一種基于RNAi技術及rescue原理制備的siRNA和突變型克隆載體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種利用RNAi技術和RNAirescue原理制備的siRNA和突變型克隆載體。本發明的降低SPP1基因表達的小干擾RNA序列如SEQIDNO：1-2所示；本發明的突變型克隆載體針對前述降低SPP1基因表達的RNAi的靶序列構建。本發明的方法通過RNAi沉默基因觀察功能變化情況，回復突變的載體與RNAi同時感染或轉染目的細胞，沉默內源目的基因，通過外源突變型載體表達與內源相同功能的蛋白，經過這樣組合處理細胞功能不發生改變；或者將突變型載體導入RNAi沉默后，功能得到回復，證明功能表型是由此基因引起的，為基因功能研究提供了一種新的模型和方法。
【專利說明】—種基于RNAi技術及rescue原理制備的siRNA和突變型克隆載體
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】,具體涉及一種基于RNAi rescue原理制備突變型克隆載體的方法。
【背景技術】
[0002]RNAi (RNA interference, RNA干擾)是一種高效的特異性強的基因阻斷技術,通過切斷目的基因mRNA達到沉默目的基因的作用，RNAi技術是一種新興的基因研究工具，目前已經被廣泛常規應用于各種領域的基因功能研究。
[0003]隨著研究深入發現RNAi存在比較普遍的脫靶現象，為了證實沉默的是否為靶基因，人們采用不同的RNAi靶點證實獲得相同的基因功能結果來證明對目的基因進行了特異性沉默，但這種方法存在所設計的RNAi靶點均發生脫靶的幾率，如果所設計的RNAi靶點均發生脫靶，則無法證明對目的基因是否進行了特異性沉默。
`[0004]另一種方法就是構建RNAi target區突變體，即對該區的堿基序列進行同義突變，一方面不被RNAi沉默，一方面能保證表達的蛋白與內源、野生型載體表達的蛋白功能一致，該方法被稱為RNA干擾回復(即:RNAi rescue)技術。通過RNA干擾回復技術對基因表達進行回復，如果回復的結果和RNAi的結果相反，則可以確認該基因功能。RNA干擾回復方法在設計上更加科學，也更加嚴格。對于RNA干擾回復的應用目前報道不多，其主要原因在于獲得突變型過表達載體的關鍵技術不夠成熟。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于構建沉默SPPl基因表達的小干擾RNA，以及針對該RNAi的靶序列構建的突變型克隆載體，該突變型克隆載體能夠避免RNAi沉默，同時該突變型克隆載體能夠表達正常功能的蛋白；兩者結合可用于SPPl基因功能的研究。
[0006]本發明首先提供了一種降低SPPl基因表達的小干擾RNA (siRNA)，包括正義鏈和反義鏈，序列如下:
[0007]正義鏈:5’-CCAUUCUGAUGAAUCUGAU-3’ (SEQ ID NO:1);
[0008]反義鏈:5，-AUCAGAUUCAUCAGAAUGG-3’(SEQ ID NO:2)。
[0009]進一步的，本發明所述小干擾RNA針對的SPPl基因上的RNA干擾靶序列如SEQ IDNO:3所示。
[0010]一種降低SPPl基因表達的shRNA，所述shRNA含有SEQ ID NO:1所示序列的正義鏈片段和SEQ ID NO:2所示序列的反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的
莖環結構。
[0011]進一步的，所述降低SPPl基因表達的ShRNA可剪切成前述含有如SEQ ID NO:1所示正義鏈以及SEQ ID NO:2所示反義鏈的降低SPPl基因表達的siRNA。
[0012]優選的，所述莖環結構的序列可選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0013]一種SPPl基因干擾慢病毒載體，含有編碼前述降低SPPl基因表達的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA，并剪切獲得如SEQ ID NO:1~2所示序列的siRNA。
[0014]所述SPPl基因干擾慢病毒載體是將編碼前述SPPl基因shRNA的DNA片段克隆入已知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述SPPl基因干擾慢病毒載體經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細胞，進而轉錄出所述ShRNA，通過酶切加工等步驟，最終獲得所述SPPl基因小干擾RNA，用于特異性沉默SPPl基因的表達。
[0015]進一步的，所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-pur ο > pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、 pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1 PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0016]最優選的，所述慢病毒載體為pGCL-GFP。
[0017]一種SPPl基因干擾慢病毒，由前述SPPl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
[0018]本發明第二方面公開了一種SPPl基因突變型克隆載體，針對前述降低SPPl基因表達的SiRNA的RNA干擾靶序列突變獲得；該突變型克隆載體含有突變的RNA干擾靶序列，并編碼RNAi target mRNA區第三個堿基同義突變的SPPl基因mRNA。
[0019]優選的，所述突變型克隆載體含有SPPl蛋白表達序列，其特征在于，所述突變型克隆載體的SPPl蛋白表達序列中含有突變的RNA干擾靶序列，并能編碼RNAi target mRNA區第三個堿基同義突變的SPPl基因mRNA ;所述RNA干擾靶序列為權利要求1_2任一權利要求所述siRNA所針對的RNA干擾靶序列；所述RNAi target mRNA區為所述RNA干擾靶序列區段所對應并編碼的mRNA。
[0020]所述RNAi target mRNA區為RNA干擾靶序列區段所對應并編碼的mRNA。本發明突變型克隆載體表達的S PPl蛋白序列可參考Gene Bank (NM_000582.2)。
[0021]本發明所述RNAi target mRNA區第三個堿基同義突變是指將目的基因RNA干擾靶序列中，所有編碼氨基酸的三聯密碼子中的第三個堿基進行同義突變，使其堿基序列改變但表達的氨基酸種類不變。
[0022]優選的，所述突變的RNA 干擾靶序列為 5’-TCACTCCGACGAGTCCGAC-3’(SEQ ID NO:4)。即采用SEQ ID NO:4所示突變的RNA干擾靶序列替換掉SEQ ID NO:3所示RNA干擾靶序列，從而使SPPl基因RNAi target mRNA區發生同義突變。
[0023]更優選的，所述突變型克隆載體含有SEQ ID NO:23所示突變的SPPl基因序列。
[0024]本發明突變型克隆載體的關鍵在于通過分子克隆的方法在目的基因的RNAitarget序列的所有編碼氨基酸的三聯密碼子中的第三個位置的堿基進行同義突變，使其堿基序列改變但氨基酸不變，通過堿基同義突變后獲得的克隆載體具有不被RNAi沉默又能表達正常功能蛋白的特性。
[0025]本發明還公開了前述突變型克隆載體的方法，包括下列步驟:目的基因RNAi有效靶點設計、構建shRNA載體；RNAi target mRNA區第三個堿基同義突變；多重PCR獲得含同義突變的目的基因全長mRNA ;突變型克隆載體構建；突變型克隆載體構建成功證明；回復功能實驗證實細胞克隆形成。
[0026]本發明最后一方面公開了前述降低SPPl基因表達的小干擾RNA，前述突變型克隆載體在SPPl基因功能研究中的應用。
[0027]本發明制備的突變型載體不被RNAi干擾沉默，能表達出功能與野生型載體相同的蛋白；它是研究基因功能的良好模型，對內源基因進行沉默，外源基因導入后不被沉默。同時，本發明通過RNAi沉默基因觀察功能變化情況，回復突變的載體與RNAi同時感染或轉染目的細胞，一方面沉默內源目的基因，但不沉默外源目的基因，通過外源突變型載體表達與內源相同功能的蛋白，經過這樣組合處理細胞功能不發生改變；或者將突變型載體導入RNAi沉默后，功能得到回復，證明功能表型是由此基因引起的。本發明為基因功能研究提供了一種新的模型、方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1:用于shRNA構建的質粒圖譜。
[0029]圖2:載體線性化電泳圖。
[0030]圖3:shRNA載體陽性克隆PCR瓊脂糖電泳圖。
[0031]圖4:突變型載體構 建流程圖。
[0032]圖5:突變型載體質粒圖譜。
[0033]圖6:突變型載體線性化電泳圖。
[0034]圖7:突變型載體陽性克隆PCR瓊脂糖電泳圖。
[0035]圖8 =RT-PCR驗證實突變型克隆載體的突變是否成功。
[0036]圖9 =WB驗證實突變型克隆載體的突變是否成功。
【具體實施方式】
[0037]下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件或者制造商建議的條件進行或配置。
[0038]實施例1突變型克隆載體制備
[0039]1.制備原理
[0040]本實施例中使用的目的基因為SPPl (NM_000582.2)基因，制備兩端設酶切位點粘端的表達干擾序列的雙鏈DNA oligo序列，直接連入干擾載體；然后將連接好的產物轉入制備好的細菌感受態細胞，對長出的克隆先進行PCR鑒定，在進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構建成功的目的基因RNA干擾慢病毒載體。
[0041]突變型慢病毒過表達載體在目的基因的RNAi target序列的所有編碼氨基酸的三聯密碼子中的第三個位置的堿基進行同義突變，即雖然目的基因堿基序列發生改變，但由于其編碼的mRNA的RNAi target mRNA區發生了同義突變，因此突變型克隆載體表達的氨基酸序列不變；因此，該突變型能夠避免被RNAi降解，同時翻譯出的蛋白具有正確的生物學功能。[0042]2、制備步驟:
[0043]2.1針對目的基因SPP1，根據AA-N19-TT設計原則，設計RNA干擾靶序列為:
[0044]5’-CCATTCTGATGAATCTGAT-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0045]2.2根據已經設計的RNA干擾靶序列，設計兩端含Hpa I和Xho I酶切位點粘端的表達干擾序列的雙鏈DNA oligo序列，設計結果如表1中SEQ ID NO:4_5序列所示:
[0046]表1兩端含Hpa I和Xho I酶切位點粘端的雙鏈DNA oligo序列
[0047]
【權利要求】
1.一種降低SPPl基因表達的小干擾RNA，包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈和反義鏈序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.如權利要求1所述的小干擾RNA，其特征在于，所述小干擾RNA針對的SPPl基因上的RNA干擾靶序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一種降低SPPI基因表達的shRNA，所述shRNA含有SEQ ID NO:1所示序列的正義鏈片段，SEQ ID NO:2所示序列的反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構。
4.一種SPPl基因干擾慢病毒載體，含有編碼權利要求3所述降低SPPl基因表達的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA，并剪切獲得如SEQ ID NO:1~2所示序列的siRNA。
5.一種SPPl基因干擾慢病毒，由權利要求4所述SPPl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
6.一種SPPl基因突變型克隆載體，含有SPPl蛋白表達序列，其特征在于，所述突變型克隆載體的SPPl蛋白表達序列中含有突變的RNA干擾靶序列，并能編碼RNAi target mRNA區第三個堿基同義突變的SPPl基因mRNA ;所述RNA干擾靶序列為權利要求1_2任一權利要求所述siRNA所針對的RNA干擾靶序列；所述RNAi target mRNA區為所述RNA干擾靶序列區段所對應并編碼的mRNA。
7.如權利要求6所述突變型克隆載體，其特征在于，所述突變的RNA干擾靶序列如SEQID NO:4所示；所述RNA干擾祀序列如SEQ ID NO:3所示。
8.如權利要求6所述突變型克隆載體，其特征在于，所述突變型克隆載體含有SEQIDNO: 23所不SPPI蛋白表達序列。
9.權利要求1-2任一權利要求所述降低SPPl基因表達的小干擾RNA，權利要求3所述shRNA,權利要求4所述SPPl基因干擾慢病毒載體，權利要求5所述SPPl基因干擾慢病毒，及權利要求6-8任一權利要求所述突變型克隆載體在SPPl基因功能研究中的應用。
【文檔編號】C12N15/867GK103509796SQ201310399709
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】曹躍瓊, 朱向瑩, 金楊晟 申請人:蘇州吉凱基因科技有限公司