一種冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌及其制備方法和應用，是以冰城鏈霉菌BC-109-6為出發菌株，進行milD基因和nanLD基因的阻斷，構建冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌，用所述基因阻斷突變菌發酵生產米爾貝霉素A3/A4。本發明提高了米爾貝霉素A3/A4的產量，阻斷了影響米爾貝霉素A3/A4分離純化的雜質的生物合成，降低了生產成本，提高了經濟效益。
【專利說明】一種冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]米爾貝霉素屬于十六元環大環內酯類抗生素，與阿維菌素具有相似的結構。米爾貝霉素最初由日本科學家從土壤放線菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus的發酵液中分離得到，比目前使用最廣泛的生物農藥阿維菌素殺螨活性略高，而對大鼠的毒性比阿維菌素低40倍。因此，米爾貝霉素被美國環保署認定為危險性小的殺蟲劑，被荷蘭批準成為“GN0”(作物生產中的天然產物)，屬于生態友好型農藥，適用于有機農業害蟲綜合防治，被認為是當今世界上最優良的殺螨劑。米爾貝霉素已在美國、日本等43個國家和地區登記，用于蘋果、柑橘、草莓、茶葉等24種植物上對阿維菌素、有機磷農藥產生抗性的螨、斑潛蠅、蚜蟲、粉虱的防治。在米爾貝霉素系列藥物中，米爾貝霉素A3/A4具有較強的殺蟲活性。因此，目前米爾貝霉素產品的商業化大多圍繞米爾貝霉素A3/A4而進行。除Milbemectin(米爾貝霉素A3和A4的混合物)被用于殺螨劑外，米爾貝霉素A3/A4的I虧化物Milbemycin oxime也已商品化用于獸藥,可有效預防犬心絲蟲癥及驅除腸道內的寄生蟲(蛔蟲、鉤蟲和鞭蟲)。
[0003]冰城鏈霉菌Streptomyces bingchenggensis是本實驗室從土壤中分離得到的米爾貝霉素產生菌。與其它米爾貝霉素產生菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus 和 Streptomyces griseochromogenes 一樣，冰城鏈霉菌 Streptomycesbingchenggensis除了產生米爾貝霉素A3/A4外，還產生其它米爾貝霉素系列化合物及其它的次級代謝產物。通過對Streptomyces bingchenggensis進行選育，我們獲得了一株米爾貝霉素 A3/A4 高產菌株 Streptomyces bingchenggensis BC-109-6 (Xiang-JingWang, Xiao-Chong Wang, Wen-Sheng Xiang.1mprovement of milbemycin-producingStreptomyces bingchenggensis by rational screening of ultraviolet—andchemically induced mutants[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009，25:1051-1056)。雖然 Streptomyces bingchenggensis BC-109-6 中米爾貝霉素A3/A4的產量有了明顯的提高，但其還產生雜質化合物C5-0-甲基米爾貝霉素B2、B3、β I和β2以及南昌霉素。這些雜質化合物的生物合成一方面會降低米爾貝霉素Α3/Α4的產量，另一方面會嚴重影響米爾貝霉素Α3/Α4的分離純化。目前，冰城鏈霉菌Streptomycesbingchenggensis的全基因組測序已經完成,米爾貝霉素和南昌霉素的生物合成機制也已被闡明(Xiang-Jing Wang, Y1-Jun Yan, Bo Zhang, et al.Genome sequence of themilbemycin-producing bacteriumStreptomyces bingchenggensis[J].Journal of Bacteriology, 2010, 192:4526-4527)。因此，通過基因工程手段改造冰城鏈霉菌以提高米爾貝霉素A3/A4的產量和阻斷其它雜質的生物合成對于提高產值、降低生產成本具有重要的意義 。
【發明內容】
[0004]本發明提供一種冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌BCJ36，是以冰城鏈霉菌BC-109-6為出發菌株，進行miID基因和nanLD基因的阻斷，構建冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌。
[0005]所述冰城鏈霉菌Streptomyces bingchenggensis 是公開于 Xiang-JingWang,Xiao-Chong Wang, Wen-Sheng Xiang.1mprovement of milbemycin-producingStreptomyces bingchenggensis by rational screening of ultraviolet—andchemically induced mutants[J].World Journal of Microbiology andBiotechnology, 2009, 25:1051-1056 的冰城鏈霉菌 Streptomyces bingchenggensisBC-109-6ο
[0006]上述的milD基因是被敲除而阻斷的，nanLD基因是被外源基因插入而阻斷的，所述的外源基因優選的是硫鏈絲菌素抗性基因tsr。
[0007]冰城鏈霉菌已經進行了全基因組測序，基因組的登錄號是CP002047，milD基因是GenBank數據庫登錄號為CP002047的第1159758位到第1160618位所示的序列，nanLD基因是GenBank數據庫登錄號為CP002047的第10006136位到第10009168位所示的序列，tsr基因是GenBank數據庫登錄號為AY667410.1的第7240位到第8516位所示的序列。
[0008]該冰城鏈霉菌Streptomyces bingchenggensis的基因阻斷突變菌的米爾貝霉素A3/A4產量得到了提高，且雜質C5-0-甲基米爾貝霉素B2、B3、β?和β 2以及南昌霉素生物合成被阻斷。
[0009]本發明還提供了一種冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌的制備方法，包括以下步驟:
[0010]I)構建milD基因敲除質粒，其含有milD基因同源重組左臂和milD基因同源重組
右臂；
[0011]2)將步驟I)所得的milD基因敲除質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子；
[0012]3)將冰城鏈霉菌BC-109-6作為受體，與步驟2)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，得到冰城鏈霉菌的milD基因阻斷突變菌BCJ13 ；
[0013]4)構建nanLD基因中斷質粒，其含有nanLD基因同源重組左臂、標記基因和nanLD基因同源右臂；
[0014]5)將步驟4)所得的nanLD基因中斷質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子；
[0015]6)將冰城鏈霉菌的milD基因阻斷突變菌作為受體，與步驟5)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，即冰城鏈霉菌的milD基因和nanLD基因阻斷突變菌BCJ36。
[0016]上述步驟I)中的milD基因同源重組左臂片段的構建引物milD-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.1，引物 milD-L2 核苷酸序列如 SEQ ID N0.2。
[0017]上述步驟l)milD基因同源重組右臂片段的構建引物milD-Rl核苷酸序列如SEQID N0.3，引物milD-R2核苷酸序列如SEQ ID N0.4。
[0018]上述步驟4)中nanLD基因同源重組左臂片段的構建引物nan-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.5，引物 nan-L 核苷酸序列如 SEQ ID N0.6。
[0019]上述步驟4)中nanLD基因同源重組右臂片段的構建引物nan-Rl核苷酸序列如SEQ ID N0.7，引物 nan-R2 核苷酸序列如 SEQ ID N0.8。
[0020]本發明還提供了一種上述構建的基因阻斷突變菌用于制備米爾貝霉素A3/A4。[0021]所述應用方法，步驟如下:包括培養產米爾貝霉素A3/A4的冰城鏈霉菌的基因工程菌，從培養物中分離米爾貝霉素A3/A4。
[0022]本發明的有益效果如下:
[0023]1.本發明通過同源重組交換來阻斷冰城鏈霉菌中的milD基因和nanLD基因，考察了其功能并提高了米爾貝霉素A3/A4的產量。 [0024]2.阻斷了影響米爾貝霉素A3/A4分離純化的雜質的生物合成。
[0025]3.降低了生產成本，提高了經濟效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1是milD基因敲除質粒的構建示意圖。
[0027]圖2是nanLD基因中斷質粒的構建示意圖。
[0028]圖3是冰城鏈霉菌基因阻斷突變菌的構建策略示意圖；
[0029]((a)milD基因阻斷突變菌的構建；(b)milD基因阻斷突變菌BCJ13的PCR驗證，I:DNA Marker, 2:以冰城鏈霉菌BC-109-6基因組為模板的PCR結果，3:以milD基因阻斷突變菌BCJ13基因組為模板的PCR結果；(c) milD基因和nanLD基因阻斷突變菌的構建；(d) miID基因和nanLD基因阻斷突變菌BCJ36的PCR驗證，I:DNA Marker，2:以milD基因和nanLD基因阻斷突變菌BCJ36基因組為模板的PCR結果，3:以冰城鏈霉菌BCJ13基因組為模板的PCR結果)。
[0030]圖4是出發菌株冰城鏈霉菌BC-109-6和冰城鏈霉菌基因阻斷突變菌的發酵液的HPLC分析圖譜；
[0031]((a)冰城鏈霉菌BC-109-6 ;(b)milD基因阻斷突變菌BCJ13 ;(c)milD基因和nanLD基因阻斷突變菌BCJ36)。
【具體實施方式】
[0032]下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發明中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。
[0033]所使用的工具酶、DNA分子量標記、膠回收試劑盒、PUC19載體均購自大連寶生物公司，使用方法參考商品說明書。
[0034]大腸桿菌E coli DH5a、ET12567，購自上海鼎國生物技術有限責任公司。
[0035]引物由大連寶生物公司合成。
[0036]冰城鏈霉菌BC-109-6可從東北農業大學生物化工教研室取得。
[0037]質粒pKC1139為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，阿普拉霉素抗性對大腸桿菌和鏈霉菌均有選擇作用，鏈霉菌復制子為溫敏型，溫度高于34°C不能進行自主復制(參考文獻 Bierman M, Logan R, O ' Brien K, et al.Plasmid cloning vectors for theconjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp[J].Gene,1992， 116:43-49)。
[0038]實施例1:milD基因阻斷突變菌的構建
[0039]方法:[0040]l、milD基因敲除質粒的構建
[0041]利用引物milD-LKS' -CCAAGCTTTTCTCCTCGGTCGCGGGTCT-3;，下劃線為 HindIII位點)和 mi 1D-L2 (5' -GCTCTAGAGGTCATGGCACTCCGGTTGTT-3'，下劃線為 XbaI 位點)從冰城鏈霉菌基因組上PCR擴增得到milD基因同源重組左臂片段。
[0042]PCR反應的總體系為25 μ L，以I μ L的冰城鏈霉菌基因組DNA為模板進行反應。反應條件為:98°C Imin ；98°C IOs ；60.6°C 15s ；72°C Imin0 PCR產物上樣電泳后，回收長度為985bp的目的條帶。回收目的片段經HindIII和XbaI酶切后，與經HindIII和XbaI酶切后的PUC19載體連接，經測序驗證后命名為pBC1577。
[0043]利用引物milD-RKS'-GCTCTAGAGAGTGGGCGCAGATGAAC-3'，下劃線為 XbaI 位點)和 mi 1D-R2 (5' -CGGAATTCACCGCCGAGAACCACTACA-3'，下劃線為 EcoRI 位點)從冰城鏈霉菌基因組上PCR擴增得到milD基因同源重組右臂片段。
[0044]PCR反應的總體系為25 μ L，以I μ L的冰城鏈霉菌基因組DNA為模板進行反應。反應條件為:98°C Imin ；98°C IOs ；61°C 15s ；72°C lmin。PCR產物上樣電泳后，回收長度為1117bp的目的條帶。回收目的片段經XbaI和EcoRI酶切后，與經XbaI和EcoRI酶切后的PBC1577載體連接，經測序驗證后命名為pBC1397。
[0045]將pBC1397用HindIII和EcoRI進行酶切，酶切產物上樣電泳后，回收長度為
2.1kb的目的條帶。將回收片段與經HindIII和EcoRI酶切的pKC1139進行連接，經測序驗證后命名為PBC3784，即milD基因敲除質粒。milD基因敲除質粒的構建過程見圖1。
[0046]2、milD基因阻斷突變菌的構建
[0047]將pBC3784質粒轉化大腸桿菌ET12567，在含有阿普拉霉素(50μg/mL)的LB平板(參考文獻薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南[M]，第二版，北京:科學出版社，1992)上篩選轉化子ET12567/pBC3784。將轉化子ET12567/pBC3784接種于2mLLB液體培養基(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL,阿普拉霉素25 μ g/mL), 37°C振蕩培養過夜。次日以1:100的接種量轉接于新鮮的LB(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL，阿普拉霉素25 μ g/mL) 20mL,培養至0D600值0.2~0.4為佳。用50mL離心管離心去上清(Hitachi CR21G，轉子 R20A2，10, 000r/min, 15min), 10mL 新鮮 LB 洗滌細胞兩次，最后用0.1倍體積LB培養基(2mL)懸浮。刮取冰城鏈霉菌孢子制備濃度約為IO8個/mL的孢子懸液，離心后沉淀換用2X YT[2X YT培養基(g/L):胰蛋白胨16g，NaC15g，酵母提取物10g，pH7.0]培養基懸浮，取500 μ L于50°C水浴中熱激lOmin。取500 μ L的ET12567/pBC3784加入至500 μ L熱激后的孢子懸液中，混合并輕搖。離心去除大部分上清，懸浮殘余液體涂布MS平板(參考文獻Kieser T, Bibb M.Practical Streptomyces Genetics [Μ].Norwich: TheJohn Innes Foundation, 2000)，28°C倒置培養。16 ~20h 后在平板上鋪 ImL 含有 0.5mg 的萘啶酮酸及50 μ g阿普拉霉素的水溶液，液體被吸收后，繼續于28°C倒置培養。挑取結合子單菌落于新鮮的MS平板上富集培養，該平板含有(Img萘啶酮酸和50 μ g阿普拉霉素)/(mL培養基)。
[0048]3、milD基因阻斷突變菌的篩選及驗證
[0049]選取較快長出孢子的上述所得的結合子進行溫度誘導篩選及傳代收集孢子，制備孢子懸液，以每培養皿約100個孢子涂布于MS平板(參考文獻Kieser T1Bibb M.PracticalStreptomyces Genetics [Μ].Norwich: The John Innes Foundation, 2000),該平板含有50 μ g阿普拉霉素/ (mL培養基)的阿普拉霉素，28°C培養48~72h，觀察有小菌落長出后轉至39°C進行溫度誘導。約7~10天后發現39°C培養下已長出大量的孢子。由于質粒PBC3784含有pKC1139來源的溫度敏感型復制子，在高于34°C不能獨立復制，故在39°C生長的菌落應該是質粒進入菌體后通過與同源臂的交換整合入染色體的整合子。挑取整合子于無抗性的MS平板中28°C松弛培養，連續傳代，促使其發生雙交換。經連續傳代培養后，挑取同一個單菌落分別在有抗性與無抗性的MS平板上培養，篩選在無抗性平板生長而在抗性平板上不生長的菌落即為發生雙交換或回復突變的克隆。 [0050]挑取10株以上篩選出的菌株，提取其基因組DNA進行PCR驗證。上下游引物分別為 miID-Vl (5 ' -ATGCCACCCTCGGGTCCCTC-3 ')和 milD_V2(5' -AAGGGCGGCTACGGCTACGA-3' )。PCR 反應條件為:98°C lmin ；98°C IOs ；58°C 15s ；72 °C 3min。
[0051]同源重組示意圖如圖3a所示。只有質粒整合到基因組上發生雙交換后，以miID-Vl和mi 1D-V2為引物、突變菌基因組為模板PCR擴增，才能得到理論上miID基因已被敲除的大小為2.38kb的陽性條帶。而以miID-Vl和milD_V2為引物、起始菌株BC-109-6基因組為模板PCR擴增，得到的是帶有milD基因、大小為3.14kb的條帶。
[0052]結果:
[0053]從10株無抗性菌株中篩選得到I個雙交換突變株，命名為BCJ13，雙交換發生幾率較低。PCR產物的電泳結果見圖3b，PCR結果與理論相符。因此，菌株BCJ13為milD基因阻斷突變菌。
[0054]實施例2:milD基因和nanLD基因阻斷突變菌的構建
[0055]1、nanLD基因中斷質粒的構建
[0056]利用引物nan-Ll (5' -GCTCTAGATCGTTGCTGCGGGTCCAT-3'，下劃線為 XbaI 位點)和 nan-L2 (5 ' -CCAAGCTTCTACCCACGCCATCAACA-3 '，下劃線為 HindIII 位點)從冰城鏈霉菌基因組上PCR擴增得到nanLD基因同源重組左臂片段。PCR反應的總體系為25 μ L，以I μ L的冰城鏈霉菌基因組DNA為模板進行反應。反應條件為:98°C lmin ；98°C IOs ；58.5°C 15s ；72°C lmin。PCR產物上樣電泳后，回收長度為844bp的目的條帶。回收目的片段經HindIII和XbaI酶切后，與經HindIII和XbaI酶切后的pUC19載體連接，經測序驗證后命名為pBCN-1。
[0057]利用引物nan-Rl (5' -CGGAATTCGGATCACGGCGAGCACCTG-3'，下劃線為 EcoRI 位點)和 nan-R2 (5' -GCTCTAGACTGCCCGCCACCCTCACCTT-3'，下劃線為 XbaI 位點)從冰城鏈霉菌基因組上PCR擴增得到nanLD基因同源重組右臂片段。PCR反應的總體系為25 μ L，以I μ L的冰城鏈霉菌基因組DNA為模板進行反應。反應條件為:98°C lmin ；98°C IOs ；60.6 °C 15s ；72°C lmin。PCR產物上樣電泳后，回收長度為926bp的目的條帶。回收目的片段經XbaI和EcoRI酶切后，與經XbaI和EcoRI酶切后的pBCN_l載體連接，經測序驗證后命名為pBCN-2。
[0058]利用引物tsr I (5 ' -GCTCTAGAGGTCGCGGTCGGTGGTGA-3 '，下劃線為 XbaI 位點)和 tsr2 (5 ' -GCTCTAGAGACGATGAAGCCGTGGAAC-3 '，下劃線為 XbaI 位點)以質粒 pHZ358(參考文獻 Sun Y, Zhou X, Liu J, et al.' Streptomyces nanchangensis' , a producerof the insecticidal polyether antibiotic nanchangmycin and the antiparasiticmacrolide meiIingmycin, contains multiple polyketide gene clusters [J]..Microbiology, 2002, 148:361 - 371)為模板PCR擴增得到硫鏈絲菌素抗性基因盒tsr。PCR反應的總體系為25 μ L，以I μ L的質粒ρΗΖ358為模板進行反應。反應條件為:98°C lmin ；98°C IOs ；57.TC 15s ；72°C 75s。PCR產物上樣電泳后，回收長度為1.29kb的目的條帶。回收目的片段經XbaI酶切后，與經XbaI酶切后的pBCN_2載體連接，經測序驗證后命名為pBCN-3。 [0059]將pBCN-3進行HindIII/EcoRI酶切，酶切產物上樣電泳后，回收長度為3.06kb的目的條帶，將回收片段與經Hindlll/EcoRI酶切的pKC1139載體連接，經測序驗證后命名為PBC8559，即nanLD基因中斷質粒。nanLD基因中斷質粒的構建過程見圖2。
[0060]2、milD基因和nanLD基因阻斷突變菌的構建
[0061]將pBC8559質粒轉化大腸桿菌ET12567，在含有阿普拉霉素(50μg/mL)的LB平板(參考文獻薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南[M]，第二版，北京:科學出版社，1992)上篩選轉化子ET12567/pBC8559。將轉化子ET12567/pBC8559接種于2mLLB液體培養基(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL,阿普拉霉素25 μ g/mL), 37°C振蕩培養過夜。次日以1:100的接種量轉接于新鮮的LB(含氯霉素25 μ g/mL、卡那霉素25 μ g/mL,阿普拉霉素25 μ g/mL) 20mL,培養至0D600值0.2~0.4為佳。用50mL離心管離心去上清(Hitachi CR21G，轉子 R20A2，10, 000r/min, 15min), IOmL 新鮮 LB 洗滌細胞兩次，最后用0.1倍體積LB培養基(2mL)懸浮。刮取冰城鏈霉菌BCJ13孢子制備濃度約為IO8個/mL的孢子懸液，離心后沉淀換用2X YT[2X YT培養基(g/L):胰蛋白胨16g，NaC15g，酵母提取物10g，pH7.0]培養基懸浮，取500 μ L于50°C水浴中熱激lOmin。取500 μ L的ΕΤ12567/PBC8559加入至500 μ L熱激后的孢子懸液中，混合并輕搖。離心去除大部分上清，懸浮殘余液體涂布 MS 平板(參考文獻 Kieser T, Bibb M.Practical Streptomyces Genetics [Μ].Norwich:The John Innes Foundation, 2000), 28°C倒置培養。16 ~20h 后在平板上鋪 ImL含有0.5mg的萘啶酮酸及50 μ g阿普拉霉素的水溶液，液體被吸收后，繼續于28°C倒置培養。挑取結合子單菌落于新鮮的MS平板上富集培養，該平板含有(Img萘啶酮酸和50 μ g阿普拉霉素)/ (mL培養基)。
[0062]3、milD基因和nanLD基因阻斷突變菌的篩選及驗證
[0063]選取較快長出孢子的上述所得的結合子進行溫度誘導篩選及傳代收集孢子，制備孢子懸液，以每培養皿約100個孢子涂布于MS平板(參考文獻Kieser T1Bibb M.PracticalStreptomyces Genetics [Μ].Norwich: The John Innes Foundation, 2000),該平板含有50 μ g阿普拉霉素/ (mL培養基)的阿普拉霉素和15 μ g硫鏈絲菌素/ CmL培養基)的硫鏈絲菌素，28°C培養48~72h，觀察有小菌落長出后轉至39°C進行溫度誘導。約7~10天后發現39 V培養下已長出大量的孢子。由于質粒PBC8559含有pKCl 139來源的溫度敏感型復制子，在高于34°C不能獨立復制，故在39°C生長的菌落應該是質粒進入菌體后通過與同源臂的交換整合入染色體的整合子。挑取整合子于無阿普拉霉素抗性而有硫鏈絲菌素抗性的MS平板中28°C松弛培養，連續傳代，促使其發生雙交換。經連續傳代培養后，挑取同一個單菌落分別在有硫鏈絲菌素抗性與有阿普拉霉素抗性的MS平板上培養，篩選在有硫鏈絲菌素抗性平板生長而在有阿普拉霉素抗性平板上不生長的菌落即為發生雙交換或回復突變的克隆。[0064]挑取10株以上篩選出的菌株，提取其基因組DNA進行PCR驗證。上下游引物分別為 nanD-Vl (5 ' -ACTCCGCGTCGAAGTCCCC-3 ')和 nanD_V2(5' -GCGGTTTTGCGATTCAGGTAT-3' )。PCR 反應條件為:98°C lmin ；98°C IOs ；59°C 15s ；72 °C 3min。
[0065]同源重組示意圖如圖3c所示。只有質粒整合到基因組上發生雙交換后，以nanD-Vl和nanD_V2為引物、突變菌基因組為模板PCR擴增，才能得到理論上nanLD基因已被硫鏈絲菌素抗性基因盒tsr代替的大小為1.95kb的陽性條帶。而以nanD-Vl和nanD_V2為引物、起始菌株BCJ13基因組為模板PCR擴增，得到的是帶有nanLD基因、大小為3.39kb的條帶。
[0066]結果:
[0067]從10株無抗性菌株中篩選得到4個雙交換突變株，命名為BCJ36，雙交換發生幾率較低。PCR產物的電泳結果見圖3d，PCR結果與理論相符。因此，菌株BCJ36為milD基因和nanLD基因阻斷突變菌。
[0068]實施例3:起始菌株BC-109-6、基因阻斷突變菌BCJ13和BCJ36的發酵分析
[0069]方法:[0070]挑取菌株于高氏一號斜面28°C培養,培養6天后,接種于種子培養基(鹿糖10.0,酵母提取物5.0，蛋白胨3.5，脫脂奶粉1.0，K2HPO4 0.5 (g/1000mL)，ρΗ7.0)，然后置于28°C，250r/min條件下培養42h。取2.0mL的種子培養液轉接于25mL的發酵培養基(蔗糖80.0，黃豆餅粉 20.0，脫脂奶粉 1.0，CaCO3 3.0, K2HPO4 1.0, FeSO4.7Η20 0.1 (g/1000mL)，ρΗ7.2)中，28°C，250r/min培養8天。發酵液與等體積的甲醇混合浸泡12h，離心后取上清液做HPLC分析。HPLC條件，流動相A:乙腈:水:甲醇=350:50:100，流動相B:甲醇，梯度洗脫:15min內流動相B的濃度從O升至100%，流速:1.0mL/min，柱溫:25°C，檢測波長:242nm，進樣量:10 μ L,分析柱:N0VA-PAKR C18 (3.9 X 150mm, 5 μ m, Waters, Milford, MA)。
[0071]結果:
[0072]milD基因阻斷突變菌BCJ13、milD基因和nanLD基因阻斷突變菌BCJ36、起始菌株冰城鏈霉菌BC-109-6的發酵液的HPLC分析結果如圖4所示，可見:milD基因的敲除可中斷C5-0-甲基米爾貝霉素B2、B3、β I和β 2的生物合成，且米爾貝霉素Α3/Α4的產量有顯著的提高，單位產量達2237±54yg/mL，進一步阻斷nanLD基因可中斷南昌霉素的生物合成，且米爾貝霉素A3/A4的產量有進一步的提高，單位產量達2312±47μ g/mL，比起始菌株冰城鏈霉菌BC-109-6米爾貝霉素A3/A4的產量(1326±37 μ g/mL)提高了 74%。
【權利要求】
1.一種冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌，其特征在于，以冰城鏈霉菌BC-109-6為出發菌株，進行milD基因和nanLD基因的阻斷，構建冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌。
2.根據權利要求1所述基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的milD基因是被敲除而阻斷的，nanLD基因是被外源基因插入而阻斷的，所述的外源基因是硫鏈絲菌素基因tsr。
3.根據權利要求1所述基因阻斷突變菌，其特征在于，對冰城鏈霉菌BC-109-6進行改造，包括以下步驟: 1)構建miID基因敲除質粒，其含有miID基因同源重組左臂和miID基因同源重組右臂； 2)將步驟I)所得的milD基因敲除質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子； 3)將冰城鏈霉菌BC-109-6作為受體，與步驟2)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，即冰城鏈霉菌的mi ID基因阻斷突變菌； 4)構建nanLD基因中斷質粒，其含有nanLD基因同源重組左臂、標記基因和nanLD基因同源右臂； 5)將步驟4)所得的nanLD基因中斷質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子； 6)將冰城鏈霉菌的milD基因阻斷突變菌作為受體，與步驟5)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，得到冰城鏈霉菌的milD基因和nanLD基因阻斷突變菌。
4.根據權利要求1所述基因阻斷突變菌的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)構建miID基因敲除質粒，其含有miID基因同源重組左臂和miID基因同源重組右臂； 2)將步驟I)所得的milD基因敲除質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子； 3)將冰城鏈霉菌BC-109-6作為受體，與步驟2)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，即冰城鏈霉菌的mi ID基因阻斷突變菌； 4)構建nanLD基因中斷質粒，其含有nanLD基因同源重組左臂、標記基因和nanLD基因同源右臂； 5)將步驟4)所得的nanLD基因中斷質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子； 6)將冰城鏈霉菌的milD基因阻斷突變菌作為受體，與步驟5)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，得到冰城鏈霉菌的milD基因和nanLD基因阻斷突變菌。
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述步驟I)中的milD基因同源重組左臂片段的構建引物milD-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.1，引物milD_L2核苷酸序列如SEQ IDN0.2。
6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述步驟l)milD基因同源重組右臂片段的構建引物miID-Rl核苷酸序列如SEQ ID N0.3，引物milD_R2核苷酸序列如SEQ ID N0.4。
7.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述步驟4)中nanLD基因同源重組左臂片段的構建引物nan-Ll核苷酸序列如SEQ ID N0.5，引物nan_L核苷酸序列如SEQ ID N0.6。
8.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述步驟4)中nanLD基因同源重組右臂片段的構建引物nan-Rl核苷酸序列如SEQ ID N0.7，引物nan_R2核苷酸序列如SEQ ID N0.8。
9.一種發酵生產米爾貝霉素A3/A4的方法，其特征在于，以權利要求1所述冰城鏈霉菌的基因阻斷突變菌發酵生產米爾貝霉素A3/A4。
10.一種發酵生產米爾貝霉素A3/A4的方法，其特征在于，具體步驟如下:1)構建miID基因敲除質粒，其含有miID基因同源重組左臂和miID基因同源重組右臂； 2)將步驟I)所得的milD基因敲除質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子； 3)將冰城鏈霉菌BC-109-6作為受體，與步驟2)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，即冰城鏈霉菌的mi ID基因阻斷突變菌； 4)構建nanLD基因中斷質粒，其含有nanLD基因同源重組左臂、標記基因和nanLD基因同源右臂； 5)將步驟4)所得的nanLD基因中斷質粒轉化宿主細胞，獲得轉化子； 6)將冰城鏈霉菌的milD基因阻斷突變菌作為受體，與步驟5)所述的轉化子進行接合轉移，挑取同源重組雙交換子，得到冰城鏈霉菌的milD基因和nanLD基因阻斷突變菌； 7)以冰城鏈霉菌的milD基因和nanLD基因阻斷突變菌發酵生產米爾貝霉素A3/A4。
【文檔編號】C12N1/21GK103468625SQ201310409240
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】向文勝, 張繼, 王相晶, 安靜 申請人:東北農業大學