使用含有海藻糖的細胞洗滌溶液的貼壁細胞的洗滌方法
【專利摘要】本發明提供使用含有海藻糖的細胞洗滌溶液的貼壁細胞的洗滌方法，所述方法能有效抑制由為了從培養容器剝離貼壁細胞而進行的蛋白質分解酶處理及之后的細胞處理導致的細胞死亡，還提供用于所述洗滌方法的細胞洗滌液、使用了上述細胞洗滌液的移植用細胞懸浮液的制造方法、含有上述細胞洗滌液的試劑盒。本發明通過下述解決手段可以抑制(阻止)由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡(凋亡等)：向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽，制作含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽作為有效成分的細胞洗滌液，使用所述細胞洗滌液，在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前洗滌細胞。
【專利說明】使用含有海藻糖的細胞洗滌溶液的貼壁細胞的洗滌方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及貼壁細胞的洗滌方法，其特征在于，在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前，使用向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽而成的細胞洗滌液，洗滌貼壁細胞，本發明還涉及用于所述洗滌方法的上述細胞洗滌液、使用了上述細胞洗滌液的移植用細胞懸浮液的制造方法、含有上述細胞洗滌液的用于制造移植用細胞懸浮液的試劑盒等。
【背景技術】
[0002]近年來，由于干細胞研究的急速發展，對再生醫療的熱忱高漲，其知識和理解不限于研究人員，已開始一般性地廣泛普及。使用干細胞的再生醫療是以利用干細胞具有的自我復制能力和多分化潛能或利用干細胞分泌的因子、使因各種疾病受到損傷的細胞和組織的功能恢復為目的的醫療。如果對白血病、再生障礙性貧血等的血液疑難病的患者進行骨髓移植，則造血干細胞植活于患者體內，能在幾乎一生中維持造血能力。另外，最近很多研究人員以使用了造血干細胞以外的干細胞的臨床應用為目標，鑒定中樞神經、末梢神經、骨髓、小腸等中的干細胞，開始實踐針對外傷性疾病、組織變性疾病的組織干細胞的移植治療(非專利文獻I~3)。
[0003]因為能從生物體內采集的用于移植治療的干細胞的量極少，所以一般要將采集的干細胞在體外進行傳代培養來使其增殖（專利文獻I)。傳代培養的過程中，從培養容器剝離干細胞時，一般使用胰蛋白酶等蛋白質分解酶，但存在下述問題：由蛋白質分解酶處理導致細胞受到損傷，以致細胞死亡的情況以一定比例發生。為了實施高質量的再生醫療，必須提供充足量（數目）的干細胞，同時提供高質量的細胞、即存活細胞比例高的干細胞（群）是重要的，因此開發能抑制傳代培養時由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡的方法成為當務之急。
[0004]另一方面，海藻 糖（trehalose)是葡萄糖以1，I-糖苷鍵鍵合得到的一種二糖。海藻糖呈甜味，具有高保水力，因此用于各種食品和化妝品。另外，海藻糖具有穩定細胞膜、抑制細胞損傷的性質，因此，在器官移植時作為器官保護液的有效成分使用。開發了 ET-Kyoto液和New ET-Kyoto液等含有海藻糖的優秀的器官保存液（專利文獻2和3、非專利文獻4)。但是，在通過胰蛋白酶等蛋白質分解酶從培養容器剝離細胞之前，用含有海藻糖的生理性水溶液洗滌貼壁細胞的情況下，是否能抑制由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡是未知的。
[0005]專利文獻I :美國專利第5486359號
[0006]專利文獻2 :日本專利第3253131號公報
[0007]專利文獻3 :國際公開第2007/043698號說明書
[0008]非專利文獻I ：Gage, F. H. Science287 :1433-1438 (2000)
[0009]非專利文獻2 ：Morrison, S. J.等人，Cell96 :737-749 (1999)
[0010]非專利文獻3 :Batle，Ε·等人，Celllll :251-263 (2002)[0011 ]非專利文獻 4 ：Chem, F.等人，Yonsei Med. J. 45 :1107-1114 (2004)
【發明內容】
[0012]本發明的課題是提供貼壁細胞的洗滌方法，所述方法能有效抑制由為了從培養容器剝離貼壁細胞而進行的蛋白質分解酶處理及之后的細胞處理導致的細胞死亡，以及提供用于所述洗滌方法的細胞洗滌液、使用了上述細胞洗滌液的移植用細胞懸浮液的制造方法、含有上述細胞洗滌液的試劑盒。
[0013]本發明人等發現，用含有海藻糖的生理性水溶液對通過蛋白質分解酶處理從細胞培養容器剝離的間充質干細胞進行洗滌時，間充質干細胞的細胞死亡得到抑制（日本專利申請2011-072068)。由蛋白質分解酶處理導致細胞受到損傷時，細胞死亡（凋亡等）的途徑被誘導，因此認為所述由海藻糖帶來的效果是由于抑制了凋亡途徑或促進了細胞損傷的修復功能而產生的，但在為了解決上述課題進行的反復深入研究中，偶然地在蛋白質分解酶處理前用含有海藻糖的乳酸林格液（Lactate Ringer’s solution ;以下簡稱為“LRT”）洗滌細胞，結果發現，與使用對照的乳酸林格液（以下簡稱為“LR”）或磷酸緩沖生理鹽水(Phosphate buffered saline ;PBS)的情況、或在蛋白質分解酶處理后用LRT洗漆細胞的情況等相比，更能有效抑制細胞死亡，由此完成了本發明。
[0014]gp，本發明涉及：
[0015]項⑴一種貼壁細胞的洗滌方法，其特征在于，在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前，使用下述細胞洗滌液洗滌貼壁細胞，所述細胞洗滌液是向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽而成的。
[0016]項（2)上述項（I)所述的方法，其特征在于，貼壁細胞是間充質干細胞。
[0017]項（3)上述項⑴或⑵所述的方法，其特征在于，細胞洗滌液中的海藻糖或其衍生物或它們的鹽的濃度為I ~15 (w/v) %。
[0018]另外，本發明涉及：
[0019]項（4) 一種細胞洗滌液，用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前洗滌貼壁細胞，其特征在于，所述細胞洗滌液是向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽而成的。
[0020]項（5)上述項（4)所述的細胞洗滌液，其特征在于，貼壁細胞是間充質干細胞。
[0021]項（6)上述項（4)或（5)所述的細胞洗滌液，其特征在于，海藻糖或其衍生物或它們的鹽的濃度為I~15 (w/v) %。
[0022]另外，本發明涉及：
[0023]項（7) —種移植用細胞懸浮液的制造方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)~（d)：
[0024]步驟（a):除去貼壁細胞貼附的培養容器中的培養基，用向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽而成的細胞洗滌液洗滌貼壁細胞；
[0025]步驟（b):通過蛋白質分解酶處理使得貼壁細胞從培養容器剝離；
[0026]步驟（C):將從培養容器剝離的貼壁細胞懸浮于含有蛋白質的生理性水溶液中，制成細胞懸浮液；
[0027]步驟（d):除去細胞懸浮液中的溶液，用生理性水溶液洗滌貼壁細胞。[0028]項（8)上述項（7)所述的制造方法，其特征在于，貼壁細胞是間充質干細胞。
[0029]項（9)上述項（7)或（8)所述的制造方法，其特征在于，步驟（a)中的細胞洗滌液中的海藻糖或其衍生物或它們的鹽的濃度為I~15 (w/v) %。
[0030]項（10)上述項（7)~（9)中任一項所述的制造方法，其特征在于，步驟（b)中的蛋白質分解酶為胰蛋白酶。
[0031]項（11)上述項（7)~（10)中任一項所述的制造方法，其中，步驟（C)中的含有蛋白質的生理性水溶液還含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽。
[0032]項（12)上述項（7)~（11)中任一項所述的制造方法，其特征在于，步驟（C)中的含有蛋白質的生理性水溶液為含有血清的動物細胞培養用基礎培養基。
[0033]項（13)上述項（7)~（12)中任一項所述的制造方法，其特征在于，步驟（d)中的生理性水溶液還含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽。
[0034]另外，本發明涉及：
[0035]項（14) 一種試劑盒，用于制造移植用細胞懸浮液，其特征在于，所述試劑盒含有上述項（4)~(6)中任一項所述的細胞洗滌液、及記載了關于該細胞洗滌液對由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡的抑制效果的說明書。
[0036]另外，本發明涉及：
[0037]項（15)海藻糖或其衍生物或它們的鹽在制造細胞洗滌液中的應用，所述細胞洗滌液用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前洗滌貼壁細胞。
[0038]進而，本發明還 涉及：
[0039]項（16)海藻糖或其衍生物或它們的鹽，用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前洗滌貼壁細胞。
[0040]作為本發明的其他實施方式，可舉出：用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞前洗滌貼壁細胞的、生理性水溶液和海藻糖或其衍生物或它們的鹽的組合；通過向生理性水溶液中添加而用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞前洗滌貼壁細胞的海藻糖或其衍生物或它們的鹽。進一步地，作為本發明的其他實施方式，可舉出：貼壁細胞的體外傳代方法，其特征在于使用含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽的生理性水溶液來洗滌貼壁細胞；用于貼壁細胞的體外傳代的試劑盒，其包含海藻糖或其衍生物或它們的鹽、及記載了關于對由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡的抑制效果的說明書。
[0041]根據本發明，可提供能降低含有間充質干細胞等干細胞的移植用細胞懸浮液中的死細胞率的、再生醫療中的品質優良的移植用細胞懸浮液。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]【圖I】表示對在胰蛋白酶處理前用LRT洗滌貼壁細胞時（圖中，“酶處理前洗滌液：LRT，酶處理后洗滌液：PBS”）的細胞死亡抑制效果進行分析所得的結果的圖。作為對照使用PBS(圖中，“酶處理前洗滌液：PBS，酶處理后洗滌液：PBS”），另外作為比較例1，在胰蛋白酶處理后使用了 LRT(圖中，“酶處理前洗滌液：PBS，酶處理后洗滌液：LRT”）。縱軸表示死細胞率（平均值土標準偏差（η = 8))。另外，圖中“***”表示使用Tukey檢驗時4組間存在統計學上的顯著性差異（P < 0.001)。[0043]【圖2】表示對在胰蛋白酶處理前使用LRT對貼壁細胞洗滌O.5~10分鐘的情況下的細胞死亡抑制效果進行分析所得的結果的圖。作為對照使用LR及PBS。縱軸表示死細胞率（平均值土標準偏差（η = 8))。另外，圖中“***”表示：各洗滌時間中，針對PBS及LR，使用Tukey檢驗時存在統計學上的顯著性差異（P < 0.001)。
[0044]【圖3】表示對在胰蛋白酶處理前使用海藻糖為各濃度（l、3、5、7、10、12、15(w/v)%)的LRT洗滌貼壁細胞的情況下的細胞死亡抑制效果進行分析所得的結果的圖。作為對照使用LR。縱軸表示死細胞率（平均值土標準偏差（η = 12))。另外，圖中及“***”表示：針對LR，使用Dunnett檢驗時存在統計學上的顯著性差異（分別為P < 0.005及 P < 0.001)。
[0045]【圖4】表示對在胰蛋白酶處理時或在停止胰蛋白酶反應的處理時添加了海藻糖的情況下的細胞死亡抑制效果進行分析所得的結果的圖。圖中“胰蛋白酶+Τ”表示向胰蛋白酶溶液中添加有海藻糖的情況，另外，圖中“培養基+Τ”表示含有FBS的人MSC培養基中含有海藻糖的情況。縱軸表示死細胞率（平均值土標準偏差（η = 6))。另外，圖中“***”表示：針對PBS及LR，使用Tukey檢驗時存在統計學上的顯著性差異（P < 0.001)，另外，圖中“林”表示：針對PBS及LR，使用Tukey檢驗時存在統計學上的顯著性差異（分別為P< 0.001 及卩 < 0.005)。
【具體實施方式】
[0046]本發明的洗滌方法是在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離哺乳動物細胞等貼壁細胞之前、使用向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽（下文中稱為“海藻糖類”）而成的本發明的細胞洗滌液（即,含有海藻糖類的生理性水溶液）對已預先通過吸液器（aspirator)等除去了培養基的培養容器中的貼壁細胞進行洗滌的方法，此處，本發明的細胞洗滌液被限定為作為在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前、用于洗滌貼壁細胞的細胞洗滌液的用途。本發明中，貼壁細胞是指能通過貼附于支持物而進行生存、增殖、物質生 產的支持物依賴性細胞。作為貼壁細胞，具體可舉出多能干細胞(胚胎干細胞（ES細胞）、EG細胞、iPS細胞等）、間充質干細胞、神經系統干細胞、骨髓干細胞、生殖干細胞等，其中優選間充質干細胞。作為上述哺乳動物，可以列舉小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等嚙齒類；兔等兔科；豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄科；犬、貓等貓科；人、猴、獼猴、食蟹猴、狨、猩猩、黑猩猩等靈長類等，其中可優選列舉小鼠、豬、人，此外，作為上述哺乳動物細胞，除了用于再生醫療等經由血管給予的哺乳動物干細胞之外，還可列舉經靜脈給予I型糖尿病患者的哺乳動物的胰島細胞、經靜脈給予癌癥患者的哺乳動物的樹狀細胞、自然殺傷細胞、α β T細胞、Y δ T細胞、細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte ;CTL)等。
[0047]作為應用于本發明的細胞洗滌液的生理性水溶液，只要為通過鈉或鉀等調節了鹽/糖濃度等、使得與體液/細胞液的滲透壓基本相同的等滲水溶液即可，沒有特別限制，具體而言可舉出生理鹽水、具有緩沖效果的生理鹽水（磷酸緩沖生理鹽水（PBS)、tris緩沖生理鹽水（TBS)、HEPES緩沖生理鹽水等）、林格液（乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氫鹽林格液等）、5%葡萄糖水溶液、動物細胞培養用基礎培養基（DMEM、EMEM、RPMI-1640、a-MEM、F-12、F-10、M-199等)、等滲劑（葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、乳糖、氯化鈉等)等，其中優選具有緩沖效果的生理鹽水和林格液，更優選PBS和乳酸林格液。生理性水溶液可以是市售品，也可以自己制備。作為市售品，可以舉出D-PBS(-) (Invitrogen公司制）、生理鹽水（大塚制藥工場公司制“大塚生食注”）、乳酸林格液（大塚制藥工場公司制“LactecInjection”）、人間充質干細胞專用培養基試劑盒（Lonza公司）。本說明書中的“等滲”是指滲透壓在250~380m0sm/l的范圍內。生理性水溶液還可含有穩定劑（例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、緩沖劑（例如，磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液)、螯合劑（例如EDTA、EGTA、檸檬酸、水楊酸鹽）、增溶劑、防腐劑、抗氧化劑等。
[0048]作為應用于本發明的細胞洗滌液中的海藻糖類中的海藻糖，除了 2個α-葡萄糖以1，I-糖苷鍵鍵合而成的為二糖類的α，α-海藻糖之外，還可以舉出0-葡萄糖和0_葡萄糖以1，I-糖苷鍵鍵合而成的為二糖類的α，β -海藻糖、2個β -葡萄糖以1，I-糖苷鍵鍵合而成的為二糖類的β，海藻糖，其中優選α，α-海藻糖。這些海藻糖可以通過化學合成、利用微生物的生產、利用酶的生產等任意公知的方法來制造，也可使用市售品。例如,可以舉出α，α -海藻糖（株式會社林原社制）、α，α -海藻糖（和光純藥株式會社制）等市售品。
[0049]作為應用于本發明的細胞洗滌液中的海藻糖類中的海藻糖衍生物，只要為二糖類的海藻糖上鍵合有I個或多個糖單位的糖基海藻糖類（glycosyl trehalose)即可,沒有特別限制，糖基海藻糖類包含糖基海藻糖、麥芽糖基海藻糖、麥芽三糖基海藻糖等。
[0050]作為應用于本發明的細胞洗滌液中的海藻糖類中的海藻糖或其衍生物的鹽，可舉出例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽等酸加成鹽；鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等金屬鹽；銨鹽、烷基銨鹽等。需要說明的是，這些鹽在使用時以溶液的形式使用，其作用與海藻糖的情況效果相同是優選的。這些鹽類也可形成水合物或溶劑合物，此外，可以單獨使用任一種或適當地組合2種以上使用。
[0051]作為應用于本發 明的細胞洗滌液中的海藻糖類的濃度，只要為能抑制（阻止）由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡（凋亡、壞死等）的濃度即可，可根據細胞種類、培養容器中的細胞數、細胞濃度等來適當選擇最適條件。雖然海藻糖類的濃度越高、能抑制由蛋白質分解酶導致的細胞死亡的效果就變得越高，但是海藻糖類濃度過高時，可能對細胞的生存造成不利影響。例如，應用于本發明的細胞洗滌液中的海藻糖類的濃度通常為O. l(w/V) %以上，優選1.0 (w/v) %以上，較優選3. O (w/v) %以上，另外，從避免對細胞生存率的不利影響的觀點來看，通常為20 (w/v) %以下,優選15 (w/v) %以下,較優選7. O (w/v) %以下，更優選5. O (w/v) %以下。因此，作為細胞洗滌液中的海藻糖類的濃度，為O. I~20 (w/v) %，優選為1.0~15 (w/v) %,較優選為L O~7. O (w/v) %,更優選為3. O~5. O (w/v) %。可使用錐蟲藍（Trypan Blue)染色法、TUNEL法、Nexin法、FLICA法等能檢測細胞死亡的公知方法來確認通過本發明的細胞洗滌液能抑制細胞死亡。
[0052]作為用于本發明的蛋白質分解酶處理中的蛋白質分解酶，可以舉出胰蛋白酶、賴氨酰肽鏈內切酶（Iysylendopeptidase)、鏈霉蛋白酶（pronase)、胃蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶等，其中可優選列舉胰蛋白酶。
[0053]本發明的洗滌方法中的洗滌貼壁細胞時的溫度和時間等條件只要為能確認到本發明的由海藻糖類帶來的效果、且不對細胞造成損傷的條件即可，溫度通常在20~37°C的范圍內，處理時間通常在I秒~20分鐘的范圍內，但處理時間至少在30秒~10分鐘的范圍內時本發明的由海藻糖類帶來的效果能以相同程度被確認到，因此作為上述處理時間，優選在30秒~10分鐘的范圍內。另外，作為洗滌操作的次數，可以為至少一次，也可以為數次（2、3、4次等），但考慮時間效益和成本效益時，優選為I次。
[0054]可使用本發明的細胞洗滌液按以下所述來制造移植用細胞懸浮液。
[0055]首先，在經細胞粘附分子（纖連蛋白（Fibronectin)、玻連蛋白（vitronectin)、層粘連蛋白（Iaminin)、巢蛋白（nidogen)等）、高分子（聚-L-鳥氨酸、聚賴氨酸等）等涂布處理的貼壁細胞用培養容器（多孔板、培養皿（3(*&16、01也）、燒瓶等）或經表面加工處理的貼壁細胞用培養容器中，對上述貼壁細胞進行體外傳代培養，得到產物。因為有培養基中含有蛋白酶抑制劑等抑制蛋白質分解酶活性的因子的可能性、或有蛋白質分解酶的功能被培養基中存在的過量的蛋白質競爭性抑制的可能性，所以在下一個步驟中，在進行蛋白質分解酶處理之前，預先通過吸液器等除去貼壁細胞貼附的培養容器中的培養基，用基本上或者完全不含蛋白質的本發明的細胞洗滌液來洗滌細胞，除去殘存的培養基。關于洗滌處理時的溫度、時間等條件，可舉出上述的本發明的洗滌方法中的洗滌貼壁細胞時的條件。
[0056]接著，通過蛋白質分解酶處理，使得貼壁細胞從培養容器剝離。此時，通常由于細胞受到損傷導致細胞群中的細胞生存率降低，但通過本發明的由海藻糖類帶來的效果，能抑制（阻止）細胞生存率降低。
[0057]蛋白質分解酶處理通過使細胞與含有上述的蛋白質分解酶的水溶液接觸來進行。作為含有蛋白質分解酶的水溶液，可以為將Gibco公司等制造的市售蛋白質分解酶的粉末溶解于上述生理性水溶液中獲得的溶液，也可以為將Lonza公司等制造的市售蛋白質分解酶溶液用上述的生理性水溶液稀釋而獲得的溶液。含有蛋白質分解酶的水溶液中的蛋白質分解酶的濃度只要為對應于蛋白質分解酶的種類而言足以剝離細胞的濃度即可，通常在
O.05~O. 25 ( w/v) %的范圍內。
[0058]蛋白質分解酶處理中的溫度和時間等條件為大部分（70~100%等)細胞能從培養容器剝離的條件即可，溫度通常在20~37°C的范圍內，處理時間通常在15秒~15分鐘的范圍內。通常，經長時間對細胞進行蛋白質分解酶處理時，有可能細胞受到損傷、生存率進一步降低，但通過本發明的由海藻糖類帶來的效果，能抑制細胞生存率降低，因此也可以對采用通常的處理時間難于從培養容器剝離的細胞進行長時間（10~30分鐘等）處理。
[0059]接下來，為了停止蛋白質分解酶的處理，將從培養容器剝離的貼壁細胞懸浮于含有蛋白質的生理性水溶液中。懸浮可采用吹吸（pipetting)或輕拍（tapping)等本【技術領域】公知的方法來實施。作為含有蛋白質的生理性水溶液，只要為含有對抑制蛋白質分解酶的活性而言充分量的蛋白質的生理性水溶液即可，具體而言可舉出含有O. I~30(v/v) %的血清（胎牛血清(Fetal bovine serum ;FBS)、小牛血清(calf bovine serum ;CS)等）的上述生理性水溶液，優選含有FBS的上述動物細胞培養用基礎培養基。另外，作為含有蛋白質的生理性水溶液，因為能確認到本發明的由海藻糖類帶來的疊加或協同效果，所以優選還含有上述海藻糖類。
[0060]接著，為了除去細胞懸浮液中的蛋白質分解酶、洗滌貼壁細胞，除去細胞懸浮液中的溶液，使用上述生理性水溶液作為蛋白質分解酶處理后的洗滌液來洗滌貼壁細胞。細胞懸浮液中的溶液的除去可通過用離心機將細胞懸浮液分離為上清（溶液）和沉淀物（細胞）、用吸液器等除去上清液來實施。另外，為了提高洗滌效果，優選通過吹吸或輕拍等來懸浮沉淀物。另外，作為對細胞懸浮液中的細胞進行洗滌的次數，可以為至少一次，也可以為數次（2、3、4次等），但考慮時間效益和成本效益時，優選為I次。另外，作為用作蛋白質分解酶處理后的洗滌液的上述生理性水溶液，因為能確認到本發明的由海藻糖類帶來的疊加或協同效果，所以優選還含有上述海藻糖類。
[0061]用離心機將上述洗滌后的細胞分離為上清（溶液）和沉淀物（細胞）、用吸液器等除去上清液之后，將其懸浮于適合通過經動脈或經靜脈或者經皮等手段進行移植的移植用水溶液中。作為移植用水溶液，具體而言可舉出上述生理性水溶液，優選林格液，較優選乳酸林格液、乙酸林格液或碳酸氫鹽林格液，更優選乳酸林格液。
[0062]作為上述其他實施方式的貼壁細胞的體外傳代方法，可舉出依次包括下述步驟的方法：步驟（a’ ):除去上述貼壁細胞所貼附的培養容器中的培養基，用本發明的細胞洗滌液洗滌貼壁細胞；步驟（b’ ):通過使用了上述蛋白質分解酶的蛋白質分解酶處理使得貼壁細胞從培養容器剝離；步驟（c’ ):將剝離的貼壁細胞懸浮于上述含有蛋白質的生理性水溶液中；步驟（d’ ):用新的培養容器對細胞懸浮液的一部分（50(v/v) %,25(v/v) %U2(v/v) %等）進行傳代培養；在步驟（c’)和步驟（d’)之間，優選還具有步驟（P):除去細胞懸浮液中的溶液、用上述生理性水溶液或含有蛋白質的生理性水溶液洗滌貼壁細胞。
[0063]傳代培養中使用的培養溫度通常在約30~40°C的范圍內，優選為37°C。培養時的C02濃度通常在約I~10%的范圍內，優選為約5%。培養時的濕度通常在約70~100%的范圍內，優選為約95~100%。
[0064]作為傳代培養中使用的培養基，可舉出以O. I~30(v/v) %的范圍內含有血清（FBS、CS等）的上述動物細胞培養用基礎培養基、或含有細胞增殖所必需的添加物來代替血清的上述動物細胞培養用基礎培養基。作為所述添加物，可舉出鐵源（轉鐵蛋白等）、生長因子（胰島素、EGF、堿性FGF、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF=Glial cellline-derived neurotrophicfactor)、干細胞因子(SCF :Stem Cell Factor)等）、多胺類（腐胺等）、留族化合物（孕酮、β-雌二醇等）、礦物質（亞硒酸（Selenous acid)或其鹽）、粘附因子（例如肝素、硫酸肝素、膠原、纖連蛋白等）、還原劑（N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、2_巰基乙醇、過氧化氫酶等）。另外，除了維持干細胞不分化所必需的干細胞分化抑制劑（LIF、Wnt、TGF-i3等）之外，還可向上述培養基中添加葡萄糖等糖類；鏈霉素、青霉素、慶大霉素等抗生素；HepeS等緩沖劑等。
[0065]對于本發明的移植用細胞懸浮液的制造方法以及上述其他實施方式的貼壁細胞的體外傳代方法中的各步驟，為了避免灰塵或細胞等的混入（污染），優選使用潔凈工作臺(clean bench)等在無菌下進行。
[0066]作為用于制造本發明的移植用細胞懸浮液的試劑盒或上述其他實施方式的用于貼壁細胞的體外傳代的試劑盒，只要為含有本發明的細胞洗滌液和記載了關于對由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡的抑制效果的說明書、并且用途限定為用于制造移植用細胞懸浮液的試劑盒或用于貼壁細胞的體外傳代的試劑盒即可，沒有特別限制，還可含有上述的蛋白質分解酶、移液器、離心管等，特別可優選列舉還含有上述的蛋白質分解酶的試劑盒。
[0067]以下通過實施例更具體地說明本發明 ，但本發明的技術范圍不限定為這些示例。
[0068]實施例I[0069]I、將本發明的細胞洗滌液作為蛋白質分解酶處理前的細胞洗滌液使用時細胞死亡得以抑制的確認。
[0070]1-1 材料
[0071]1-1-1含有3 (w/v) %海藻糖的乳酸林格液
[0072]將3g海藻糖（株式會社林原社制）與90mL乳酸林格液（大塚制藥工場株式會社制“Lactec Injection”）混合，使用攪拌器使其溶解。用乳酸林格液將容量調節至IOOmL,之后在安全柜內利用O. 22 μ m過濾器進行滅菌,分裝為10mL。
[0073]1-1-2 人骨髓間充質干細胞（Human Mesenchymal Stem Cells from BoneMarrow(hMSC-BM))
[0074]按照以下（I)~（9)所示的順序配制hMSC-BM(Lonza公司制），用于本實驗。
[0075](I)于37°C、5% CO2的培養箱中，使用75cm2燒瓶，在人間充質干細胞專用培養基試劑盒（Lonza公司制）（下文中稱為“MSC培養基”）存在下，對hMSC-BM進行培養。在顯微鏡下觀察細胞的狀態，培養至達到90%左右的匯合。
[0076](2)用吸液器除去MSC培養基，每燒瓶以8mL的Dulbecco磷酸緩沖鹽水(D-PBS(-))(以下簡稱為“PBS”）(Invitrogen公司制)來漂洗細胞。
[0077](3)用吸液器除去PBS，每燒瓶加入3. 75mL胰蛋白酶-EDTA (Lonza公司制），室溫下靜置5分鐘。
[0078](4) 一邊在顯微鏡下觀察一邊輕輕搖晃直到90%左右的細胞剝離。
[0079](5)每燒瓶加入3. 75mL的MSC培養基，使胰蛋白酶反應停止，通過吹吸回收細胞，移至50mL離心管。
[0080](6)以600Xg，于22°C下進行5分鐘的離心分離。
[0081](7)以吸液器除去作為上清液的MSC培養基，每I燒瓶加入5mL的MSC培養基，懸浮細胞沉淀團（沉淀物）。
[0082](8)采集10 μ L的細胞懸浮液，將其與10μ L的0. 4%錐蟲藍（Gibco公司制）混合，用細胞計數盤測定存活的細胞數。
[0083](9)向6孔板中接種細胞，至1父105個細胞/211117孔，之后于371：、5%0)2的孵育箱中進行培養。每隔3~4日將MSC培養基全部更換為新的培養基。
[0084]1-2 方法
[0085]為了確認將本發明的細胞洗滌液作為蛋白質分解酶處理前的細胞洗滌液使用時細胞死亡被抑制，按照以下（I)~（5)所示的順序進行了實驗。
[0086](I)從貼附有hMSC-BM的6孔板抽吸·除去MSC培養基，每I孔各添加2mL的25°C的含有3(w/v) %海藻糖的乳酸林格液（3% LRT)，在25°C下保溫I分鐘（酶處理前的洗滌處理）。需要說明的是，使用PBS作為對照。
[0087](2)抽吸·除去3 % LRT之后，每I孔各添加ImL的保溫于25 V的胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司制），于25°C下進行15分鐘的孵育（酶處理）。
[0088](3)各加入ImL的25°C的MSC培養基，將細胞進行懸浮（停止酶反應的處理），之后將細胞懸浮液移至15mL尖底離心管（ConicalCentrifuge Tube)。
[0089](4)以600X g，于25°C下進行5分鐘的離心分離，抽吸·除去上清液之后，對于每I孔，懸浮于100 μ L的冰冷PBS中（酶處理后的洗滌處理）。[0090](5)采集10 μ L細胞懸浮液，與10 μ L錐蟲藍混合后，在顯微鏡下使用單細胞計數器（one cell counter)進行細胞數測定，進行死細胞率評價。
[0091]1-3 結果
[0092]胰蛋白酶處理前用PBS洗滌細胞的情況下，胰蛋白酶處理后的死細胞率為34. 7%(圖1，左起第I條柱），相對于此，胰蛋白酶處理前用3% LRT洗滌細胞的情況下，胰蛋白酶處理后的死細胞率為16.3% (圖1，右起第2條柱），另外，確認到兩者之間存在統計學上的顯著性差異（P <0.001)。該結果顯示，在胰蛋白酶處理前用LRT等含有海藻糖的生理性水溶液洗滌細胞時，較之使用不含有海藻糖的生理性水溶液的情況而言，胰蛋白酶處理后的死細胞率降低。另外，作為比較例1，在胰蛋白酶處理前用PBS洗滌細胞（上述實施例I的“1-2方法”的步驟（I) “酶處理前的洗滌處理”）、且在胰蛋白酶處理后用3% LRT洗滌細胞（上述實施例I的“1-2方法”的步驟⑷“酶處理后的洗滌處理”）的情況下，死細胞率為32.8% (圖I，左起第2條柱），較之使用PBS的對照情況（圖1，左起第I條柱，死細胞率為34. 7% )，能確認到雖然不存在顯著性差異但死細胞率降低，然而就其效果而言，胰蛋白酶處理前用3% LRT洗滌細胞的情況要好得多（P < 0.001，圖1，左起第2和第3條柱的比較）。另外，在胰蛋白酶處理前用3% LRT洗滌細胞、進而在胰蛋白酶處理后用3% LRT洗滌細胞的情況下，胰蛋白酶處理后的死細胞率為13. 8 % (圖I，右起第I條柱），與胰蛋白酶處理前使用3% LRT的情況（圖1，右起第2條柱，死細胞率為16. 3%)相比，能確認到雖然不存在顯著性差異但死細胞率降低。該結果顯示，在蛋白質分解酶處理后的細胞洗滌時使用海藻糖時，能通過與本發明的細胞洗滌液的疊加或協同效果，進一步降低死細胞率。
[0093]實施例2
[0094]2、由本發明的細胞洗滌液帶來的細胞死亡抑制效果是由海藻糖帶來的確認、以及對本發明的細胞洗滌液的處理時間的研究
[0095]2-1 方法
[0096]進而，為了確認由LRT帶來的細胞死亡抑制效果并非是由LR帶來的、而是由海藻糖帶來的，使用LR作為胰蛋白酶處理前洗滌液的對照進行實驗。另外，還為了對胰蛋白酶處理前的細胞洗滌處理時間進行一并研究，按照以下（I)~（5)所示的順序進行了實驗。
[0097](I)從貼附有hMSC-BM的6孔板抽吸·除去MSC培養基，每I孔各添加2mL的25°C的含有3 (w/v) %海藻糖的乳酸林格液（3% LRT)，在25°C下保溫O. 5、I、3、5、7、10分鐘（酶處理前的洗滌處理）。需要說明的是，使用LR及作為洗滌液通常使用的PBS作為對照。
[0098](2)抽吸?除去3% LRT之后，每I孔各添加ImL保溫于25 °C的與PBS等量混合所得的胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司制）稀釋液，于25°C下進行20分鐘的孵育（酶處理）。
[0099](3)各加入ImL的25°C的MSC培養基，將細胞進行懸浮（停止酶反應的處理），之后將細胞懸浮液移至15mL尖底離心管（Conical Centrifuge Tube)。
[0100](4)以600父8，于251：下進行5分鐘的離心分離，抽吸·除去上清液之后，對于每I孔，懸浮于100 μ L的冰冷PBS中（酶處理后的洗滌處理）。
[0101](5)采集IOyL細胞懸浮液，與10 μ L錐蟲藍混合后，在顯微鏡下使用單細胞計數器進行細胞數測定，進行死細胞率評價。
[0102]2-2 結果
[0103]結果示于圖2。例如，在胰蛋白酶處理前洗滌處理時間為10分鐘的情況下，在胰蛋白酶處理前用LR洗滌細胞時，胰蛋白酶處理后的死細胞率為42. 1%，相對于此，胰蛋白酶處理前用3% LRT洗滌細胞時，胰蛋白酶處理后的死細胞率降低至14.8% (圖2)，確認了所述降低具有統計學上的顯著性差異（P < 0.001)。另外，PBS和LR之間沒有確認到統計學上的顯著性差異。該結果顯示，由本發明的細胞洗滌液帶來的細胞死亡抑制效果并非是由LR帶來的、而是由海藻糖帶來的。進而，在胰蛋白酶處理前利用LRT進行的細胞洗滌處理時間為O. 5~7分鐘的情況下，也同樣確認到相同程度的細胞死亡抑制效果（圖2)。該結果顯示，在胰蛋白酶處理前使用本發明的細胞洗滌液至少在進行O. 5~10分鐘的范圍內的處理的情況下，確認到相同程度的細胞死亡抑制效果。
[0104]實施例3
[0105]3、關于應用于本發明的細胞洗滌液的海藻糖濃度的研究
[0106]3-1 方法
[0107]接著，為了針對應用于本發明的細胞洗滌液的海藻糖濃度進行研究，按照以下
(I)~（5)所示的順序進行了實驗。
[0108](I)從貼附有hMSC-BM的6孔板抽吸·除去MSC培養基，每I孔各添加2mL的25°C的含有各種濃度（I、3、5、7、10、12、15 (w/v) % )海藻糖的乳酸林格液，在25°C下保溫I分鐘(酶處理前的洗滌處理）。需要說明的是，使用LR作為對照。
[0109](2)抽吸·除去（I)的酶處理前洗滌液之后，每I孔各添加ImL保溫于25°C的胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司制），于25°C下進行15分鐘的孵育（酶處理）。
[0110](3)各加入Im L的25°C的MSC培養基，將細胞進行懸浮（停止酶反應的處理），之后將細胞懸浮液移至15mL尖底離心管。
[0111](4)以600父8，于251：下進行5分鐘的離心分離，抽吸·除去上清液之后，對于每I孔，懸浮于100 μ L的冰冷PBS中（酶處理后的洗滌處理）。
[0112](5)采集10 μ L細胞懸浮液，與10 μ L錐蟲藍混合后，在顯微鏡下使用單細胞計數器進行細胞數測定，進行死細胞率評價。
[0113]3_2 結果
[0114]結果示于圖3。使用海藻糖濃度為I~15(w/v) %的LRT在胰蛋白酶處理前洗滌細胞的情況下，與使用不含海藻糖的LR的情況相比，其任意濃度的情況的死細胞率均降低(圖3)，確認到所述降低具有統計學上的顯著性差異。另外可知，使用海藻糖濃度為3 (w/V) %的細胞洗滌液時，細胞死亡抑制效果最優異。上述結果顯示，應用于本發明的細胞洗滌液的海藻糖濃度至少在I~15 (w/v) %的范圍內的情況下確認到細胞死亡抑制效果，并且還顯示，所述海藻糖濃度為I~7 (w/v) %、特別是3~5 (w/v) %時確認到特別優異的細胞死亡抑制效果。
[0115]實施例4
[0116]4、對在胰蛋白酶處理或在停止胰蛋白酶反應的處理時添加海藻糖的情況下的細胞死亡抑制效果的分析
[0117]4-1 方法
[0118]接著，為了針對在胰蛋白酶處理或在停止胰蛋白酶反應的處理時添加海藻糖的情況下的細胞死亡抑制效果進行分析，按照以下（I)~（5)所示的順序進行了實驗。
[0119](I)從貼附有hMSC-BM的6孔板抽吸·除去MSC培養基，每I孔各添加2mL的25°C的含有3 (w/v) %海藻糖的乳酸林格液，在25°C下保溫I分鐘（酶處理前的洗滌處理）。需要說明的是，使用LR作為對照。
[0120](2)抽吸?除去（I)的酶處理前洗滌液之后，每I孔各添加lmL25°C保溫的含有海藻糖的胰蛋白酶溶液，于25°C下進行15分鐘的孵育（酶處理），所述含有海藻糖的胰蛋白酶溶液是通過向胰蛋白酶-EDTA (Lonza公司制）中添加海藻糖至海藻糖的最終濃度為3 (w/V) %而得的。
[0121](3)各加入ImL的25°C保溫的含有海藻糖的MSC培養基，將細胞進行懸浮（停止酶反應的處理），之后將細胞懸浮液移至15mL尖底離心管，所述含有海藻糖的MSC培養基是通過向MSC培養基中添加海藻糖至海藻糖的最終濃度為3 (w/v) %而得的。
[0122](4)以600父8，于251：下進行5分鐘的離心分離，抽吸·除去上清液之后，對于每I孔，懸浮于100 μ L的冰冷PBS中（酶處理后的洗滌處理）。
[0123](5)采集IOyL細胞懸浮液，與10 μ L錐蟲藍混合后，在顯微鏡下使用單細胞計數器進行細胞數測定，進行死細胞率評價。
[0124]4-2 結果
[0125]結果示于圖4。作為比較例2，在胰蛋白酶處理前用PBS洗滌細胞、且用含有海藻糖的胰蛋白酶溶液進行酶處理（上述實施例I的“1-2方法”的步驟（I) “酶處理前的洗滌處理”），將上述情況與使用不含海藻糖的胰蛋白酶溶液的情況進行比較，未確認到死細胞率有變化（圖4的“胰蛋白酶+Τ”與“胰蛋白酶”的比較）。該結果顯示，即使在蛋白質分解酶處理時添加海藻糖也不能抑制死細胞率。另外，作為比較例3，在胰蛋白酶處理前用PBS洗滌細胞、且在停止胰蛋白酶反應的處理時使用含有海藻糖的MSC培養基（圖4的“培養基+Τ”）的情況（上述實施例 I的“1-2方法”的步驟（3) “停止酶反應的處理”），與使用不含海藻糖的MSC培養基的情況（圖4的“培養基”）進行比較，死細胞率降低（圖4的左起第I條柱（死細胞率37. 9%)和圖4的左起第2條柱（死細胞率33. 9%)的比較）。該結果顯示，在蛋白質分解酶處理后停止酶反應的處理時，使用向MSC培養基等含有蛋白質的生理性水溶液中添加海藻糖而得的溶液將細胞進行懸浮時，較之本發明的細胞洗滌液而言雖然效果較低，但也能降低死細胞率。另外，在胰蛋白酶處理前用3% LRT洗滌細胞、進而在停止胰蛋白酶反應的處理時使用含有海藻糖的MSC培養基的情況下，胰蛋白酶處理后的死細胞率為13. 0% (圖4，右起第3條柱），較之在胰蛋白酶處理前使用3% LRT的情況（圖4，右起第4條柱，死細胞率為16. 8% )，能確認到雖然沒有統計學上的顯著性差異但死細胞率降低。該結果顯示，在停止蛋白質分解酶反應的處理時使用海藻糖時，通過與本發明的細胞洗滌液的疊加或協同效果，能進一步降低死細胞率。
[0126]產業上的可利用性
[0127]根據本發明，能降低含有MSC等干細胞的細胞懸浮液中的死細胞的比例、提供品質優良的細胞懸浮液，因此在再生醫療等中的移植醫療領域和癌癥治療領域有用。
【權利要求】
1.一種貼壁細胞的洗滌方法，其特征在于，在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前，使用下述細胞洗滌液洗滌貼壁細胞，所述細胞洗滌液是向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽而成的。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，貼壁細胞是間充質干細胞。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，細胞洗滌液中的海藻糖或其衍生物或它們的鹽的濃度為I~15(w/v) %。
4.一種細胞洗滌液，用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前洗滌貼壁細胞，其特征在于，所述細胞洗滌液是向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽而成的。
5.如權利要求4所述的細胞洗滌液，其特征在于，貼壁細胞是間充質干細胞。
6.如權利要求4或5所述的細胞洗滌液，其特征在于，海藻糖或其衍生物或它們的鹽的濃度為I~15 (w/v) %。
7.一種移植用細胞懸浮液的制造方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟（a)~(d)： 步驟（a):除去貼壁細胞貼附的培養容器中的培養基，用向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它們的鹽而成的細胞洗滌液洗滌貼壁細胞； 步驟（b):通過蛋白質分解酶處理使得貼壁細胞從培養容器剝離； 步驟（C):將從培養容器剝離的貼壁細胞懸浮于含有蛋白質的生理性水溶液中，制成細胞懸浮液； 步驟（d):除去細胞懸浮液中的溶液，用生理性水溶液洗滌貼壁細胞。
8.如權利要求7所述的制造方法，其特征在于，貼壁細胞是間充質干細胞。
9.如權利要求7或8所述的制造方法，其特征在于，步驟（a)中的細胞洗滌液中的海藻糖或其衍生物或它們的鹽的濃度為I~15 (w/v) %。
10.如權利要求7或8所述的制造方法，其特征在于，步驟（b)中的蛋白質分解酶為胰蛋白酶。
11.如權利要求7或8所述的制造方法，其特征在于，步驟（C)中的含有蛋白質的生理性水溶液還含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽。
12.如權利要求7或8所述的制造方法，其特征在于，步驟（c)中的含有蛋白質的生理性水溶液為含有血清的動物細胞培養用基礎培養基。
13.如權利要求7或8所述的制造方法，其特征在于，步驟（d)中的生理性水溶液還含有海藻糖或其衍生物或它們的鹽。
14.一種試劑盒，用于制造移植用細胞懸浮液，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求4~6中任一項所述的細胞洗滌液、及記載了關于所述細胞洗滌液對由蛋白質分解酶處理導致的細胞死亡的抑制效果的說明書。
15.海藻糖或其衍生物或它們的鹽在制造細胞洗滌液中的應用，所述細胞洗滌液用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前洗滌貼壁細胞。
16.海藻糖或其衍生物或它們的鹽，用于在通過蛋白質分解酶處理從培養容器剝離貼壁細胞之前洗滌貼壁細胞。
【文檔編號】C12N5/0775GK103710305SQ201310447295
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2012年9月28日
【發明者】小林英司, 和田圭樹, 土居雅子 申請人:株式會社大塚制藥工場