一種檢測cyp3a4基因多態性的試劑盒及方法

一種檢測cyp3a4基因多態性的試劑盒及方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測CYP3A4基因多態性的試劑盒及方法，屬于基因測序【技術領域】。所述試劑盒包括檢測用引物，即包括：CYP3A4基因第1～3外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4～7外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8～11外顯子的長片段擴增特異性上下游引物和CYP3A4基因第12～13外顯子的長片段擴增特異性上下游引物中的至少一對，以及與所述第1～3外顯子的長片段DNA、第4～7外顯子的長片段DNA、第8～11外顯子的長片段DNA以及第12～13外顯子的長片段DNA相對應的CYP3A4基因的各外顯子的上下游測序引物中的至少一對。本發明檢測時間短、工作量少。
【專利說明】—種檢測CYP3A4基因多態性的試劑盒及方法
【技術領域】[0001]本發明涉及基因測序【技術領域】，具體涉及一種檢測CYP3A4基因多態性的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]細胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP),又稱混合功能氧化酶(Mixed functionoxcidase)、單加氧酶(Monooxygenase)或藥物代謝酶,其廣泛分布于動物、植物和微生物體內。在哺乳動物的組織中已經發現有20多種同工酶，分為CYPl~4的4個家族。CYP3A型酶在體內占CYP450總量的70%，占肝內CYP450的30 %，參與60 %以上常用藥物在體內的代謝轉化。目前，在人體內己發現4種CYP3A~基因，即CYP3A4、CYF3A5，CYP3A7和CYP3A43，而其中CYP3A4是臨床上最重要的P450酶之一，參與代謝38個類別的150多種藥物的氧化代謝，約占全部藥物的50%，是許多藥物因相互作用發生不良反應的根源。CYP3A4是肝臟和胃腸道中主要的P450代謝酶，其活性表現為單態分布，在許多藥物和環境污染物的代謝中發揮著重要作用。研究表明，CYP3A4不僅在表達水平上具有顯著的個體差異，其底物的體內代謝也可相差10倍以上。編碼CYP3A4蛋白的基因位于染色體7q21.3—22.1，編碼區域包含13個外顯子和12個內含子，主要調控其轉錄及表達的結構區位于5端，長約27kb, CYP3A4基因多態性具體詳見CYP等位基因數據庫(http://www.cypalleles.k1.se)。到目前為止CYP3A4已有24個等位基因已經確定，不同種族間CYP3A4SNPs的發生頻率不同，如CYP3A4*3和*17僅在白種人中發現，CYP3A4*15只在黑種人中發現，而CYP3A4*16僅存在于日本人和墨西哥人中，在已發現的39個SNPs中，CYP3A4*4，*5，*6，*18，*19在中國人中已確定，它們的發生頻率分別為1.5 %，0.98 %，0.5 %，2 %和2 %。許多常用藥物是CYP3A4的強誘導劑或抑制劑，當CYP3A4作為誘導劑時，其與代謝底物合并用藥，能大大提高后者的代謝速率，從而可能使后者無法達到發揮藥效時的血藥濃度，降低后者的利用度或者無法達到治療效果。相反，當CYP3A4作為抑制劑時，它們與經CYP3A4代謝的藥物合并用藥時，會減少后者的代謝速率，導致后者的血藥濃度升高，可能引起不良反應。因此，通過檢測CYP3A4基因多態性，判斷CYP3A4酶的活性，為臨床用藥個體化提供指導依據。
[0003]現有技術中采用直接測序法檢測CYP3A4基因多態性，即首先采用PCR擴增不同的目的片段后，回收純化PCR產物，然后進行測序。
[0004]由于直接測序法的檢測時間過長，一般需要48個小時以上，使該檢測的效率降低，因此，為檢測CYP3A4基因多態性帶來不便。

【發明內容】

[0005]針對現有技術中檢測CYP3A4基因多態性的時間長、步驟繁瑣、需要多次PCR的問題，本發明的目的在于提供一種檢測CYP3A4基因多態性的試劑盒。
[0006]本發明的另一目的在于提供一種檢測CYP3A4基因多態性的方法。
[0007]為了解決現有技術檢測CYP3A4基因多態性時間長、步驟繁瑣、需要多次PCR的問題，本發明采用了以下技術方案:
[0008]一種檢測CYP3A4基因多態性的試劑盒，包括檢測用引物，所述檢測用引物包括:CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段擴增特異性上下游引物和CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段擴增特異性上下游引物中的至少一對，以及與所述第I~3外顯子的長片段DNA、第4~7外顯子的長片段DNA、第8~11外顯子的長片段DNA以及第12~13外顯子的長片段DNA相對應的CYP3A4基因的各外顯子的上下游測序引物中的至少一對，其中:
[0009]所述CYP3A4基因第I~3外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQID NO:1 所示；
[0010]所述CYP3A4基因第I~3外顯子長片段擴增特異性下游引物序列如序列表中SEQID NO:2 所示；
[0011 ] 所述CYP3A4基因第4~7外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQID NO:3 所示；
[0012]所述CYP3A4基因第4~7外顯子長片段擴增特異性下游引物序列如序列表中SEQID NO:4 所示；
[0013]所述CYP3A4基因第8~11外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5 所示；
[0014]所述CYP3A4基因第8~11外顯子長片段擴 增特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:6 所示；
[0015]所述CYP3A4基因第12~13外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7 所示；
[0016]所述CYP3A4基因第12~13外顯子長片段擴增特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:8 所示；
[0017]所述CYP3A4基因第I外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；
[0018]所述CYP3A4基因第I外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0019]所述CYP3A4基因第2外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0020]所述CYP3A4基因第2外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
[0021]所述CYP3A4基因第3外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0022]所述CYP3A4基因第3外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0023]所述CYP3A4基因第4外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示；
[0024]所述CYP3A4基因第4外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示；
[0025]所述CYP3A4基因第5~6外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 17所示；
[0026]所述CYP3A4基因第5~6外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 18所示；
[0027]所述CYP3A4基因第7外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 19所示；
[0028]所述CYP3A4基因第7外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 20所示；
[0029]所述CYP3A4基因第8外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 21所示；[0030]所述CYP3A4基因第8外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 22所示；
[0031]所述CYP3A4基因第9外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 23所示；
[0032]所述CYP3A4基因第9外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示；
[0033]所述CYP3A4基因第10外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 25所示；
[0034]所述CYP3A4基因第10外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 26所示；
[0035]所述CYP3A4基因第11外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 27所示；
[0036]所述CYP3A4基因第11外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 28所示；
[0037]所述CYP3A4基因第12外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 29所示；
[0038]所述CYP3A4基因第12外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 30所示；
[0039]所述CYP3A4基因第13外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 31所示；
[0040]所述CYP3A4基因第13外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 32所示。
[0041]在上述試劑盒中，作為一種優選實施方式，所述試劑盒還包括內參基因ACTB以及內參基因ACTB擴增引物，其中，
[0042]所述內參基因ACTB擴增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:33所示；
[0043]所述內參基因ACTB擴增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 34所示；
[0044]所述內參基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID N0:35所示。
[0045]在上述試劑盒中，作為一種優選實施方式，所述試劑盒還包括測序緩沖液。更有選地，所述測序緩沖液為Buffer緩沖液,所述Buffer緩沖液的pH為8.3。
[0046]在上述試劑盒中，作為一種優選實施方式，所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照，其中，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態性中的含389G>A突變位點的基因序列DNA樣品。
[0047]在上述試劑盒中，作為一種優選實施方式，所述試劑盒還包括各種PCR反應試劑或者各種PCR反應試劑的混合物；更優選地，所述各種PCR反應試劑包括:PCR預混合液、Mg2+、dNTPs dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌體的基因32編碼蛋白以及無RNase去離子水。
[0048]在上述試劑盒中，作為一種優選實施方式，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列以及內部陽性控制序列的擴增引物，其中:所述內部陽性控制序列如序列表中SEQ IDN0:36所示；所述內部陽性控制序列的擴增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:37所示；所述內部陽性控制序列的擴增引物的下游引物如序列表中SEQ ID N0:38所示。
[0049]在上述試劑盒中，各種優選實施方式可以任意組合。
[0050]一種檢測CYP3A4基因多態性的方法，包括如下步驟:
[0051]步驟一，提取受檢者基因組DNA ;
[0052]步驟二，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1和SEQID N0:2所示的CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段擴增特異性上下游引物或者如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段擴增特異性上下游引物，PCR擴增CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段DNA ；[0053]步驟三，對步驟二的PCR擴增產物進行凝膠電泳，并回收純化得到的CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段DNA ；
[0054]步驟四，以步驟三回收純化后得到的產物為模板，采用如序列表中SEQ IDN0:9和SEQ ID NO: 10所示的上下游引物、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的上下游引物、SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示的上下游引物、SEQ IDN0:15和SEQ ID NO: 16所示的上下游引物、SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 所示的上下游引物、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20所示的上下游引物、SEQ IDN0:21和SEQ ID NO:22所示的上下游引物、SEQ ID NO:23SEQ ID N0:24所示的上下游引物、SEQ ID N0:25和SEQ ID NO:26所示的上下游引物、SEQIDN0:27和SEQ ID NO:28所示的上下游引物、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30所示的上下游引物以及SEQ ID N0:31和SEQ ID NO:32所示的上下游引物中的至少一對相應的上下游測序引物進行測序反應；
[0055]步驟五，將步驟四得到的測序反應產物純化后上測序儀進行測序，將測得序列在NCBI核酸數據庫中進行比對分析以獲得CYP2D6基因多態性。
[0056]在上述方法中，作為一種優選實施方式，在所述步驟二中，所述PCR的反應條件如下:先經過95°C 3min;然后進入PCR循環，所述PCR循環為95 °C 30s, 57 °C 3.6min、72°C 3min，共35個循環；最后72°C IOmin0更優選地，所述PCR的反應液中部分組分及濃度如下:1 X 的 PCR 預混合液、Mg2+:2.5-4.0mM, dNTPs:0.2-0.4mM、dUTP:0.3-0.6mM、Taq 酶:0.2υ/μ L、BSA:1.25wt%、T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L。
[0057]在上述方法中，作為一種優選實施方式，在所述步驟四中，所述測序反應的條件如下:先98°C變性2min，然后進行PCR循環，PCR循環參數為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25個循環。
[0058]在上述方法中，作為一種優選實施方式，在所述步驟二中，所述PCR反應中還加入了如序列表中SEQ ID N0:36所示的內部陽性控制序列、如序列表中SEQ ID N0:37所示的內部陽性控制序列的擴增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID N0:38所示的內部陽性控制序列的擴增引物的下游引物。
[0059]本發明試劑盒及檢測方法的優點和效果如下:
[0060](I)敏感性高:可以同時檢測出目前報道的24種CYP3A4基因多態性，具體詳見CYP 等位基因數據庫(http://www.cypalleles.k1.se)。
[0061](2)特異性強:使用特異性引物擴增CYP3A4基因長片段序列，然后進行測序，對特定的分子進行識別，準確性高，特異性好、假陽性低，可達到直接測序法的準確度，甚至比直接測序法更準確。
[0062](3)簡便安全:操作簡單、安全，只需一次PCR擴增后可以同時進行多個外顯子測序檢測多態性，極大地減少了檢測環節，降低了污染的可能性。
[0063](4)全程監控:本發明實施例提供的試劑盒引入了內部陽性控制質量控制體系，對檢測過程進行全程質量監控，有效避免假陽性或者假陰性。
[0064](5)快速:速度快、高通量，只需一次性擴增CYP3A4基因長片段序列，而無需對CYP3A4基因每個外顯子進行擴增，極大地降低了勞動強度，節省了檢測時間，可在8小時內完成。[0065]本發明的試劑盒及方法，利用長片段PCR測序法快速、準確的檢測目前報道的24種CYP3A4基因多態性，有效杜絕了假陽性和假陰性的發生，用于經CYP3A4代謝的藥物的使用劑量的預測并且為藥物的選擇提供了重要的手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0066]為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0067]圖1是本發明實施例2提供的采用實施例1的試劑盒的長片段擴增引物對擴增受檢者外周血DNA PCR產物凝膠電泳結果，其片段大小預計的核酸片段大小一致，擴增結果對應為:第一條帶為Marker，第二條帶為CYP3A4第I~3外顯子引物擴增長片段，第三條帶為CYP3A4第4~7外顯子引物擴增長片段，第四條帶為CYP3A4第8~11外顯子引物擴增長片段，第六條帶為CYP3A4第12~13外顯子引物擴增長片段，第七條帶為陽性對照，第八條帶為陰性對照；
[0068]圖2是本發明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的CYP3A4基因第7外顯子上游測序引物進行測序后所得的結果，在第7外顯子核酸序列566堿基處發生了 566T>C，提示為CYP3A4基因多態性*17 ；
[0069]圖3是本發明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的CYP3A4基因第11外顯子上游測序引物進行測序后所得的結果，在第11外顯子核酸序列1088堿基處發生了 1088CXT，提示為CYP3A4基因多態性*11。
【具體實施方式】
[0070]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規方法，如按照常規實驗條件如SambiOOk等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。
[0071]實施例1.試劑盒的制備
[0072]1、內參基因ACTB以及CYP3A4基因的引物設計
[0073]根據基因序列ACTB基因序列和CYP3A4基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數據庫(NCBI)，其中ACTB基因ID為60，參考序列號為NG_007992.1，也可參見本發明序列表中SEQ ID N0:35 ;CYP3A4基因ID為1574，參考序列號為NG_008421.1，采用Primer5.0引物設計軟件分別設計內參基因ACTB和CYP3A4基因的特異引物，包括:CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段擴增特異性上下游引物，以及CYP3A4基因第I外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第2外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第3外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第4外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第5~6外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第7外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第8外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第9外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第10外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第11外顯子上下游測序引物、CYP3A4基因第12外顯子上下游測序引物和CYP3A4基因第13外顯子上下游測序引物，其中，如CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段擴增特異性上下游引物分別用于鑒別CYP3A4基因的CYP3A4*14型，CYP3A4基因第7外顯子上下游引物用于鑒別CYP3A4*17基因多態性，CYP3A4基因第11外顯子上下游引物用于鑒別CYP2D6*11等均為——對應關系，可以同時檢測出目前報道的24種CYP3A4基因多態性，其中，24種CYP3A4基因多態性具體詳見CYP等位基因數據庫(http://www.cypalleles.k1.se)。
[0074]通過上述引物設計得到:
[0075]CYP3A4基因第I~3外顯子長片段擴增特異性上游引物序列:5’ -TGGACTTGGGGTGCTAATCA-3’，如序列表中 SEQ ID NO:1 所示；
[0076]CYP3A4基因第I~3外顯子長片段擴增特異性下游引物序列:5’ -TGTGTGTGTGTAAAAACCCTGAC-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 2 所示；
[0077]CYP3A4基因第4~7外顯子長片段擴增特異性上游引物序列:5’-GGCTGTTGATGTTTAATCAACTCTG-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 3 所示；
[0078]CYP3A4基因第4~7外顯子長片段擴增特異性下游引物序列:5’-CAAATGTACTACAAATCACTGAACTG-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 4 所示；
[0079]CYP3A4基因第8~11外顯子長片段擴增特異性上游引物序列5’-AGCAAATAATTATACAACCACATGAC-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 5 所示；
[0080]CYP3A4基因第8~11外顯子長片段擴增特異性下游引物序列:5’ -GCTCCAGGTAAATTT TGCACA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 6 所示；
[0081]CYP3A4基因第12~13外顯子長片段擴增特異性上游引物序列:5’ -GTAAGAAACCCTAACATGTAACT-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 7 所示；
[0082]CYP3A4基因第12~13外顯子長片段擴增特異性下游引物序列:5，-AGGCCAGGATGTCTCTCCA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 8 所示；
[0083]CYP3A4基因第I外顯子上游測序引物序列:5’ -GCCCTGCTACTGGCTGCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:9所示；
[0084]CYP3A4基因第I外顯子下游測序引物序列:5’ -CGGCCTGAACATCTTTTTTG-3’，如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0085]CYP3A4基因第2外顯子上游測序引物序列:5’-TCGCTGTGACTTGATTTCTGT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0086]CYP3A4基因第2外顯子下游測序引物序列:5’-AAAACTTCAGACCTTCCCCCT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
[0087]CYP3A4基因第3外顯子上游測序引物序列:5’ -TGACAAGAGCTTCATCCCAA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0088]CYP3A4基因第3外顯子下游測序引物序列:5’-TCCCAATTAGAGGCAGGGTTA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0089]CYP3A4基因第4外顯子上游測序引物序列:5’-TTGGGCTCCAGCTGTAGAATA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 15所示；[0090]CYP3A4基因第4外顯子下游測序引物序列:5’-CCTGGACATTTTTTAGGCAAC-3’，如序列表中SEQ ID NO: 16所示；
[0091]CYP3A4基因第5~6外顯子上游測序引物序列:5’-AAGTGTTCCTGTTTAACACATTTTC-3’，如序列表中SEQ ID NO: 17所示;
[0092]CYP3A4基因第5~6外顯子下游測序引物序列:5’ -TCACTGGAATAACCCAACAGCA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 18所示；
[0093]CYP3A4基因第7外顯子上游測序引物序列:5’-GTGGATGAATTACATGGTGATTT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 19所示；
[0094]CYP3A4基因第7外顯子下游測序引物序列:5’ -GGAAGGATGGTAAAAAGGTGCT-3’，如序列表中SEQ ID NO:20所示；
[0095]CYP3A4基因第8外顯子上游測序引物序列:5’-GCTCCAGGTAAATTTTGCACA-3’，如序列表中SEQ ID NO:21所示；
[0096]CYP3A4 基因第 8 外顯子下游測序引物序列:5’ -AAAACATACAGGTAACTGCACTGA-3’，如序列表中SEQ ID NO:22所示；
[0097]CYP3A4基因第9外顯子上游測序引物序列:5’ -TCAGGAGCCACTTTCTGTCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:23所示；
[0098]CYP3A4基因第9外顯子下游測序引物序列:5’-TATGCCTGCATGCCTCTAGAA-3’，如序列表中SEQ ID NO:24所示； [0099]CYP3A4 基因第 10 外顯子上游測序引物序列:5’-CTCTTCATCTAAACTGTGATGCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:25所示；
[0100]CYP3A4 基因第 10 外顯子下游測序引物序列:5’-AGAGTCAGTGAAAGAATCAGTGATT-3’，如序列表中SEQ ID N0:26所示；
[0101]CYP3A4 基因第 11 外顯子上游測序引物序列:5’-CTTCATTAGTACTGCATGGACTGAG-3’，如序列表中SEQ ID NO:27所示；
[0102]CYP3A4 基因第 11 外顯子下游測序引物序列:5’ -AGCAAATAATTATACAACCACATGACTG-3’，如序列表中SEQ ID NO: 28所示；
[0103]CYP3A4基因第12外顯子上游測序引物序列:5’-TCTCAACAAGACTGAAAGCTCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:29所示；
[0104]CYP3A4 基因第 12 外顯子下游測序引物序列:5’-GGGCTTTACATGATGTTTTTGATG-3’，如序列表中SEQ ID NO:30所示；
[0105]CYP3A4基因第13外顯子上游測序引物序列:5’ -TCCCCTCAACACTGAAGGAGT-3’，如序列表中SEQ ID NO:31所示；
[0106]CYP3A4基因第13外顯子下游測序引物序列:5’ -CAATGCATGTACAGAATCCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:32所示；
[0107]內參基因ACTB擴增上游測序引物序列:5’ -CGATTTCTCGCAGCTCACCAT-3’，如序列表中SEQ ID NO:33所示；
[0108]內參基因ACTB擴增下游測序引物序列:5’ -AATACACACTCCAAGGCCGC-3’，如序列表中 SEQ ID NO:34 所示。
[0109]2、內部陽性控制序列及其引物的設計[0110]該內部陽性控制序列包含CYP3A4基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQ ID NO:36所示。
[0111]采用Primer5.0引物設計軟件并按照上述引物設計原則設計出上述內部陽性控制序列的上下游引物分別為:5’-GCGCGTGACACTGCTACATG-3’(如序列表中SEQ ID NO:37所示)、5’ -TCGAGTAGCTGAGACTGCGT-3’(如序列表中 SEQ ID N0:38 所示)。
[0112]3、試劑盒的組成及制備
[0113]本發明試劑盒組成如下:
[0114]①基因組DNA提取試劑:該提取試劑為本領域常用試劑，本實施例采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號:69504)中的試劑。
[0115]②引物:包括上述可以分別擴增CYP3A4基因第1~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子的長片段擴增上下游引物、上述CYP3A4基因第1、2、3、4、5~
6、7、8、9、10、11、12以及13外顯子測序上下游引物、上述內部陽性控制序列擴增上下游引物和內參基因ACTB擴增上下游引物。
[0116]③上述內參基因ACTB以及內部陽性控制序列。
[0117]上述引物序列、內部陽性控制序列和內參基因ACTB序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0118]④陰性對照和陽性對照:以去離子水為陰性對照，以含有CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態性中的含389G>A突變位點的基因序列DNA樣品為陽性對照；
[0119]陽性對照的制備:采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號:69504)快速提取已經確診的含有CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態性中的含389G>A突變位點的基因序列的0.5ml受檢者外周血基因組DNA，作為陽性對照。
[0120]⑤各種PCR反應試劑:PCR預混合液，本實施例中選用2 XPCR Premix (Qiagen公司，產品貨號:210212) ;Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、BSA (Albumin from bovine serum,牛血清白蛋白)、T4噬菌體的基因32編碼蛋白、無RNase去離子水。
[0121]⑥測序緩沖液,pH為8.3的Buffer緩沖液,其Buffer緩沖液的配制:1 μ IBigdye和 3 μ 15x 含 IOmM MgCl2 的 400mM Tris 溶液。
[0122]實施例2.用實施例1制備的試劑盒檢測CYP3A4基因多態性
[0123]以隨機檢測30例受檢者外周血標本結果為例。
[0124]用本發明的試劑盒檢測人群CYP3A4基因多態性的檢測流程為:首先獲取臨床受檢者外周血樣本，快速提取基因組DNA ;其次，先配制內參基因ACTB的PCR反應液，然后加入濃度均為2ng/l.! I內參基因ACTB序列和內部陽性控制序列各2 μ 1，進行PCR擴增，PCR結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠中進行電泳，查看PCR擴增情況。如果內參基因ACTB的PCR擴增產物中存在390bp和800bp左右的兩個條帶，提示整個檢測過程有效，如圖1所示，如果缺少一條或二條帶，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測。再次，如果通過內參基因ACTB的PCR結果證明檢測過程有效，則配制CYP3A4基因長片段擴增PCR反應液和陰性、陽性反應液，前者中加入2μ I提取的受檢者外周血基因組DNA，后者分別加入2μ I去離子水和陽性樣品DNA，并各加入濃度為2ng/ μ I內部陽性控制序列2 μ 1，進行PCR擴增，PCR擴增結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像，查看PCR擴增情況。受檢者外周血標本CYP3A4基因第1~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子擴增片段大小分別應為3780bp、4500bp、5210bp、4281bp左右，而且均有390bp左右條帶一個，陽性對照組為800bp和390bp左右條帶各一個，陰性對照組為390bp條帶I個，如圖1所示。
[0125]最后，回收純化PCR產物以得到受檢者CYP3A4第I~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子的長片段中的一個，將該DNA片段用于測序反應的模板，配制PCR測序反應液后進行PCR測序反應，將PCR測序反應物純化后上測序儀進行測序。
[0126]CYP3A4基因多態性的具體檢測步驟如下:
[0127]①受檢者外周血基因組DNA的抽提:采用實施例1試劑盒中的基因組DNA提取試劑按DNA抽提純化的方法快速提取0.5ml受檢者外周血基因組DNA。
[0128]②將上述提取的受檢者外周血基因組DNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算DNA的純度與濃度，用無菌去離子水調節抽提的DNA至相同濃度，置冰箱_20°C保存。
[0129]③將實施例1試劑盒中的內部陽性控制序列標準品和內參基因ACTB標準品分別稀釋至濃度為2ng/y I。
[0130]④內參基因ACTB的PCR擴增:
[0131]PCR反應體系為20 μ L，在該反應體系中各成分及終濃度如下:1Χ的PCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L)、Mg2+:3mM ； dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L ；內參基因ACTB上、下游引物均為:0.25pmol/yL;內部陽性控制序列上、下游引物均為:0.25pmol/ μ L ;內部陽性控制序列:0.3pmol/ μ L ;內參基因ACTB序列:0.2ng/ μ I ;其余為無RNase去離子水。
[0132]在ABI9700PCR儀器上進行PCR擴增，PCR反應程序為:先經過95° C3min，然后950C 30s, 570C 3.6min，72°C 3min，35 個循環，最后 72°C IOmin0
[0133]PCR擴增結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像，從電泳圖中可以看到存在390bp和SOObp左右的兩個條帶，提示整個檢測過程有效，因此可以進行以下操作。
[0134]⑤CYP3A4基因第I~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子長片段PCR擴增:
[0135]上述四個CYP3A4基因長片段的PCR反應體系均為20 μ L，在該反應體系中各成分及終濃度如下=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212，2XPCR Premix,10.0μ L) ；Mg2+:3mM ；dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌體的基因32編碼蛋白:lnmol/L ；CYP3A4基因第I~3外顯子、第4~7外顯子、第8~11外顯子或第12~13外顯子長片段擴增特異性上、下游引物均為0.25ρπι01/μ L ;內部陽性控制序列上、下游引物均為0.25ρπι01/μ L ;內部陽性控制序列:0.3pmol/yL ;受檢者外周血基因組DNA的用量為2 μ L ;其余為無RNase去離子水。
[0136]在CYP3A4基因第I~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子長片段PCR擴增的同時設置陽性對照和陰性對照，陽性對照和陰性對照的反應體系均為20 μ L，在該反應體系中各成分及終濃度如下:1Χ的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212，2XPCR Premix, 10.0μ L)；Mg2+:3mM ；dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4噬菌體的基因32編碼蛋白:lnmol/L ;內參基因ACTB擴增上、下游引物均為:0.25pm0l/y L ;內部陽性控制序列上、下游引物均為0.25pm0l/y L ;內部陽性控制序列:0.3pmol/yL ;陽性樣品或者陰性樣品的用量為2 μ L，其余為無RNase去離子水。
[0137]在ABI9700PCR儀器上進行PCR擴增，PCR反應程序為:先經過95°C 3min,然后95°C 30s, 57°C 3.6min，72°C 3min，35 個循環，最后 72°C IOmin0
[0138]PCR擴增結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像。如圖1所示。
[0139]⑥分別切取CYP3A4基因第I~3外顯子、第4~7外顯子、第8~11外顯子和第12~13外顯子長片段擴增PCR產物以及內部陽性控制序列PCR產物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴增的DNA片段。
[0140]⑦測序反應液的配制:取4口1 Buffer測序緩沖液，濃度均為2ng/μ I的步驟⑥回收純化得到的四個長片段DNA各I μ 1，再相對應地取濃度均為lpmol/ml的CYP3A4基因第1、2、3、4、5~6、7、8、9、10、11、12和13外顯子上下游測序引物各I μ I。
[0141]在ΑΒΙ9700儀器上先98°C變性2min，然后進行PCR循環，PCR循環參數為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，25個循環，擴增結束后設置4°C保溫。
[0142]⑧采用醋酸鈉/乙醇法純化步驟⑦的測序反應產物，按照ABI3130測序儀的操作說明進行測序。
[0143]⑨數據收集處理和分析:將所測得序列在NCBI核酸數據庫中進行比對分析，分析CYP3A4基因多態性，結果參見表1。
[0144]表1為長片段PCR測序法分析受檢者外周血基因組中CYP3A4基因多態性
[0145]
【權利要求】
1.一種檢測CYP3A4基因多態性的試劑盒，包括檢測用引物，其特征在于，所述檢測用引物包括:CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段擴增特異性上下游引物和CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段擴增特異性上下游引物中的至少一對，以及與所述第I~3外顯子的長片段DNA、第4~7外顯子的長片段DNA、第8~11外顯子的長片段DNA以及第12~13外顯子的長片段DNA相對應的CYP3A4基因的各外顯子的上下游測序引物中的至少一對，其中: 所述CYP3A4基因第I~3外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:1所示； 所述CYP3A4基因第I~3外顯子長片段擴增特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDN0:2所示； 所述CYP3A4基因第4~7外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:3所示； 所述CYP3A4基因第4~7外顯子長片段擴增特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所示； 所述CYP3A4基因第8~11外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:5所示； 所述CYP3A4基因第8~11外顯子長片段擴增特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:6所示； 所述CYP3A4基因第12~13外顯子長片段擴增特異性上游引物序列如序列表中SEQID NO:7 所示；. 所述CYP3A4基因第12~13外顯子長片段擴增特異性下游引物序列如序列表中SEQID NO:8 所示； 所述CYP3A4基因第I外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示； 所述CYP3A4基因第I外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 所述CYP3A4基因第2外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示； 所述CYP3A4基因第2外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示； 所述CYP3A4基因第3外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； 所述CYP3A4基因第3外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示； 所述CYP3A4基因第4外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示； 所述CYP3A4基因第4外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示； 所述CYP3A4基因第5~6外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 17所示； 所述CYP3A4基因第5~6外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 18所示； 所述CYP3A4基因第7外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 19所示； 所述CYP3A4基因第7外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 20所示； 所述CYP3A4基因第8外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 21所示； 所述CYP3A4基因第8外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 22所示； 所述CYP3A4基因第9外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 23所示； 所述CYP3A4基因第9外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示；所述CYP3A4基因第10外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 25所示； 所述CYP3A4基因第10外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 26所示； 所述CYP3A4基因第11外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 27所示； 所述CYP3A4基因第11外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 28所示； 所述CYP3A4基因第12外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 29所示； 所述CYP3A4基因第12外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 30所示； 所述CYP3A4基因第13外顯子上游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 31所示； 所述CYP3A4基因第13外顯子下游測序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 32所示。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內參基因ACTB以及內參基因ACTB擴增引物，其中， 所述內參基因ACTB擴增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 33所示； 所述內參基因ACTB擴 增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:34所示； 所述內參基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO:35所示。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括測序緩沖液，優選地，所述測序緩沖液為Buffer緩沖液,所述Buffer緩沖液的pH為8.3。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照，其中，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態性中的含389G>A突變位點的基因序列DNA樣品。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括各種PCR反應試劑或者各種PCR反應試劑的混合物，優選地，所述各種PCR反應試劑包括:PCR預混合液、Mg2+(t匕如氯化鎂)、dNTPs、dUTP、Taq酶、牛血清白蛋白、T4噬菌體的基因32編碼蛋白以及無RNase去離子水。
6.根據權利要求1-5任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列以及內部陽性控制序列的擴增引物，其中: 所述內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO:36所示； 所述內部陽性控制序列的擴增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:37所示；所述內部陽性控制序列的擴增引物的下游引物如序列表中SEQ ID N0:38所示。
7.一種檢測CYP3A4基因多態性的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，提取受檢者基因組DNA ； 步驟二，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2所示的CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、如序列表中SEQID N0:3和SEQ ID NO:4所示的CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段擴增特異性上下游引物、如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段擴增特異性上下游引物或者如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段擴增特異性上下游引物，PCR擴增CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段DNA ； 步驟三，對步驟二的PCR擴增產物進行凝膠電泳，并回收純化得到的CYP3A4基因第I~3外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長片段DNA ； 步驟四，以步驟三回收純化后得到的產物為模板，采用如序列表中SEQ IDN0:9和SEQID NO: 10所示的上下游引物、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的上下游引物、SEQ IDNO: 13和SEQ ID NO: 14所示的上下游引物、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO: 16所示的上下游引物、SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18所示的上下游引物、SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20 所示的上下游引物、SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22所示的上下游引物、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO: 24所示的上下游引物、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26所示的上下游引物、SEQ IDNO: 27和SEQ ID N0:28所示的上下游引物、SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30所示的上下游引物以及SEQ ID N0:31和SEQ ID NO:32所示的上下游引物中的至少一對相應的上下游測序引物進行測序反應； 步驟五，將步驟四得到的測序反應產物純化后上測序儀進行測序，將測得序列在NCBI核酸數據庫中進行比對分析以獲得CYP2D6基因多態性。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述PCR的反應條件如下:先經過95°C 3min ;然后進入PCR循環，所述PCR循環為95°C 30s,57°C 3.6min、72°C 3min，共 35 個循環；最后 72°C IOmin0
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟四中，所述測序反應的條件如下:先98°C變性2min，然后進行PCR循環，PCR循環參數為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25個循環。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述PCR反應中還加入了如序列表中SEQ ID N0:36所示的內部陽性控制序列、如序列表中SEQ ID N0:37所示的內部陽性控制序列的擴增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID N0:38所示的內部陽性控制序列的擴增引物的下游引物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468814SQ201310433222
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】劉輝 申請人:劉輝