專利名稱：：一種基因組重排木霉菌及其制備及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于微生物領域，具體涉及一種產纖維素酶髙及降解玉米秸稈效果好的木霉菌基因組重排菌株、重排菌株的制備方法、固體發酵產酶的條件優化及該菌株降解玉米秸稈。
背景技術：
：纖維素(cellulose)是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物。同時，它也是地球上最豐富、最廉價的再生資源，纖維素是植物細胞壁的主要成分，約占植物干重的三分之--至二分之一，廣泛而大量地存在于自然界中，是地球上最為豐富的可再生的生物聚合物之一。有資料表明，全世界每年的植物體生成量達1500億噸千物質，其中纖維素及半纖維素的總量為850億噸。經過長期的研究，人們發現能夠降解和利用變性纖維素(如磷酸膨脹纖維素)，纖維素衍生物(如梭甲基纖維素)的微生物種類繁多，在真細菌、放線菌、部分酵母和高等真菌等很多主要的微生物類群中都有發現。但是，能合成組分齊全的纖維素酶體系，并向外分泌，水解天然纖維素材料的種類則相對有限，許多種細菌、放線菌以及擔子菌可在天然纖維素材料上生成，有很強的分解纖維素的能力，但胞外纖維素酶活往往很低，而多數纖維素降解真菌，特別是霉菌產生的纖維素酶都能分泌于體外。目前多數纖維素酶的研究都集中在胞外酶活較高的木霉屬(Trichoderma)的幾個種粉狀側孢(Sporitrichumpalverulentum)，腐皮鐮孢(Fusariumsolani)，繩狀青霉(Pencilliumfuniculosum)，曲霉屬(/1we/^i7:丄"s)，青霉屬(尸朋i'c"""/7)和枝頂孢霉(力ci"e卿/i'，)等霉菌和木腐菌菌株上。其中尤以木霉屬的產量居多，木霉(7>i'c/00^7^)屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、粘孢菌類，是一類普遍存在的絲狀真菌。霉菌是線狀的，對纖維素纖維的降解集中在纖維的端部，并不斷生長，由內向外消化纖維素，使其逐漸被分解破壞。里氏木霧(7>ic/70ofe/777ai-ee5e/)、康氏木霄(7>/c/oc/e/m3/rcw//g7'/)禾口纟錄色木霄(rr/c/wtfermflw'/7'ofe)等是木霉屬中產纖維素酶活性較高的菌種，特別是綠色木霉(7Wc/wt/e/77ia"r"d及其近緣的菌株，能產生三類纖維素酶，所產生的纖維素酶能分泌到菌體外，一般不聚集形成多酶復合體，但相互發生強烈的協同作用，破壞植物細胞壁，將植物纖維素分解為葡萄糖。Genomeshuffling技術是在傳統誘變基礎上，通過細胞融合技術，對誘變后的微生物細胞進行基因組重組，從而使具有正向突變的菌株將其優點結合在一起，進而提高微生物細胞的正向突變頻率及正向突變速度。隨著DNA改組等定向進化技術的發展，在90年代初美國加州的Maxgen公司Ste國er等人提出的Genomeshuffling技術的概念，這種技術是分子定向進化在全基因組水平上的延伸.它將重組的對象從單個基因擴展到整個基因組，因此，可以在更為廣泛的范圍內對菌種的目的性狀進行優化組合.進行基因組重排首先需要有一個含有各種不同正突變的基因組庫(例如通過經典的誘變育種得到目的性狀發生改進的不同的正突變菌株就構成了所需的基因組庫).隨后通過原生質體融合將這些正突變菌株的全基因組進行隨機重組，并篩選目的性狀得到進一歩改進的菌株來進行下----輪基因組重排，這樣，通過循環多輪的隨機重組可以快速、高效地選育出表型得到較大改進的雜交菌種.其具體操作過程是通過對出發菌株進行誘變，然后在模擬DNA重組的條件下對原生質體進行遞推式多次融合(recursiveprotoplast),最后篩選出具有多重正向進化標記的目標菌株。具體做法如下在采用遞推式原生質體融合對目標菌株進行融合的過程中，誘變，首先要進行原生質體的制備，然后模擬DNA改組的反應溫度條件對原生質體進行融合，然后在非選擇條件下再生；再生原生質體菌絲混合就構成了FL;Fl長成菌落，長出的菌落再被制備成為原生質體，同時用同樣的方法再進行融合再生，這一過程重復三、四次得到后代菌落；與對照相比，融合后代有效率達到60%、17%、2.5%,較之未融合前增加了40-105倍。這一過程中操作的方法與原生質體融合技術基本相同。例如，在Ying-XinZhang等人的研究中，以四株營養缺陷型的弗氏鏈霉菌為模型進行鏈霉菌之間的重組，實驗表明采用的原生質體融合是實現基因組重組的十分有效的辦法，重組有效率超過20%。檢測四株經多營養缺陷型的鏈霉菌的原生質體重組的后代發現，重組中含有兩個標記的重組后代為3%,含有三個標記的為0.04%,四個標記為0.00005%。在這一過程中，我們可以看到，后代中帶有多重正向進化標記重組子出現的幾率是采用原始誘變育種方法的40-105倍。這一結果將為多基因重組提供有效依據，使得我們可以通過DNA改組，，獲得含有多個親本遺傳信息的更有意義的子代。采用表型的篩選法，可以直接對已知或未知的代謝途徑進行快速優化、構建新的代謝途徑用于合成新化合物或降解毒害物質，極大地促進了代謝工程的進一步發展和應用。其優化范圍從單個蛋白，整個代謝途徑或前體供應途徑，到整個基因組。Genomeshuffling可以利用重組DNA技術對細胞的多種不同基因組進行定點改造和修飾，增加多基因重組的幾率，可以得到各種改造后的細胞組成多樣性的基因組庫，然后通過循環的基因組重排，篩選集多個改造基因于一體的細胞，這樣可以極大地加快工程菌株的構建進程，減少對菌株進行多個基因改造和組合的困難，并明確重組優化的原因或本質。基因組重排已經被證明是一種有效的、新穎的全細胞的進化方式，可以快速提高工業微生物的表型。這是在傳統育種、原生質體融合育種以及基因工程育種的基礎上對微生物育種技術的一次革命性的改進。原始菌株一綠色木霉和康寧木霉購自中科院微生物研究所，可以發酵產纖維素酶，但是這兩種木霉菌產酶能力有限，還不能達到工業生產的要求，通過傳統的誘變方法提高產酶能力的幅度不大，而基因工程的方法又不能克隆齊全的纖維素酶系。
發明內容-本發明提供一種基因組重排木霉菌及其制備及其應用。通過基因組重排技術手段，以解決原始菌株一綠色木霉產酶能力有限、不能達到工業生產要求的問題。在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNu.2360。保藏H期2008丄24,分類命名木霉。本發明所提供一種上述基因組重排木霉菌的制備方法包括下列歩驟(一)將原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉，分別采用PDA培養基進行純化，并進行形態學觀察，挑取生長較旺盛的菌落進行剛果紅培養基平板及固體發酵培養，測定纖維素酶活；(二)基因組重排-(1)原生質體制備與再生將純化后生長最旺盛產酶最高的綠色木霉AS3.3711和康寧木霉的孢子在水中稀釋至呈淺綠色，為(1~5)Xi0'個孢子，mr，將孢子懸浮液lml加入到盛有10Gml液體菌絲培養基的三角瓶中，瓶放到搖床中，振蕩培養，條件為28-30'C,200r/min，20-24h,在無菌條件下，將無菌條件下培養的菌絲經4層無菌擦鏡紙過濾，用無菌水沖洗兩次，再用高滲緩沖液清洗兩次，稱重后加入到50mL離心管中，將新配制好的酶液加入到50ml離心管中，加入量為菌絲重的2倍，29-32。C下振蕩培養180r/min，2-5h，用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲碎片，收集濾液置于離心管中，3000r/肌n離心lOnun收集原生質體，重新用該高滲緩沖液反復洗滌23次，用血球計數法確定原生質體溶液的濃度，并調至107個/ml;(2)原生質體初級誘變將步驟(1)制備的原生質體分別采用紫外線UV和甲基磺酸乙酯EMS兩種誘變方法進行誘變處理，涂布到再生培養基上再生，然后將再生菌株通過剛果紅培養基平板和固體發酵試驗，分別篩選得到經紫外線誘變的產纖維素酶比原始菌株增加1%以上的多株突變菌株--Tv-UV及Tk-UV和經甲基磺酸乙酯誘變的產纖維素酶比原始菌株增加1%以上的多株突變菌株一Tv-EMS及Tk-EMS;(3)多母本遞進式原生質體融合即基因組重排將步驟(2)得到的紫外線-UV和甲基磺酸乙酯-EMS誘變菌株按照步驟(1)分別制備原生質，并把各原生質體等體積混合后均分為兩組，一組置于功率15W的紫外燈下處理5-20min，另一組置于60。C水浴中處理30-120min完全滅活后，混合后3000rpm離心5min，棄上清，加入30"C預熱的PEG融合液lml,30"C保溫20min，4000rpm離心，用液體高滲緩沖液離心洗漆3次，并作適當稀釋，取200ul涂布于再生培養基上，29"C培養5-7天觀察長出菌落。將菌落接種到剛果紅培養基平板培養測透明圏，挑取透明圈與菌落比較大的進行固體發酵測定纖維素酶活。得到產酶量比原始菌株高2W的以上的突變菌株一T-Fl;將4個T-Fl菌株繼續步驟(3)進行下一輪的原生質體制備、滅活、融合與剛果紅培養基平板固體發酵試驗篩選，測定纖維素酶活，得到產酶量比T-Fl突變菌株高2%以上的突變菌株一T-F2;對上述獲得的F2菌株進行穩定性試驗、產酶量性質分析，獲得一株產纖維素酶最高的突變菌株T-F22,即本發明所述的基因組重排木霉菌菌株。本發明中平板篩選方法中包括纖維素剛果紅培養基K2HPO40.50g,MgSO4，0.25g，纖維素粉1.88g，剛果紅0.20g,瓊脂14.00g,明膠2.00g，加1。/。的微晶纖維素，蒸餾水1000ml,PH7.0。121。C滅菌20min，冷卻至50'C,倒平板。將重組菌點接種到纖維素剛果紅培養基平板中央，29。C培養3-5cl，測透明圈與菌落直徑并算出二者的比值；.固體發酵產酶試驗麩皮5.0g，K2HPO40.05g，硫酸銨0.125g，Tween-80O.lml蒸餾水12.5ml，pH5.5。28°C,150rpm進行需氧發酵培養，發酵84h，取樣測纖維素酶活。本發明所使用的方法以羧甲基纖維素鈉為底物，利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測定葡萄糖含量，從而測定纖維素酶活。本發明涉及一種固態發酵產纖維素酶的方法先將菌種活化，然后接種到種子培養基中擴大培養，再按接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0，發酵培養基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質量濃度1.5%2%和氮源為硫酸鈸質量濃度1.5%2%,發酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發酵于26。C3rC，發酵72h84h。本發明在對基因組重排木霉菌T-F22在固態發酵培養基的優化過程中，碳源為2%秸稈、2%麩皮、1%秸稈+1%麩皮、1%秸稈+0.5%麩皮+0.5%CMC-Na;氮源為硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、脲、酵母膏。進一步優選實施方案中，碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸銨；本發明最佳實施方案中碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸銨。進一步，本發明采用響應面分析方法，對本發明菌株木霉菌T-F22發酵培養基優化實驗，確定培養基中成分最佳濃度。本發明基因組重排木霉菌T-F22接種量為2%20%濃度。進一歩優選實施方案中接種量為5%15%濃度；本發明最佳實施方案中接種量為10%。本發明基因組重排木霉菌T-F22初始pH值為4.57.0左右。進一歩優選實施方案中初始PH值為5.06.0左右；本發明最佳實施方案中初始pH值為5.5。本發明基因組重排木霉菌T-F22發酵溫度26'C3rC。進一步優選實施方案中發酵溫度27'C30'C;本發明最佳實施方案中發酵溫度為28°C。本發明基因組重排木霉菌T-F22發酵時間24h108h，進一步優選實施方案中發酵時間72h84h;本發明最佳實施方案中發酵時間為84h。本發明所提供一種基因組重排木霉菌高效降解玉米秸稈的應用。本發明提供的基因組重排木霉菌T-F22菌株的特征如下分類命名為木霉亞種。特征描述為菌落在PDA平板上生長較快，菌絲層比較薄，呈叢束狀，初期為白色，平坦，中期產生分生孢子呈大小不同零星狀，外部被白色菌絲包裹，后期大小不同零星狀產孢區部分呈深綠色。該菌種具有較高纖維素酶酶活，經固態發酵條件優化，優化后的條件為接種量為10%濃度，發酵培養基中包括1%秸稈粉+1%麩皮的碳源和2%體積濃度的氮源，發酵曲的初始pH值為5.5左右，發酵于28'C29'C,發酵72h84h，其酶活是綠色木霉AS3.3711的1.5_2倍。在降解玉米秸稈的過程中，可將葉片的薄壁組織降解，使葉片分層并將細胞內組分釋放出來，只剩下表皮部分。本發明對每一輪突變菌株進行表型篩選(纖維素酶產量)，獲得多個親本突變株后進行基因組重排(genomeshuffling),使菌株的正突變特性高度組合，選育高產纖維素酶的優良菌株。解決了原始菌株一綠色木霉產酶能力有限的問題，能滿足工業生產的要求。圖1為重排木霉菌T-F22經10次傳代培養產酶量變化。圖2為重排木霉菌T-F22與原始菌株的形態比較。圖3為突變株與原始菌株的產酶能力的比較。圖4為重排木霉菌T-F22與原始菌株全細胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較。圖5為優化發酵條件響應面法立體分析圖。圖6為重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈產還原糖含量曲線。圖7為重排木霉菌T-F22與原始菌株降解玉米秸稈效果。如圖1所示，其中重排木霉菌T-F22固體培養基發酵84h，測定纖維素酶活。橫坐標表示重排木霉菌T-F22培養的次代數，縱坐標表示每代發酵產酶。如圖2所示，A為綠色木霉AS3.3711菌落形態，B為重排菌株T-F22菌落形態，C為康寧木霉菌落形態。如圖3所示，突變株與原始菌株固體培養基發酵84h，測定纖維素酶活。Tv表示原始菌株綠色木霉AS3.3711;Tk表示原始菌株康寧木霉；Tv-UV表示經紫外誘變的綠色木霉菌株；Tk-UV表示經紫外誘變的康寧木霉菌株；Tv-EMS表示經甲基磺酸乙酯誘變的綠色木霉菌株；Tk-EMS表示經甲基磺酸乙酯誘變的康寧木霉菌株；T-Fll-14表示第一輪改組菌株；T-F21-23表示第二輪改組菌株。如圖4所示，重排木霉菌T-F22與原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉進行全細胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較，M表示蛋白質marker;A表示重排木霉菌T-F22;B表示綠色木霉AS3.3711;C表示康寧木霉。綠色木霉AS3.3711和康寧木霉是同屬木霉屬，有很多相似條帶，重排木霉菌T-F22多數條帶與康寧木霉相同，也有3-4條特征帶只與綠色木霉AS3.3711相同，還有些條帶與綠色木霉AS3.3711亮度上也有差異。如圖5所示，從響應面立體分析圖中可知，當吐溫一80為0.3g和微晶纖維素為3.()g時，纖維素酶產量達到最大值127.496IU/ml。如圖6所示，重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈產還原糖含量曲線，還原糖含量隨培養天數的變化而波動，在第5天出現最低點。如圖7所示，A表示降解前的玉米秸稈;B表示綠色木霉AS3.3711降解后玉米秸稈;C重排木霉菌T-F22降解后玉米秸稈。具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例l、基因組重排技術選育木霉菌株(一)原始菌株的純化和形態學研究及產酶特性分析將原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉，分別采用PDA培養基進行純化，并進行形態學觀察，挑取生長較旺盛的菌落進行剛果紅培養基平板及固體發酵培養，測定纖維素酶活。纖維素剛果紅培養基K2HPO40.50g，MgS04，0.25g，纖維素粉1.88g，剛果紅0.20g，瓊脂14.00g,明膠2.OOg，加1。/。的微晶纖維素，蒸餾水1000ml，PH7.0。12rC滅菌20nun，冷卻至50'C，倒平板。將重組菌點接種到纖維素剛果紅培養基平板中央，29'C培養3-5d，測透明圈與菌落直徑并算出二者的比值；.固體發酵產酶試驗:麩皮5.0g，K2HPO40.05g，硫酸銨0.125g，Tween-80O.lml蒸餾水12.5ml，pH5.5。28'C，150rpm進行需氧發酵培養，發酵84h，取樣測纖維素酶活。本發明所使用的方法以羧甲基纖維素鈉為底物，利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測定葡萄糖含量，從而測定纖維素酶活。(二)基因組重排(1).原生質體制備與再生將純化后生長最旺盛產酶最高的綠色木霉AS3.3711和康寧木霉的孢子在水中稀釋至呈淺綠色，為(1~5)X10'個孢子'mr。將孢子懸浮液lmL加入到盛有100mL液體菌絲培養基的三角瓶中，瓶放到搖床中，振蕩培養，條件為28-3CTC,200r/min，20-24h，在無菌條件下，將無菌條件下培養的菌絲經4層無菌擦鏡紙過濾，用無菌水沖洗兩次，再用高滲緩液清洗兩次，該高滲緩沖液為0.6M的山梨糖醇，O.OlMTris-HC1PH值7.5,麵CaCl—,;稱重后加入到50mL離心管中，將新配制好的酶液加入到50mL離心管中，該酶液為0.5%溶壁酶+O.3%蝸牛酶+0.3%纖維素酶，加入量為菌絲重的2倍，29-32。C下振蕩培養180r/min,2-5h，用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲碎片，收集濾液置于離心管中，3()00r/阻n離心l()m':n收集原生質體，重新用高滲緩沖液反復洗滌23次，用血球計數法確定原生質體溶液的濃度，并調至10'個/ml。(2).原生質體初級誘變紫外線UV誘變:將步驟(1)制備好的原生質體調整濃度為107cfu/ml，取10ml原生質體置于滅過菌的帶磁力棒的培養皿(直徑90國)中，培養皿放置在磁力攪拌器載物臺上，開啟攪拌器，在預熱20min的紫外燈下(距離為30cm)邊照射邊攪拌，并計時。分別于2min，5min，10min,15min和20min各取2ml原生質體溶液，進行倍數稀釋后涂布于再生培養基上再生，29'C,培養箱避光培養，5天后觀察結果。將再生平板上長出的菌落點接種到纖維素剛果紅平板上，29'C，培養箱避光培養3d,挑取透明圈與菌落直徑比值較大的進行固體發酵，3d測定纖維素酶產量。獲得兩株產酶量較高的菌株--Tv-UVl和Tk-UVl。其中再生培養基為葡萄糖20.0g,蔗糖200g,瓊脂4.0g,(NH山SO,1.4g，KH2P042.Og,K3P044.Og,MgS047H200.3g，NaCl17.5g，CaCl20.3g，吐溫-800.lg，再加入礦質元素(mg/L).FeS047H205.Omg'MnS041.6mg,ZnS04.7H201.4mg,CoCl2HU2.0mg,定容至1000ml。甲基磺酸乙酯(EMS)誘變將步驟A制備好的原生質體調整濃度為i07cfu/ml，取10ml原生質體,向其中加入甲基磺酸乙酯使終濃度為1.0mol/L，分別于2min,5nun,l()min，15min和20min各取2ml原生質體溶液，3000r/min離心10min收集原生質體，重新用高滲緩沖液反復洗滌23次，倍數稀釋后涂布于原生質體再平板上，29'C,培養箱避光培養，5天后觀察結果。按紫外線誘變后篩選方法進行篩選，獲得兩株產酶量較高的菌株--Tv-EMS2和Tk-EMS2。(3).多母本遞進式原生質體融合即基因組重排將步驟(2)得到的4株紫外線-UV和甲基磺酸乙酯-EMS誘變菌株按照歩驟(1)分別制備原生質，并把各原生質體等體積混合后均分為兩組，一組置于功率15W的紫外燈下處理5-20min，另一組置于60。C水浴中處理30-120min完全滅活后，混合后3000rpm離心5min，棄上清，加入30T預熱的PEG融合液lml，該PEG制備方法是:70gPEG-4000溶于100mLddH2O中,1.034X105Pa滅菌20min，4'C保存，30"C保溫20min，4000rpm離心，用液體高滲緩沖液離心洗滌3次，并作適當稀釋，取2ml涂布于再生培養基上，29T培養7天觀察長出菌落。將菌落接種到剛果紅培養基平板培養測透明圈，挑取透明圈與菌落比較大的進行固體發酵測定纖維素酶活。獲得4株產酶量較高的菌株T-FllT-F12T-F13T-F14;將所得的4株F1菌株按同樣策略進行培養，原生質體制備，融合，再生后將菌落接種到剛果紅培養基平板培養測透明圈，挑取透明圈與菌落比較大的進行固體發酵測定纖維素酶活，獲得3株產酶量較高的F2菌株T-F21，T-F22，T-F23。(三)突變菌株的遺傳穩定性試驗將第二輪重排菌株分別進行PDA培養基傳代10次，對每一代菌株進行固體發酵產酶實驗，測定纖維素酶活(圖l)。基因組重排木霉菌T-F22經10次傳代培養，每一代菌株固體發酵產酶量沒有發生顯著變化，說明突變菌株具有很好的遺傳穩定性。實施例2:突變株與原始菌株的比較(1)突變株與原始菌株的形態的比較將重排菌株T-F22與原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉點接種到PDA上(圖2)，由圖可知，T-F22的生長速度介于原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉生長速度中間，且形態上處于零星分布，與原始菌株不同，大部分顏色與綠色木霉3.3711相似，零星的成熟部分與康寧木霉形態相似。(2)突變株與原始菌株的產酶能力的比較將經紫外線(Tv-UV1和Tk-UV1)，甲基磺酸乙酯(Tv-EMS2和Tk-EMS2)誘變的和第-輪重排，第二輪重排菌株與原始菌株分別經固體發酵，進行纖維素酶活測定(圖3)。比較產纖維素酶能力，經紫外線，甲基磺酸乙酯誘變的菌株產酶量較原始菌株區別不顯著；而重排菌株(T-Fll-14，T-F21-23)產酶能力較原始菌株有明顯提高。第二輪重排菌株提高更顯著。(3)第二輪重排菌株與原始菌株全細胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較將第二輪重排菌株與原始菌株進行全細胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖4)。由圖可見，重排菌株T-F22與原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉大多數蛋白電泳條帶在相同位置，也有個別條帶或與綠色木霉AS3.3711相同位置，或與康寧木霉相同位置。實施例3:固態發酵產纖維素酶的方法先將菌種活化，然后接種到種子培養基中擴大培養，再按接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0,發酵培養基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質量濃度1.5%2%和氮源為硫酸銨質量濃度1.5%2%,發酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發酵于26'C3rC,發酵72h84h。在對基因組重排木霉菌T-F22在固態發酵培養基的優化過程中，碳源為2%秸稈、2%麩皮、1%秸稈+1%麩皮、1%秸稈+0.5%麩皮+0.5%CMC-Na;氮源為硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、脲、酵母膏。進一步優選實施方案中，碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸鉸；本發明最佳實施方案中碳源為1%秸稈+1%麩皮氮源為硫酸銨。進一步，本發明采用響應面分析方法，對本發明菌株木霉菌T-F22發酵培養基優化實驗，確定培養基中成分最佳濃度。基因組重排木霉菌T-F22接種量為2%20%濃度。進一歩優選實施方案中接種量為5%15%濃度；本發明最佳實施方案中接種量為10%。基因組重排木霉菌T-F22初始pH值為4.57.0左右。進一步優選實施方案中初始pH值為5.06.0左右；本發明最佳實施方案中初始pH值為5.5。基因組重排木霉菌T-F22發酵溫度26'C3rC。進一步優選實施方案中發酵溫度27'C3(TC;本發明最佳實施方案中發酵溫度為28。C。基因組重排木霉菌T-F22發酵時間24h108h,進一步優選實施方案中發酵時間72h84h;本發明最佳實施方案中發酵時間為84h。培養基條件的優化在纖維素酶固體發酵中，培養基成分是重要的影響因素，特別是一些產酶促進劑對纖維素酶的產量起到很大的作用。因此，我們采用Placket-Burman設計(本領域常用的---種統計優化試驗設計法)方法對％1秸稈+1%麩皮、硫酸銨、大豆粉、吐溫一80、微晶纖維素、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂等營養物質進行優化，從而獲得產酶高的發酵培養基。(1)二水平試驗對基因組重排菌株T-F22,采用Placket-Burman設計(表l)表l.Placket-Burman設計<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>對％1秸稈+1%麩皮、硫酸銨、大豆粉、吐溫一80、微晶纖維素、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂等營養物質進行優化，考察各因素的主效應和交互效應的一級作用(表2)。利用SAS軟件進行分析，結果表明吐溫一80、微晶纖維素對基因組重排菌株T-F22產酶有顯著影響。表2Plackett-Burman實驗設計回歸分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(2)最陡爬坡試驗由回歸分析結果可知，％1秸稈+1%麩皮、(隨J大豆粉、CaCl2、Mg2S(V7H2O對產酶影響不顯著，按照SAS給定的最優水平配比。而吐溫一8()和微晶纖維素的濃度對基因組重組菌T-F22產纖維素酶影響顯著，且X4和X5的系數均為正數，說明同時升高吐溫一80和微晶纖維素的濃度對基因組重組菌T-F22產纖維素酶有積極的影響。以吐溫一80(XI)每次增加O.lg和微晶纖維素(X2)每次增加lg基本步長(Z),則最陡爬坡試驗設計及結果見表3。從表3可以看出，處理3的吐溫一80和微晶纖維素的濃度己在最優點附近，可以此濃度為中心點采用中心組合設計來對培養基作進一歩的優化(表3)。表3最陡爬坡試驗設計及其結果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>(3)中心組合設計和響應面分析根據爬坡試驗得到的中心點，對吐溫一80和微晶纖維素進行中心組合設計(表4和表5)。分析結果表明(表6)，模型極顯著(PO.l)，并且有很好的確定系數，RSq=0.9157這表明基因組重排木霉T-F22產纖維素酶量91.57%的可靠性可由模型來預測。并通過SAS9.0軟件對實驗數據進行回歸擬合，得二次方程為Yl=127.48+0.374637*X1+0.090538*X2-2.340004*X1*X1-2.275*X1*X2-2.065003*X2*X2由于方程的二次系數為負值，方程所代表的拋物面幵口向下，因而該方程有極大值。給出了模型的二維響應面(圖5)，證實了擬合面具有最大值。表4中心組合設計各因子及其編碼值<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表5中心組合設計及其結果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注各因子代碼中心化Xl-(Xl—O.1)/0.1x2=(X2-3)/l表6中心組合設計(CCD)回歸分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>用Mathematica對方程進行求導，可以得到模型的最大值，即最大纖維素酶產量。當吐溫一80為0.328g和微晶纖維素為2.91g時，纖維素酶產量達到127.496IU/ml。為了進一步驗證實驗結果，在優化的培養基條件下進行重復實驗3次，得到纖維素酶平均產量為127.01IU/ml，這證明實驗值和實際值之間具有良好的擬合性，優化模型可靠。實施例4:基因組重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈利用基因組重排木霉菌T-F22降解玉米秸稈，液體產酶培養基蛋白胨3.0g，酵母膏0.5g，麩皮5.0g，硫酸銨2.0g，磷酸二氫鉀4.0g，氯化鈣0.3g，硫酸鎂0.3g,Tween-800.2ml,蒸餾水定容1000ml。200ml培養基中加入2.Og玉米秸稈，并加入2ml經種子培養基預培養的重排木霉菌T-F22,28°C,150rpm培養，每隔24h測定還原糖含量(圖6),并設定對照。結果表明，培養基還原糖含量有變化，開始還原糖含量減少，說明菌體生長消耗還原糖；一段時間還原糖含量趨于不變，說明木霉菌T-F22降解玉米秸稈產生還原糖與菌體生長消耗還原糖的量持平，后幾天還原糖含量有所增加，說明菌體生長減慢，并伴有菌體自溶，需糖量減少，降解玉米秸稈產生還原糖增加，培養基的總還原糖量增加。9天后產看降解效果(圖7)，木霉菌T-F22降解后玉米秸稈，邊緣呈透明狀，相間部分呈鋸齒型。而原菌株綠色木霉AS3.3711降解后玉米秸稈無如此大的變化，木霉菌T-F22在降解玉米秸稈的過程中，可將葉片的薄壁組織降解，使葉片分層并將細胞內組分釋放出來，只剩下表皮部分。權利要求1.一種基因組重排木霉菌，其在中國微生物菌種保臧管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.2360。2、一種制備權利要求l所述基因組重排木霉菌株的方法，其包括如下步驟(一)將原始菌株綠色木霉AS3.3711和康寧木霉，分別采用PDA培養基進行純化，并進行形態學觀察，挑取生長較旺盛的菌落進行剛果紅培養基平板及固體發酵培養，測定纖維素酶活；(二)基因組重排(1)原生質體制備與再生將純化后生長最旺盛產酶最高的綠色木霉AS3.3711和康寧木霉的孢子在水中稀釋至呈淺綠色，為(1~5)乂107個孢子，ml—'，將孢子懸浮液lml加入到盛有100ml液體菌絲培養基的三角瓶中，瓶放到搖床中，振蕩培養，條件為28-30°C，200r/min，20-24h,在無菌條件下，將無菌條件下培養的菌絲經4層無菌擦鏡紙過濾，用無菌水沖洗兩次，再用高滲緩沖液清洗兩次，稱重后加入到50mL離心管中，將新配制好的酶液加入到50ml離心管中，加入量為菌絲重的2倍，29-32。C下振蕩培養180r/min，2-5h，用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲碎片，收集濾液置于離心管中，3000r/min離心10min收集原生質體，重新用該高滲緩沖液反復洗滌23次，用血球計數法確定原生質體溶液的濃度，并調至10'個/ml;(2)原生質體初級誘變將步驟(1)制備的原生質體分別采用紫外線UV和甲基磺酸乙酯EMS兩種誘變方法進行誘變處理，涂布到再生培養基上再生，然后將再生菌株通過剛果紅培養基平板和固體發酵試驗，分別篩選得到經紫外線誘變的產纖維素酶比原始菌株增加1%以上的多株突變菌株--Tv-UV及Tk-UV和經甲基磺酸乙酯誘變的產纖維素酶比原始菌株增加W以上的多株突變菌株一Tv-EMS及Tk-EMS:(3)多母本遞進式原生質體融合即基因組重排將步驟(2)得到的紫外線-UV和甲基磺酸乙酯-EMS誘變菌株按照歩驟(1)分別制備原生質，并把各原生質體等體積混合后均分為兩組，一組置于功率15W的紫外燈下處理5-20min,另一組置于60。C水浴中處理30-120min完全滅活后，混合后3000rpm離心5min,棄上清，加入30"C預熱的PEG融合液lml，30"C保溫20min，4000rpm離心，用液體高滲緩沖液離心洗滌3次，并作適當稀釋，取200ul涂布于再生培養基上，29"C培養5-7天觀察長出菌落。將菌落接種到剛果紅培養基平板培養測透明圈，挑取透明圈與菌落比較大的進行固體發酵測定纖維素酶活。得到產酶量比原始菌株高2先的以上的突變菌株一T-Fl;將4個T-Fl菌株繼續步驟(3)進行下一輪的原生質體制備、滅活、融合與剛果紅培養基平板固體發酵試驗篩選，測定纖維素酶活，得到產酶量比T-F1突變菌株高2%以上的突變菌株一T-F2;對上述獲得的F2菌株進行穩定性試驗、產酶量性質分析，獲得一株產纖維素酶最高的突變菌株T-F22。3、如權利要求1所述的基因組重排木霉菌在固態發酵產纖維素酶中的應用。4、根據權利要求3所述的基因組重排木霉菌在固態發酵產纖維素酶中的應用，其發酵過程為接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0，發酵培養基中包括1.5%2%質量濃度的碳源和1.5%2%質量濃度的氮源，發酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發酵于26'C3rC條件下進行需氧發酵培養，發酵72h84h。5、根據權利要求4所述的基因組重排木霉菌在固態發酵產纖維素酶中的應用，其特征在于碳源為2%秸稈、2%麩皮、1%秸稈+1%麩皮、1%秸稈+0.5%麩皮+0.5%CMC-Na;氮源為硫酸鉸、硝酸銨、蛋白胨、脲、酵母膏。6、根據權利要求5所述的基因組重排木霉菌在固態發酵產纖維素酶中的應用，其特征在于碳源為1%秸稈+1%麩皮；氮源為硫酸銨。7、根據權利要求6所述的基因組重排木霉菌在固態發酵產纖維素酶中的應用，其特征在于接種量為5%15%濃度，水料比為1.03.0,發酵培養基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質量濃度1.5%2%和氮源為硫酸銨質量濃度1.5%2%，發酵曲的初始pH值為4.57.0左右，發酵于26'C3rC條件下進行需氧發酵培養，發酵72h84h。8、根據權利要求7所述的基因組重排木霉菌在固態發酵產纖維素酶中的應用，其特征在于接種量為10%濃度，水料比為2.5，發酵培養基中包括碳源為1%秸稈+1%麩皮質量濃度2%和氮源為硫酸銨質量濃度2%，發酵曲的初始pH值為5.5，發酵于28'C條件下進行需氧發酵培養，發酵84h。9、權利要求1所述的基因組重排木霉菌在降解玉米秸稈中的應用。全文摘要本發明涉及一種基因組重排木霉菌及其制備及其應用。其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.2360。該菌株可用于固體發酵生產纖維素酶，對其固態發酵過程為接種量為5％～15％濃度，水料比為1.0～3.0，發酵培養基中包括1.5％～2％質量濃度的碳源和1.5％～2％質量濃度的氮源，發酵曲的初始pH值為4.5～7.0左右，發酵于26℃～31℃條件下進行需氧發酵培養，發酵72h～84h。在降解玉米秸稈的過程中，可葉片的薄壁組織降解，使葉片分層并將細胞內組分釋放出來，只剩下表皮部分。文檔編號C12N9/42GK101260371SQ200810050619公開日2008年9月10日申請日期2008年4月18日優先權日2008年4月18日發明者付永平,張發福,王丕武申請人:吉林農業大學