]圖3為Aminobacter sp.Hl的系統發育樹圖；
[0022]圖 4 為 Aminobacter sp.Hl 的 Biolog 鑒定圖；
[0023]圖5為Aminobacter sp.Hl的不同生長階段對Mn2+的氧化去除曲線；
[0024]圖6 為 Aminobacter sp.Hl 對猛抗性；
[0025]圖7為Aminobacter sp.Hl對高濃度Mn2+的去除率；
[0026]圖8為Aminobacter sp.Hl對低濃度Mn2+的氧化率。
(五)【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
[0028]下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法，其中所用的試劑，如無特別說明，均為常規市售試劑。
[0029]實施例1.氨基桿菌(Aminobacter sp.) Hl的分離、純化及其鑒定
[0030]I > Aminobacter sp.Hl 的分離及純化
[0031]Aminobacter s`p.Hl是從沈陽經濟開發區某水廠運行穩定的成熟活性錳砂中馴化、分離及純化得到的一株革蘭氏陰性菌，具體步驟如下:
[0032]取水廠運行穩定的成熟活性錳砂，自來水淘洗3~5次后，空曝48h，盡量去除殘留的有機物。配制含鐵PYCM培養液(pH=7)，向含鐵PYCM培養液中加入添加MnCl2對活性污泥(即空曝48h后的錳砂)進行定向馴化，所述MnCl2的加入量以培養液體積計lOmmol/L，每3d更換新鮮培養液一次，每天測定培養液的pH。
[0033]配制MnCl2初始濃度為10mmol/L (即MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養基體積計為10mmol/L)的含鐵PYCM培養基方法如下:蛋白胨0.Sg，酵母粉0.2g，MnCl2.4H202g，K2HPO40.lg，MgSO4.7H200.2g，NaNO30.2g，CaCl20.lg，(NH4)2CO30.lg，檸檬酸鐵銨 2.0g，去離子水1L，pH7.0，分裝于250mL的錐型瓶(IOOmL/個)中，121°C濕熱滅菌20min后使用。防止MnCl2在高溫滅菌時被氧化，待已滅菌的培養基冷卻至室溫后通過0.22 μ m微孔膜過濾除囷后加入培養基中。
[0034]將馴化的污泥按體積分數為5%的量加入到上述含鐵PYCM培養基(MnCl2初始濃度為lmmol/L,檸檬酸鐵濃度為1.0g/L)中，于30°C, 160rpm的搖床振蕩培養3d左右至對數生長期，隨后以體積濃度10%的量轉接到新鮮滅菌后的含鐵PYCM培養基(MnCl2初始濃度為lmmol/L,檸檬酸鐵濃度為1.0g/L)中，30°C, 160rpm搖床振蕩培養。取少量培養液于含鐵PYCM瓊脂培養基平板上進行稀釋涂布及劃線分離，挑取單菌落接入含鐵PYCM培養基(MnCl2初始濃度為lmmol/L，檸檬酸鐵濃度為1.0g/L)中，30°C、160rpm搖床繼續振蕩培養，直到獲得在上述培養基中生長快、菌落規則和性狀穩定的可氧化Mn2+的單菌株，記為菌株Hl0
[0035]菌株Hl生長穩定期的革蘭氏染色如圖1所示，透射電鏡如圖2所示。結果表明，該菌株Hl是革蘭氏陰性菌，好氧，30°C下在含鐵PYCM瓊脂固體培養基生長5天后呈白色、邊緣整齊、表面光滑的圓形菌落；透射電鏡下觀察該菌體的形態為短桿菌，有鞭毛。[0036]2、菌株Hl的鑒定
[0037]通過16S rDNA序列分析、生理生化實驗及Biolog等方法鑒定,確定菌株Hl為氨基桿菌Hl (Aminobacter sp.)。具體步驟如下:
[0038]采用3S柱離心式環境樣品DNA回收試劑盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和純化菌株Hl的DNA，4°C保存。選用細菌的通用引物BSF27/20和BSR1492/20對純化的DNA進行PCR擴增，引物序列分別為:
[0039]BSF27/20:5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
[0040]BSR1492/20:5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
[0041]PCR反應程序設定為:94°C預變性4min ;然后94°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸2min，循環30個周期；然后72°C延伸5min ;最后4°C保持lOmin。將PCR產物進行測序(上海英濰捷基)，菌株Hl的16S rDNA序列為SEQ.1D.NOl所示。
[0042]將菌株Hl的16S rDNA序列上傳到Genbank,獲得Genbank的登錄號JX457318,同時與Genbank中的基因序列進行同源性比較，發現其從屬于Aminobacter屬，與Aminobacter sp.CL-9.08 (HQ113207)同源性最高，達到99%。圖3為該菌株的系統發育樹。
[0043]菌株Hl生理生化鑒定參照《微生物學實驗》(沈萍等，2007)方法進行，結果如表1所示。
[0044]菌株Hl的Biolog鑒定具體步驟:將待測菌接種至含鐵PYCM瓊脂(MnCl2終濃度lmmol/L，檸檬酸鐵銨終濃度lg/L)平板培養基上活化，隨后挑取單菌落接入新鮮的BUG+B培養基，30°C培養過夜。用無菌棉簽挑取已經培養好的菌落，在無菌超凈臺中緩慢接種到濁度管(選用IF-A接種液)中 ，調整濁度至98%，用排槍小心地接種到Biolog碳源板(選用GN-1II)上，置于30°C恒溫培養箱中培養。分別在培養4~6h、16~24h后用Biolog鑒定儀通過計算機讀取相應的數據，得到菌株鑒定的結果，如圖4所示。結果表明，菌株Hl為氨基桿菌(Aminobacter aminovorans),與16S rDNA及生理生化結果一致，因此將菌株Hl命名為氛基桿菌(Aminobacter sp.)Hl。
[0045]BUG+B培養基配置如下:取250mL錐形瓶一個，加入95mL超純水，5.7g BUG瓊脂培養基(Cabot Blvd, Hayward, CA984545, USA)，煮沸溶解(冷卻后 pH—般為 7.3±0.1)，包好，121°C滅菌15min，冷卻至45~50°C后，加5mL新鮮的脫纖羊血，倒平板。
[0046]菌株Aminobacter sp.Hl已于2012年7月19日保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M2012296，保藏地址中國武漢武漢大學，郵編:430072。
[0047]表1菌株Hl生理生化結果
[0048]
--項目
|?.—
愛粉水解試驗
吲哚試驗-_
甲基紅試驗-_
V-P試驗_-_
氧化酶試驗
明膠液化試驗-_
過氧化氫酶試驗I+
【權利要求】
1.一株氨基桿菌Hl (Aminobacter sp.HI),保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏編號:CCTCC NO:M2012296，保藏日期2012年7月19日，保藏地址為中國武漢武漢大學，郵編:430072。
2.—種權利要求1所述氨基桿菌Hl在氧化錳離子中的應用，其特征在于所述應用為:將氨基桿菌Hl經種子培養后的菌懸液以體積比1%的接種量接種至含鐵PYCM培養液中，并向所述含鐵PYCM培養液中加入MnCl2,所述MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養液體積計0.25~50mmol/L,于25~35°C、160r/min振蕩箱中培養5~7d,從而將猛離子氧化為氧化錳；所述含鐵PYCM培養液的終濃度組成為:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L，K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.1g/L，(NH4)2CO30.05~0.15g/L和檸檬酸鐵銨0.5~2g/L，溶劑為去離子水，ρΗ6.8~7.2。
3.如權利要求2所述氨基桿菌Hl在氧化錳離子中的應用，其特征在于所述MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養液體積計0.25~30mmol/L。
4.如權利要求2所述氨基桿菌Hl在氧化錳離子中的應用，其特征在于所述含鐵PYCM培養液中檸檬酸鐵銨的終濃度為I~2g/L。
5.如權利要求2所述氨基桿菌Hl在氧化錳離子中的應用，其特征在于所述菌懸液中細胞 OD6tltl 為 1.0。
6.如權利要求2所述氨基桿菌Hl在氧化錳離子中的應用，其特征在于所述培養溫度為350C，培養時間為5天，所述含鐵PYCM培養液中檸檬酸鐵銨終濃度為lg/L，所述MnCl2的加入量以含鐵PYCM培養液體積計lmmol/L，培養液pH值為7。
7.如權利要求 2所述氨基桿菌Hl在氧化錳離子中的應用，其特征在于所述菌懸液按如下方法制備:
(1)斜面培養:將氨基桿菌Hl接種至斜面培養基，并向斜面培養基內加入以斜面培養基體積計0.25~10mmol/L的MnCl2,在25~35°C下培養48~72h，獲得斜面菌體；所述斜面培養基終濃度組成為:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉0.1~0.2g/L, K2HPO40.05~0.15g/LjMgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L, CaCl20.05 ~0.lg/L 和(NH4)2CO30.05 ~，0.15g/L，瓊脂質量終濃度1.5~2.0%，溶劑為去離子水，pH6.8~7.2 ; (2)種子培養:從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，在30°C下培養60~，72h，獲得種子液，即菌懸液；所述種子培養基終濃度組成為:蛋白胨0.5~0.8g/L，酵母粉，0.1 ~0.2g/L, K2HPO40.05 ~0.15g/L, MgSO4.7Η200.I ~0.25g/L, NaNO30.1 ~0.3g/L,CaCl20.05~0.lg/L, (NH4)2CO30.05~0.15g/L和檸檬酸鐵銨0.5~2g/L，溶劑為去離子水，pH6.8 ~7.2。
【文檔編號】C12R1/01GK103484401SQ201310397231
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】姜理英, 陳建孟, 何智敏, 晏平 申請人:浙江工業大學