專利名稱：具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標記的RNAi載體pGO的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥分子生物學技術領域，是一種可用于特異性抑制靶基因表達的具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標記的RNA干擾(RNAi)載體pGO。
背景技術：
RNA干擾(RNAi)是指雙鏈RNA(dsRNA)特異性地誘發與其同源序列的mRNA分子被降解，導致相應基因表達被抑制的現象，是一種特殊的轉錄后基因表達沉默現象。RNA干擾(RNAi)現象是1998年由Fire等在線蟲中首次發現并報道。他們觀察到在線蟲中雙鏈RNA(dsRNA)可在轉錄后水平特異性抑制基因表達。隨后許多學者對線蟲、果蠅、植物和動物細胞進行了大量研究，證實RNAi是相當保守的生物模式。對果蠅的研究使RNAi機制基本被闡明當長鏈的dsRNA進入細胞時，被一種稱之為Dicer的核酸水解酶所識別，并被剪切成21-23核苷酸(nt)的siRNA，雙鏈的siRNA被RNA解鏈酶解鏈，以單鏈形式與另一核酸酶結合形成RNA酶復合體，復合體中的RNA鏈象向導一樣引導酶復合體識別序列與之互補的mRNA，并將該mRNA水解，從而特異性地抑制基因翻譯表達。2001年，Tuchl等首先發現合成21bp的siRNA可在哺乳動物細胞中特異并有效的抑制基因表達(Elbashir S.M.et al.Nature 411，494-498；2001)。不久，運用含有19-29bp反向重復序列的表達載體在哺乳動物細胞內轉錄成發夾樣RNA也成功實現了RNAi(Brummelkamp T.R.et al.Science 296，550-553；2002)。隨后RNAi技術很快被應用于抗病毒、抗腫瘤和對基因功能的研究中并取得了大量令人鼓舞的結果。
所謂RNAi技術是指基于RNAi現象而開發的抑制特定基因表達或降解特定RNA分子的分子生物學技術，其根據RNAi的基本原理，可針對致病基因的DNA核苷酸序列，選擇其中一段與其它基因同源性較低的序列作為靶序列，通過體外合成或體內轉錄形成具有21-29個堿基的互補寡核苷酸短鏈(siRNA)，在細胞中與靶基因的mRNA特異性結合，激活細胞自身的機制使其降解，從而特異性抑制該致病基因的表達。同樣，也可用RNAi對基因的功能進行研究。體外合成是根據靶序列直接化學合成一對互補寡核苷酸短鏈(siRNA)；而體內轉錄是將siRNA模板克隆入帶有RNA聚合酶III類啟動子(U6或H1)的載體中，在細胞中轉錄形成具有發夾樣結構的siRNA而發揮作用。
雖然載體介導的RNAi技術誕生不到一年時間，然而由于其便捷、高效和低成本的特點，已經成為研究使致病基因失活和研究基因功能的有力工具。目前實驗室通常使用的是早期開發的RNAi載體，如pSUPER、pSilencer、pSHAG和psiRNA等。它們的結構相對簡單，通常僅帶有原核復制元件和基本的U6或H1啟動子轉錄單位，U6或H1啟動子是RNA聚合酶III家族啟動子，在體內能很好地介導發夾樣siRNA的合成，是RNAi載體不可缺少的元件，但由于這些載體沒有示蹤和抗性篩選標記，因此給研究工作帶來許多不便。比如在轉染細胞時對轉染的細胞量很難估計，通常需要共轉染大量熒光蛋白報告基因或采用熒光標記的轉染試劑來分選出被轉染的細胞，從而增加了實驗的難度和成本。另一方面，當載體轉染細胞后有一部分會整合入細胞基因組中，可隨著細胞染色體的復制而復制，如果載體上帶有抗性基因就可通過藥物篩選出這部分細胞進行擴增，從而在這些細胞中使靶基因永久沉默。然而由于這些載體沒有攜帶真核細胞的抗性篩選標記，無法篩選出在基因組上穩定整合RNAi載體的細胞，因此只能在短時間內觀察靶基因表達的抑制(5-7天)而無法使其永久沉默。
發明內容
本發明提供一種能示蹤轉染細胞并能長期抑制靶基因表達的RNAi載體pGO，其攜帶綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因。現有綠色熒光蛋白載體pEGFP-C2真核細胞表達載體(Clontech公司產品)是攜帶經改良而更適合哺乳動物細胞表達的增強綠色熒光蛋白基因(EGFP)的載體，通常用于與目的基因融合來顯示該基因在細胞中的表達和定位情況，是常用的示蹤工具。該載體也帶有新霉素基因，其表達產物新霉素可抵抗藥物G418的毒性作用，因此，通過G418的作用可篩選出在基因組上穩定整合了載體的細胞，從而使目的基因持續表達。本發明正是利用了該載體的這兩個特性，對pEGFP-C2作適當改造后將帶有U6啟動子的轉錄元件插入該載體中構成具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標記的RNAi載體。如果在該載體中插入針對目的基因的siRNA模板，就可在細胞內抑制該目的基因的表達。因此本發明載體可用于制備治療腫瘤的藥物或用于制備研究基因功能的試劑。本發明RNAi載體對pEGFP-C2載體作如下改造1、去除多克隆位點pEGFP-C2載體主要構件(見圖2)包括pUC復制起點(pUC ori)、CMV啟動子(CMV promoter)、增強綠色熒光蛋白基因(EGFP)、多克隆位點(MCS)、SV40 PolyA、fl復制起點(fl ori)、細菌啟動子(P)、SV40早期啟動子(SV40epromoter)、卡那霉素/新霉素抗性基因(Kan/Neo)、HSV-TK PolyA等，其中多克隆位點處于綠色熒光蛋白和SV40 PolyA之間，帶有多個常用的酶切位點，如BglII、XholI、HindIII、EcoRI、SalI、BamHI等，原用于克隆目的基因與綠色熒光蛋白基因融合。而本發明中EGEP僅用于示蹤目的，原有克隆位點不適于克隆siRNA模板，故將其切除。因同尾酶BglII和BamHI恰好位于多克隆位點的兩端，故只需通過這兩種酶雙酶切再自連即可切除原有多克隆位點。
2、制備模板提取人胚腎細胞系HEK293細胞基因組DNA，作為擴增人源的RNAIII類聚合酶U6啟動子的模板。
3、合成引物針對人源U6啟動子并帶有特殊酶切位點的核苷酸序列，設計并合成下列引物
其5’端引入MluI的酶切位點ACGCGT和BglII的酶切位點AGATCT； 其5’端依次引入MluI的酶切位點ACGCGT，XhoI的酶切位點CTCGAG，EcoRI的酶切位點GAATTC，BamHI的酶切位點GGATCC，SalI的酶切位點GTCGAC和BbsI的酶切位點GAAGAC。
4、PCR擴增人源U6啟動子以HEK293細胞基因組DNA為模板，用上述合成的上游和下游引物，采用高保真的pfu酶擴增，得到帶有多克隆位點的人源U6啟動子。
5、插入U6啟動子，構建RNAi載體pEGFP-C2載體去除原有的多克隆位點后，還有一個Mlu I酶切位點，由于其位于完整的EGFP轉錄單位(包括CMV啟動子和SV40 polyA)和f1原核復制起點之間，因此外源插入片段不會改變載體上原有結構的功能，同時載體上的結構也不會影響U6啟動子轉錄元件的功能，因此U6啟動子就插于此位點中(參見附圖1、2)。如此改建后的載體命名為pGO。
pGO克服了常用RNAi載體的無法示蹤和不能穩定整合的不足。使用時首先針對靶基因上一段長度21-29nt的核苷酸序列，設計并合成一對具有反向重復序列的互補脫氧寡核苷酸鏈，作為siRNA的轉錄模板，其中將反義序列置于正義序列之前，兩者之間以核苷酸序列GAAGCTTG間隔，經退火后插入pGO載體。該載體轉染細胞后，載體上的U6啟動子以其下游插入片段為模板，指導合成具有發夾樣結構的siRNA，從而導致目的基因沉默(參見附圖3)。
圖1為本發明RNAi載體pGO的結構示意圖。
圖2為本發明RNAi載體pGO構建流程圖。
圖3為RNAi載體介導的發夾樣siRNA構建流程圖。
圖4為針對腫瘤相關基因β-catenin RNA干擾的免疫印記(Westem Blot)圖。
圖5為針對熒光素酶報告基因(Luciferase)RNA干擾的綠色熒光照片(A)及熒光素酶活性示意圖(B)。
具體實施例方式
實施例1具有綠色熒光蛋白示蹤和抗性篩選標記的RNAi載體的構建；一、人源小核RNA(U6)啟動子的克隆1.制備293細胞基因組DNA按常規將293細胞(購自ATCC公司)培養于含有10％胎牛血清的DMEM培養基中(購自Gibico公司)，離心收集1×107個細胞，應用蛋白酶K和苯酚從細胞中分離基因組DNA(具體操作見分子克隆實驗指南)。
2.設計合成引物上游引物5’-CCGACGCGTAGATCTAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’，下游引物5’-CCGACGCGTCTCGAGGAATTCGGATCCGTCGACAAAAAGAAGACCACGGTGTTTCGTCCTTTC-3’(2OD，上海申能博彩合成)，上游引物中依次引入MluI和BglII酶切位點，下游引物中依次引入MluI，XholI，EcoRI，BamHI，SalI和BbsI酶切位點。用純凈水將引物調整到20μm濃度。
3.PCR擴增U6啟動子以293細胞基因組DNA為模板，用上述引物進行PCR反應。反應體系模板1μl(100ng/μl)，上下游引物各1μl，dNTP(10mM)2μl，PCR緩沖液5μl，pfu酶0.5μl(10U/μl)，純凈水39.5μl；反應條件96℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，35個循環，PCR儀購自BioRad，PCR反應用試劑均購自上海申能博彩公司。PCR產物回收，膠回收試劑及回收柱購自上海申能博彩公司，具體操作見上海申能博彩膠回收試劑使用說明。共獲得回收產物20μl(100ng/μl)。回收產物用MluI(購自MBI)單酶切，反應體系PCR回收產物25μl(2.5μg)，MluI(5U/μl)2μl，Y緩沖液3μl，37℃反應3小時，再進行膠回收，操作同前。
二、本發明RNAi載體pGO的構建pEGFP-C2(購自CLONTECH公司)用BglII和BamHI雙酶切，反應體系PEGFP-C2載體4μl(1μg/μl)，BglII和BamHI各1μl(5U/μl)，Y緩沖液6μl，純凈水18μl，37℃3小時，酶切產物回收同前。酶切產物同尾酶自連，反應體系酶切回收產物8μl(50ng/μl)，連接緩沖液1μl，T4連接酶(T4連接酶購自上海申能博彩公司，下同)1μl，16℃過夜，連接產物轉化感受態DH5α細菌。在卡那霉素的平板上挑單菌落于5ml卡那霉素抗性LB培養液中搖菌過夜。小量提取質粒(具體操作方法見分子克隆實驗指南)，BglII單酶切鑒定，反應體系質粒2μl(0.5μg/μl)，連接緩沖液1μl，BglII(10U/μl)1μl，37℃3小時，1％瓊脂糖凝膠電泳，電壓90V，短波紫外燈下可見未被切成線形化的環狀質粒為陽性克隆。該陽性克隆的質粒用MluI單酶切，反應體系同前，膠回收，操作同前。將U6啟動子PCR酶切產物和改造的pEGFP-C2酶切線形產物連接及轉化，方法同前。
三、本發明RNAi載體pGO的鑒定1.酶切鑒定因U6啟動子是從改造的pEGFP-C2 MluI單酶切位點插入，須用酶切鑒定啟動子插入方向。因EcoRI酶切位點位于MluI酶切位點的3’方向，AgeI酶切位點位于U6啟動子上游，用AgeI和EcoRI雙酶切重組載體做鑒定，同時用AgeI和MluI雙酶切pEGFP-C2原始載體做參照，如重組載體酶切片段較參照的原始載體酶切片段大時，說明U6啟動子插入方向是正向的，如重組載體酶切片段較參照的原始載體酶切片段小時。則說明U6啟動子插入方向是反向的。
2.測序取正向插入U6啟動子的重組載體，用BglII和XhoI雙酶切反應體系質粒4μl(1μg/μl)，BglII(5U/μl)1μl，XhoI(5U/μl)1μl，R緩沖液3μl，純凈水21μl，37℃反應3小時，進行膠回收，操作同前。回收產物連入載體PbluescriptSK(-)(購自Stratagen公司)(載體酶切及回收操作同前)，連接體系目的片段9μl(50ng/μl)，載體3.5μl(50ng/μl)，緩沖液1.5μl，T4連接酶1μl，16℃過夜。連接產物轉化感受態DH5α細菌(感受態細菌制備見分子克隆實驗指南)，在氨芐青霉素平板上獲得的單克隆菌經初步酶切鑒定后送上海申能博彩公司測序，測序引物為T3，測序結果正確，U6啟動子全長為265個核苷酸，證實重組載體為pGO。
實施例2針對腫瘤相關基因β-catenin的RNA干擾一、RNA干擾片段的選取β-catenin是Wnt途徑的效應分子，該通路的異常激活與許多腫瘤的發生密切相關。我們依據文獻提供的經驗自http//www.ambion.com/techilb/misc/sirna finder.html，根據β-catenin基因設計了siRNA片段，核苷酸序列如下 其中反義序列在前，正義序列在后，兩端分別帶有Bbs I(ACCG)和BamH I(GATC)酶切位點的粘性末端，連接兩序列的環狀結構中包含有一個HindIII酶切位點(AAGCTT)，以便鑒定時使用。
二、RNA干擾片段的體外退火方法siRNA干擾片段由上海申能博彩公司合成(2OD)，溶于50μl純凈水中，互補雙鏈各取10μl混勻，放入100℃沸水中5分鐘，并讓其在水浴中自然緩慢冷卻至20℃，置-20℃保存。
三、RNA干擾片段與載體的連接及鑒定載體用BbsI和BamHI雙酶切，反應體系載體4μl(1μg/μl)，BbsI和BamHI各1μl(10U/μl)，Y緩沖液6μl，純凈水18μl，37℃3小時。酶切產物回收同前。將酶切回收的上述載體和退火的RNA干擾片段連接轉化，具體操作方法同前。轉化后的質粒用HindIII單酶切鑒定，如質粒可被切成線性，說明RNA干擾片段連入載體，HindIII酶切位點來自RNA干擾片段環狀結構上的酶切位點。將鑒定正確的干擾載體命名為pGO-β。參見圖1、2、3。
四、帶有catenin基因的真核細胞表達載體和干擾載體共轉染293細胞以2×105/孔的密度在24孔板上鋪293細胞，24小時后進行轉染操作。將帶有β-catenin基因序列的真核細胞表達載體pcDNA3.1-β-catenin和干擾載體pGO-β各200ng共轉染293細胞，轉染試劑使用Lipotamine(購自Invitrogen)，以空干擾載體pGO作為對照，具體操作步驟見Invitrogen公司脂質體轉染使用說明。轉染后48小時用1×SDS上樣緩沖液裂解細胞(1×SDS上樣緩沖液配方見分子克隆實驗指南)，細胞裂解液跑8％的SDS-PAGE，100V，2小時30分鐘，用半干轉膜儀(購自BioRad)將凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，轉膜條件100mA，2小時30分鐘。5％脫脂奶粉封閉1小時，一抗為β-catenin單抗(購自Santa Cruze公司)，二抗為帶有HRP標記的羊抗鼠抗體(購自華舜公司)，ECL顯影劑(購自Santa Cruze公司)顯影，顯影膠片購自AFGA公司。結果參見圖4。如圖所示，pcDNA3.1-β-catenin與空干擾載體pGO共轉染293細胞后可見到較高水平的β-catenin表達，而pcDNA3.1-β-catenin與干擾載體pGO-β共轉染后，β-catenin表達水平顯著降低，但作為內參照的β-actin表達不受影響，說明pGO-β可有效并特異的抑制β-catenin基因的表達。圖上顯示EGFP的表達量相同則說明pGO及pGO-β的轉染用量一致，而且其表達與RNA干擾作用互不影響。
實施例3針對熒光素酶報告基因(Luciferase)的RNA干擾一、RNA干擾片段的選取針對熒光素酶報告基因的干擾靶序列根據文獻應用的已知有效片段設計(Genes & Development 16，948-958；2002) 反義序列在前，正義序列在后，兩端分別帶有Bbs I(ACCG)和BamH I(GATC)酶切位點的粘性末端，連接兩序列的環狀結構中包含有一個HindIII酶切位點(AAGCTT)，以便鑒定時使用。
二、RNA干擾片段的體外退火方法(具體操作同前)載體用BbsI和BamHI雙酶切并回收，RNA干擾片段體外退火與載體連接及鑒定(具體操作同前)，干擾載體命名為pGO-FF。
三、熒光素酶基因和干擾載體共轉染HepG2細胞以1×105/孔的密度在24孔板上鋪HepG2細胞，24小時后進行轉染操作。干擾載體pGO-FF及空載體pGO(作為對照)600ng，分別與熒光素酶基因載體pGL3-SV40(200ng)和pRL-TK(20ng)(熒光素酶基因載體購自Promega)共轉染HepG2細胞，轉染具體操作同前。轉染后24小時觀察到EGFP的表達；48小時用雙熒光素酶報告系統試劑(購自Promega)檢測針對熒光素酶的RNA干擾情況，具體操作見Promega雙熒光報告系統試劑使用說明，對熒光素酶報告基因的檢測顯示共轉染pGO-FF使報告基因活性下降約80％，參見圖5。從圖5A看出，轉染后24小時后根據EGFP的表達可以方便的分辨出被轉染細胞，并說明pGO及pGO-FF的轉染用量一致；從圖5B看出共轉染pGO-FF后可以使熒光素酶活性下降約80％，提示pGO-FF能夠顯著抑制熒光素酶報告基因的表達。由此可見，本發明的RNAi載體pGO具有綠色熒光蛋白示蹤和真核細胞的抗性篩選標記，并能夠有效抑制目的基因表達，故可用于制備治療腫瘤的藥物或用于制備研究基因功能的試劑。
權利要求
1.一種RNAi載體pGO，包括pUC復制起點pUC ori、fl復制起點fl ori、細菌啟動子P、卡那霉素基因Kan、HSV-TK PolyA、U6啟動子U6 promoter和多克隆位點MCS，其特征在于還含有用于表達綠色熒光蛋白基因的轉錄元件，包括CMV啟動子CMV promoter、增強綠色熒光蛋白基因EGFP和SV40 PolyA，以及用于表達真核細胞抗性篩選標志的新霉素基因轉錄元件，包括SV40早期啟動子SV40epromoter和新霉素抗性基因Neo。
2.權利要求1所述RNAi載體pGO在制備基因功能研究試劑和抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫藥分子生物學技術領域，是一種可用于特異性抑制靶基因表達的具有綠色熒光蛋白示蹤和真核細胞抗性篩選標記的RNA干擾(RNAi)載體pGO。本發明RNAi載體pGO是對pEGFP－C2載體的改造，去除了其原有的多克隆位點，在SV40 polyA和fl原核復制起點之間插入帶有相應多克隆位點的U6啟動子構成。只要在U6啟動子下游的多克隆位點中的適當位點插入針對靶基因的siRNA模板，轉染細胞后就可特異并有效地抑制該基因的表達。因而本發明的RNAi載體pGO可用于制備研究基因功能的試劑或用于抗腫瘤藥物的研究和開發。
文檔編號A61P35/00GK1539979SQ20031010814
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月24日 優先權日2003年10月24日
發明者王紅陽, 鄢和新, 張瑞, 陳磊, 吳孟超 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學