一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用植物來源的多種微生物混合發酵生產安全、高生物量的乳酸菌產品的方法，屬于生物工程領域。本發明所述乳酸菌產品的發酵生產方法中發酵菌種由干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母組成的混合菌種。本發明中將混合菌種依次經一次擴大培養、二次擴大培養后以10%－15%的接種量應用于乳酸菌產品的大規模生產，其合理利用了微生物之間的共生作用，發酵中采用的發酵菌種可控性更強，且最終獲得的產品的生物量更高，因此獲得的乳酸菌產品應用于動物養殖時，產品更加安全高效，適合在農業生產中廣泛應用。
【專利說明】一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程領域，涉及一種生物產品的發酵方法，具體涉及一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法。
【背景技術】
[0002]微生物在農業上的作用已逐漸被人們所認識。農業上用的微生物產品根據產品表現形式可分為發酵液和凍干粉，用于動物和水產養殖，起到改善動物腸道環境，促進消化吸收，提高免疫能力，促進快速生長，減少藥物使用，避免獸藥殘留等作用；用于農業種植，其優點為成本低，應用效果好，不污染環境，使用后不僅增產而且提高或改善農產品品質，減少化肥用量。研究表明，以雙歧桿菌為例，益生菌能起到防病抗病的保健作用與機體攝取的量有直接關系，這就對以防病抗病為目的的益生菌產品的生物含量有了一定的要求，在機體攝取同樣產品數量時，生物含量越高的產品，所能起到的防病抗病等保健效果越明顯。
[0003]乳酸菌是一類能夠發酵碳水化合物(主要指葡萄糖)產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱。它們廣泛分布于自然界，人類對乳酸菌種類及作用的認識是從19世紀末開始的。
[0004]隨著人們對乳酸菌的認識，乳酸菌在工業中也有著越來越廣泛的應用。如在飼料工業，由于乳酸菌生長繁殖可抑制腐敗微生物的生長，并可提高飼料的營養，增加飼料的風味，增進禽畜的食欲而被廣泛應用于發酵飼料。在醫藥工業中，乳酸菌能夠抑制腸道致病菌，乳酸菌制成的活菌制劑可治療腸道功能紊亂，維持腸道菌群平衡，治療泌尿生殖系統感染，降低膽固醇，控制內毒素，延緩機體衰老，抗腫瘤，并且能夠提供某些維生素和氨基酸，同時通過發酵產酸促進鈣、磷、鐵等礦物質的吸收和利用等。
[0005]傳統的農用微生物菌劑、`生物有機肥多采用自然發酵獲得，這種發酵過程隨環境條件、季節變換、菌種來源等條件的不同，發酵初始菌種在組成上有所不同，不同生物之間存在拮抗作用，在發酵過程中有益的菌種很難達到一個相當高的水平，影響產品有效生物含量，進而影響產品的作用效果；并且發酵過程缺少控制，容易茲生雜菌產生毒害物質，嚴重影響產品的使用效果并且產生潛在的安全隱患。因此如何提高乳酸菌產品的安全性和生物量仍然是橫亙在現代農業科學家面前的一個亟需解決的難題。
[0006]采用已鑒定的兩種以上分離純化的微生物作為菌種，對同種培養基進行發酵，也有人將此稱為限定混合發酵。混合發酵能獲得一些獨特產品，而純種發酵很難做到。利用它們的互利關系，使混合菌種取長補短，發揮各自優勢，生產出成本低、質量優的產品或多種產品。混合的多種菌株，增加了發酵中許多基因的功能。通過不同代謝能力的組合，完成單個菌種難以完成的復雜代謝作用，可以代替某些基因重組工程菌株，進行復雜的多種代謝反應，或促進生長代謝、提高生產效率。
[0007]酵母菌及其菌體本身都有很高的利用價值，酵母菌體含有豐富的蛋白質，且氨基酸比例接近聯合國糧農組織(FAO)推薦的較為理想的氨基酸組成值。酵母菌被廣泛應用于食品工業、飼料工業及生物制藥業。在生物制藥業，由于酵母菌體中水溶性維生素和麥角甾醇(維生素D的前體物質)含量豐富，因此用紫外線照射酵母菌可以制成維生素D強化酵母片劑，供病弱缺鈣者服用，同時酵母制劑可調節人體消化系統的微生態環境，促進消化吸收。
【發明內容】
[0008]為了克服現有技術的不足，本發明提供一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法，它采用現代生物工程技術，通過將已經分離純化獲得益生菌株合理配伍成為混合發酵菌種，并利用生物共生作用進行協同發酵，最終生產得到高生物含量的安全的益生菌液。
[0009]為解決技術背景所存在的問題，本發明以生物量為評價指標進行共生菌株的篩選。 申請人:從多種產乳酸桿菌以及現有的益生菌種進行混合培養，發現其中3個純菌株，分別是干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、粉狀畢赤酵母(Pichia farinose),進行混合培養時,令人驚奇的是,三種菌株之間存在顯著的共生作用。將其混合培養時可以大幅度升高發酵液中的生物量。其中所述的三種菌株均為常規菌株，可以通過現有的菌株保藏機構獲得。
[0010]本發明采用以下技術方案:一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法，其主要包括如下步驟:
1)發酵菌種的制備:從菌種斜面分別刮取干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母，并使用生活飲用水將其配制成菌懸液，測定各菌懸液中菌種重量，然后按干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母菌種重量為2:2:1混合后制成菌懸液即得到混合發酵原菌種；
2)擴大培養:將混合發酵原菌種按10%- 15%的接種量接種于一級培養液中進行搖床發酵，控制發酵溫度為35 - 37°C，搖床發酵36 - 48h后得到一級發酵液；將一級發酵液按照10% — 15%的接種量接種于二次擴大培養液中，控制發酵溫度為30 — 32°C,發酵48 —60h后得到二級發酵液；`
3)乳酸菌產品的大規模生產:將二級發酵液按照10%- 15%的接種量接種于發酵培養基中，控制發酵溫度為30 - 32°C，發酵60 - 72h后得到本發明所述乳酸菌產品；
其中:所述步驟2)搖床發酵中搖床轉速優選為40 — 60r/min,所述菌懸液接種于一級培養液時總菌落數不低于1.5X108cfu/mL。菌落的數目可以通過分光光度計或顯微鏡計數方式計算得到，優選為通過分光光度計測定一定波長下吸光值的方法。
[0011]本發明上述發酵生產方法中，所述的一級擴大培養液、二級擴大培養液以及發酵培養基的配方相同，其配方為每1000mL中含有糖蜜80g，食鹽2g。
[0012]本發明上述發酵生產方法中，原菌種經過搖瓶和菌種桶先后兩次擴大培養，得到發酵菌種，按10% - 15%接種用于大生產，菌種桶裝量3000L，按此比例放大可得20000L —30000L 成品。
[0013]本發明還請求保護按照上述制備方法制備得到的乳酸菌產品。
[0014]本發明提供一種上述乳酸菌產品的應用，即所述乳酸菌產品在飼料工業中的應用。現有技術中，乳酸菌產品已經廣泛應用于飼料工業，本發明制備方法所獲得乳酸菌產品應用于飼料工業中時，不僅生產成本大大降低，而且質量安全可控，可以使動物機體的免疫力大大提升，其應用于飼料工業是更有優勢。
[0015]本發明還提供另一種所述乳酸菌產品的應用，即所述乳酸菌產品在醫藥工業中的應用。基于本發明產品的安全可控特性，所述的乳酸菌產品同樣可以被開發為醫藥產品。
[0016]本發明與現有技術相比，具有以下技術優勢:
I)傳統的乳酸菌制品為自然發酵，發酵過程中菌種組成隨環境條件、季節變換、菌種來源等條件變化而發生較大變化，并且發酵過程缺少控制，容易茲生雜菌產生毒害物質，嚴重影響產品的使用效果并且產生潛在的安全隱患。本發明通過有效菌種的合理配伍制得發酵菌種，屬限定混合發酵類型，終產品成分穩定，質量可控性強，產品更加安全。
[0017]2)本發明通過將三種純培養的菌種合理配伍后進行限定混合發酵，發現三種菌種在發酵過程中體現出了明顯的共生關系，使得最終產品的生物量大大提高，與三種菌種分別單獨發酵提高3 - 4倍，使得產品更加高效，應用于動物飼養時大大降低了飼養成本。
[0018]3)限定混合發酵時可以取長補短，發揮各自優勢，能獲得一些純種發酵很難得到的質量更優的獨特產品。該產品運用過程中既有利于降低貨物運輸、養殖生產成本，又可以顯著改善動物的攝食量和機體免疫能力。
【具體實施方式】
[0019]本發明以生物量為評價指標進行共生菌株的篩選。 申請人:從多種產乳酸桿菌以及現有的益生菌種進行混合培養，發現其中3個純菌株，分別是干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母，進行混合培養時，令人驚奇的是，三種菌株之間存在顯著的共生作用。將其混合培養時可以大幅度升高發酵液中的生物量。下面將通過具體實施例進一步表述以這3個菌株為發酵菌種的安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法。但本領域技術人員應知曉，所述實施例不以任何方式限定本發明。
[0020]實施例1本發明所述安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法` 本發明所述的一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法，具體包括以下步驟:
1、從菌種斜面分別刮取干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母，并使用生活飲用水將其配制成菌懸液，測定各菌懸液中菌種重量，然后按干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母菌種重量比為1:1:1比例混合制得菌懸液即得到混合發酵原菌種；
2、將混合發酵菌種按10%- 15%的接種量接種于一級培養液中進行搖床發酵，控制發酵溫度為35 - 37°C，搖床發酵36 - 48h后得到一級種子液；將一級發酵液按照10% — 15%的接種量接種于二次擴大培養液中，控制發酵溫度為30 - 32°C，發酵48 - 60h后得到二級發酵液；其中一次擴大培養中一次擴大培養營養液配方為:糖蜜80kg、食鹽2kg，加適量水溶解后定容至1000L。一次擴大培養中種子的生產能力根據實驗室條件可適當調節其發酵量，然后進行菌種桶發酵實現二次擴大培養，二次擴大培養的營養液配方與一次擴大培養相同，發酵條件為自溢式半封閉條件培養。接種量控制在10% — 15%，根據菌種桶的裝量，可得3000L 二級發酵液。
[0021]將二級發酵液按照10% - 15%的接種量接種于發酵培養基中，控制發酵溫度為30 — 32°C，發酵60 - 72h后得到本發明所述乳酸菌產品；其中將上述菌種桶中的二級發酵液直接用于大規模生產時按10% — 15%接種發酵培養，經過一個發酵周期可得20000L-30000L本發明所述的乳酸菌產品。上述發酵培養基的配方與二次擴大培養液相同。
[0022]實施例2本發明所述安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法
本發明所述的一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法，具體包括以下步驟:1、從菌種斜面分別刮取干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母，并使用生活飲用水將其配制成菌懸液，測定各菌懸液中菌種重量，然后按干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母菌種重量比為2:1:1比例混合制得菌懸液即得到混合發酵原菌種；
2、將混合發酵菌種按10%- 15%的接種量接種于一次擴大培養液中，控制發酵溫度為35 — 37°C,發酵36 — 48h后得到一級發酵液；將一級發酵液按照10% — 15%的接種量接種于二次擴大培養液中，控制發酵溫度為30 - 32°C，發酵48 - 60h后得到二級發酵液；其中一次擴大培養中一次擴大培養營養液配方為:糖蜜80kg、食鹽2kg，加適量水溶解后定容至1000L0 一次擴大培養中種子的生產能力根據實驗室條件可適當調節其發酵量，然后進行菌種桶發酵實現二次擴大培養，二次擴大培養的營養液配方與一次擴大培養相同，發酵條件為自溢式半封閉條件培養。接種量控制在10% - 15%，根據菌種桶的裝量，可得3000L 二級發酵液。
[0023]將二級發酵液按照10% - 15%的接種量接種于發酵培養基中，控制發酵溫度為30 — 32°C，發酵60 - 72h后得到本發明所述乳酸菌產品；其中將上述菌種桶中的二級發酵液直接用于大規模生產時按10% — 15%接種發酵培養，經過一個發酵周期可得20000L-30000L本發明所述的乳酸菌產品。所述發酵培養基的配方與二次擴大培養液相同。
[0024]實施例3-實施例4本發明所述安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法
實施例3所述安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法與實施例1相同，區別在于干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母菌種重量比為2:2:1。實施例4所述安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法與實施例2相同，區別在于干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母菌種重量比為2:1:2。
[0025]實施例5本發明所述安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法的生物量測定
分別測定實施例1-4中獲得乳酸菌產品的生物量。同時設置參比實施例1-4。參比實施例中不含有粉紅畢赤酵母，其余兩種菌種的用量配比與對應的實施例相同。其中參比實施例I制備方法與實施例1相同，參比實施例2、3、4制備方法分別與實施例2、3、4相同。
[0026]表1實施例1-實施例4中混合發酵中重要參數控制
【權利要求】
1.一種安全高效乳酸菌產品的發酵生產方法，其特征在于，所述的乳酸菌產品發酵生產方法中發酵菌種是由干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母組成。
2.如權利要求1所述的乳酸菌產品的發酵生產方法，其特征在于，所述的生產方法包括如下步驟: 1)發酵菌種的制備:從菌種斜面分別刮取干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母，并使用生活飲用水將其配制成菌懸液，測定各菌懸液中菌種重量，然后按干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母菌種重量比為(1-2): (1-2): (1-2)混合后制成菌懸液即得到混合發酵原菌種； 2)擴大培養:將混合發酵原菌種按10%— 15%的接種量接種于一次擴大培養液中，控制發酵溫度為35 - 37°C，發酵36 - 48h后得到一級發酵液；將一級發酵液按照10% — 15%的接種量接種于二次擴大培養液中，控制發酵溫度為30 - 32°C，發酵48 - 60h后得到二級發酵液； 3)乳酸菌產品的大規模生產:將二級發酵液按照10%— 15%的接種量接種于發酵培養基中，控制發酵溫度為30 - 32°C，發酵60 - 72h后即可得到本發明所述乳酸菌產品。
3.如權利要求2所述的乳酸菌產品的發酵生產方法，其特征在于，所述步驟I)干酪乳桿菌、植物乳桿菌和粉狀畢赤酵母菌種重量比為2:2:1。
4.如權利要求2所述的乳酸菌產品的發酵生產方法，其特征在于，，所述步驟2)中搖床轉速為40 - 60r/min。
5.如權利要求2所述的乳酸菌產品的發酵生產方法，其特征在于，菌落的數目可以通過分光光度計或顯微鏡計數方式測定得到。`
6.如權利要求2所述的乳酸菌產品的發酵生產方法，其特征在于，所述菌懸液接種于零級培養液時總菌落數不低于1.5X 108cfu/mL。
7.如權利要求2所述的乳酸菌產品的發酵生產方法，其特征在于，所述的一次擴大培養液、二次擴大培養液以及發酵培養基的配方相同，其配方為每1000mL中含有糖蜜80g，食鹽2g。
8.權利要求1-7任一所述的發酵生產方法獲得的乳酸菌產品。
9.權利要求1-7任一所述的發酵生產方法獲得的乳酸菌產品在農業生產中的應用。
10.權利要求1-7任一所述的發酵生產方法獲得的乳酸菌產品在醫藥工業中的應用。
【文檔編號】C12R1/84GK103497988SQ201310433194
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】陳明仁 申請人:廣州康代生物科技有限公司