一種快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法，在擬南芥原生質體制備和轉化的基礎之上，對水稻原生質體的制備和轉化方法進行改良優化。以水稻幼莖為起始材料，采用纖維素酶R-10和果膠酶R-10，對水稻組織進行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分離原生質體，可獲得高純度的原生質體。對質粒轉化原生質體時的轉化方法、反應時間及質粒濃度進行探索，在縮短原生質體分離時間的同時，大大提高了轉化效率。用較微量的質粒DNA即可獲得外源基因在原生質體內高效的表達，且轉化效率可達70%以上。本發明有益的效果：它能夠克服采用離心法分離原生質體造成細胞碎片等雜質含量高的缺陷；明確莖、葉原生質體的形態差異；得到高純度的原生質體；增進轉化效率。
【專利說明】一種快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及涉及水稻原生質體的分離的新方法以及質粒轉化原生質體的相關應用，主要是一種快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法。
【背景技術】
[0002]原生質體瞬時表達是細胞功能學研究的重要操作手段。近年來，雙子葉植物擬南芥原的生質體被廣泛用于胞內運輸機制的探索、蛋白的亞細胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA與蛋白質的相互反應等許多領域。單子葉植物水稻的原生質體的相關報道也越來越多。但由于研究起步較晚，在原生質體分離和轉化的方法上還有很多可以改進的地方。在過去很長一段時間內，單子葉植物原生質體是借助植物組織培養技術建立的懸浮細胞培養體系分離而來的，這種方法所需周期較長，且培養過程中容易染菌，并不能做到瞬時、快捷。研究發現，以水稻幼莖，葉和葉鞘等組織為試驗材料，也可以分離出優質的原生質體。但幼莖、葉及葉鞘的原生質體形態上還有一定的差別，這些差別并沒有完全證實。此外，不管是在擬南芥、水稻還是其他植物的原生質體分離過程中，在獲取原生質體的過程中都采用離心的方法收集，容易混有大量的細胞碎片，會干擾后續過程中的轉化效率及其他酶促反應。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，而提供一種快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法，它能夠克服采用離心法分離原生質體造成細胞碎片等雜質含量高的缺陷；明確莖、葉原生質體的形態差異；得到高純度的原生質體；增進轉化效率。[0004]本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法，主要是根據密度梯度自沉降的方法可以不使用離心而使大小均一的細胞在合適的濃度梯度上沉淀，以及原生質體自身可以攝取外源大分子物質的原理，酶解水稻幼莖細胞壁獲得的原生質體和建立高效的瞬時表達體系，該方法包括如下步驟:
[0005]( I)水稻種子去穎殼，消毒；
[0006](2)消毒種子在1/2MS培養基上培養10-15天，待其長成15_20cm高的幼苗；培養條件:25°C，光照12h，黑暗12h，光照強度:8000Lux ；
[0007](3)取水稻幼莖，剝去葉鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入滲透劑，暗條件放置20-30分鐘；所述滲透劑為0.3mol/L山梨醇和50mM氯化鈣的混合液TVL ；
[0008](4)加入酶解液酶解細胞壁以獲得原生質體；具體方法如下:在室溫22_25°C條件下，將酶解液加入的水稻幼莖和滲透劑的混合液中，真空抽濾Ih ;然后置于水平搖床上60r/min 搖 4h ；
[0009](5)用25um的尼龍網膜過濾酶解后的混合物，棄濾渣；濾液上層緩慢滴加等滲的W5溶液，4°C濾液靜置30min以上，待溶液分層；
[0010](6)吸取中層IOml的原生質體，用10mlW5溶液洗滌(100g離心5-10min，棄上清)，2-3次，即獲得較為純凈的原生質體；[0011](7)原生質體轉化:以終濃度為20%的PEG為媒介，將帶有35S驅動的增強型綠色熒光蛋白EGFP的質粒pSTANl轉化進入原生質體:轉化體系如下:10ul質粒，IOOul原生質體用MMG溶解，11Ou140%的PEG-Cacl2 ;室溫放置5_15min，然后加入W5溶液至反應體系的總體積為Iml以終止反應；100g離心5min，去上清；再加入Iml W5懸浮原生質體，于25°C黑暗條件下培養2-24小時。
[0012]所述的消毒方法如下:體積百分比為70%酒精洗30s ;蒸餾水洗一次；體積百分比為50%NaC10搖洗30min ;滅菌蒸懼水洗8_10次。
[0013]所述的酶解液為3%纖維素酶R-1O和0.6%果膠酶R_10、1M蔗糖、pH5.7的0.2MMESUM 二水氯化鈣、2M氯化鎂配制成的混合液，55°C溫育lOmin，使蛋白酶失活，冷卻后過濾除菌。
[0014]轉化時，原生質體需預先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液懸浮，MMG由4mMMESρΗ5.7，0.4Μ Mannitol, 15mM MgCl2 組成，轉化采用的媒介為 PEG，由 40%PEG4000，0.2MMannitol, IOOmM CaCl2 組成。
[0015]本發明的有益效果是:使用本方法簡單快速，應用真空抽濾，使細胞產生輕微的質壁分離，加速滲透劑和酶液的滲透，能大大提高酶解效率。在短時期的酶解后，就能獲得大量游離細胞。采用密度梯度自沉降法可從水稻的幼莖中分離到高純度的原生質體細胞，細胞內的葉綠體含量少，大小較為一致，在較高倍的物鏡下可清晰的辨別細胞器的結構為后續的轉化和其它分子生物學操作提供方便。并通過改變后續轉化時的質粒濃度，轉化時間和轉化條件等參數，建立起一個快速、簡便并高效的水稻原生質體瞬時表達系統，為今后水稻基因功能組學研究搭建了一個可 靠的技術平臺。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是采用離心法和密度梯度自沉降法獲得的原生質體對比圖
[0017]圖2是離心和自沉降所獲原生質體二乙酸熒光素染色對比圖(12x)
[0018]圖3是不同濃度質粒轉染原生質體的活力對比圖1
[0019]圖4是不同濃度質粒轉染原生質體的活力對比圖2 ；
[0020]圖5是不同轉化條件下所得原生質體活力對比圖。
【具體實施方式】
[0021]下面通過【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發明，但本發明并不僅僅局限于下述實施例。
[0022]實施例中，使用的溶液組成如下:
[0023]TVL 溶液:0.3mol/LSorbitol,50mM CaCl20
[0024]W5 溶液:154mM NaCl, 125mM CaCl2.2H20, 5mM KCl,2mM MES (pH5.7)。
[0025]酶解液:1MSurcose,0.2M MES (pH5.7), IM CaCl2.2H20, 2M KCL, 3%Cellulase,
0.6%Mecerozyme ;酶解液先在55?水浴中溫育lOmin,除蛋白酶,然后用濾膜過濾除菌。
[0026]MMG 溶液:4mM MES (ρΗ5.7),0.4M Mannitol, 15mM MgCl20
[0027]PEG 轉化液:40%PEG4000，0.2M Mannitol, IOOmM CaCl20
[0028]1/2MS培養基:每升水中含1.1g MS, 0.125g MES, IOg蔗糖以及4g植物凝膠，調pH至5.7。水稻原生質體的分離
[0029]I)取適量顆粒飽滿的日本晴種子去穎殼，裝入50ml無菌離心管，70%的乙醇洗30s ;無菌水清洗一次；加入足量50%的次氯酸鈉,置水平搖床消毒30min后在超凈臺用滅菌蒸餾水洗8-10次。
[0030]2)種子在1/2MS培養基上培養至12天齡。培養條件:溫度25°C，光照12h，黑暗12h，光強:8000Luxo
[0031]3)在超凈臺上用鋒利的手術刀片將植物組織切成0.5mm大小條段，轉入裝有15mlTVL溶液的小燒杯中靜置20-30分鐘。[0032]4)加入酶液15ml，搖勻，抽真空Ih ；
[0033]5)置于水平搖床上，25°C黑暗條件下，60rpm，搖4h。
[0034]6)用25um的尼龍膜過濾酶解后的混合液到無菌的50ml離心管中，棄濾洛,在濾液上層緩慢滴加20ml W5溶液，4°C靜置30min以上，發現分層現象。
[0035]7)吸取中層的原生質體富集層溶液約IOml左右至50ml離心管，加入等體積的W5溶液，混勻；水平低速離心機100g離心5min，去上清；再加入IOml W5重懸原生質體，100g離心5min，去上清。最后加入2_3mlW5，即可得到較為純凈的原生質體。
[0036][0029]葉、葉鞘及幼莖原生質體分離
[0037]a.培養出的12天齡的水稻“日本晴”幼苗分別取葉、葉鞘及幼莖切成0.5mm大小片段，放入錫箔紙包裹的裝有15mlTVL溶液的小燒杯20min ;加入過濾除菌的酶液，抽真空Ih ;放置水平搖床上,60rpm,搖4h。
[0038]b.用25um的尼龍膜將濾液過濾到50ml離心管中，輕輕地擠盡濾液,盡量減少體積損失。用移液槍在濾液上方緩慢滴W5溶液20ml，4°C靜置30min以上。
[0039]靜置后的結果，由葉和葉鞘分離的原生質體量極少，基本沒有分層現象，而由幼莖分離的原生質體富集層相當明顯。
[0040]吸出中間層溶液10ml，用W5洗2_3次，得到的原生質體在顯微鏡下觀察，葉及葉鞘分離的原生質體富含葉綠體，且細胞較小。而由幼莖分離的原生質體細胞較大，液泡較為明顯，細胞內結構比較清楚，更便于顯微觀察。
[0041]密度梯度自沉降法和離心法的比較
[0042]I)水稻“日本晴”種子在1/2MS培養基上培養至12天齡。培養條件:溫度25°C，光照12h，黑暗12h，光強:
[0043]2)幼莖切成0.5mm大小片段，放入錫箔紙包裹的裝有15ml TVL溶液的小燒杯20min ;加入過濾除菌的酶液,抽真空Ih ;放置水平搖床上,60rpm,搖4h。
[0044]3)用25um的尼龍膜將濾液過濾到50ml離心管中，擠盡濾液，盡量減少體積損失。用移液槍在濾液上方緩慢滴W5溶液20ml，4°C靜置30min以上。
[0045]4)將中層原生質體吸出10ml，用W5液體洗滌2_3次(加入IOml W5溶液，100g離心lOmin，去上清)，再加入3ml W5，所得懸浮液為密度梯度自沉降法分離的原生質體。
[0046]5)用上述同樣的方法培養和酶解水稻組織，并用100g離心IOmin的方法收集原生質體，得到的沉淀即為離心法所分離的原生質體。
[0047]6)分別兩種方法所得的原生質體溶液IOOul，用等體積的0.01%FDA (二乙酸熒光素)染色IOmin,加入800ulW5稀釋到1ml, 100g離心5min,去上清,再加入適量W5,混勻。用熒光顯微鏡拍攝白光和綠色熒光下的原生質體并計數，計算發熒光的原生質體與總原生質體數的比值(取三個視野，計算平均值)。
[0048]兩種方法所得的原生質體如圖1所示，圖1結果顯示，離心所得的原生質體小，富含葉綠素的原生質體和細胞碎片較多，而密度梯度自沉降所得的原生質體大，純度高，且細胞內結構清晰易辨認，有利于下游操作過程的顯微觀察。
[0049]FDA染色結果如圖2所示，通過計算原生質體活力，可知離心所得原生質體含有許多失去活力的細胞，整體活力明顯低于自沉降法所得。
[0050]計算自沉降法所得的原生質體得率，盡管有一部分留在離心管中沒有吸出來，但計數上顯示，由此方法分離的原生質體個數仍可達1.68X IO7個/gFw，數量上相當可觀，按每次轉化用3 X IO5個計，可轉化56次。
[0051]水稻原生質體的瞬時轉化
[0052]I)原生質體于冰上放置30min, 100g離心5min,去上清；
[0053]2)加入1.5-2mlMMG重懸原生質體。
[0054]3)在2ml圓底離心管中加入質粒DNAlOul。
[0055]4)加入原生質體IOOul，與質粒均勻混合。
[0056]5)加入PEG轉化液IIOul，輕拍離心管底部，使液體混合均勻，室溫放置5分鐘以上。
[0057]6)加入W5至離心管中總體積Iml,終止反應；100g離心5min,去上清。
[0058]7)加入Iml W5重懸原生質體，25°C暗條件培養過夜。
[0059]8)吸取上層清液，留約lOOul，輕拍離心管底，懸起原生質體。
[0060]9)由于原生質體的轉化效率受多方面因素的影響，為使原生質體瞬時表達體系的應用更為方便，做了如下調整:
[0061]不同濃度質粒轉化水稻原生質體的瞬時表達體系設置不同的質粒濃度，即IOul質粒中分別含有lug、3ug、5ug、7ug、10ug,分別轉化原生質體,在突光顯微鏡下觀察,所得圖片如圖3-4。圖3-4結果顯示，隨著質粒濃度的增大，發綠色熒光的原生質體數量逐漸增多。當質粒濃度在0.7ug/ul時已轉化效率已達到70%-75%，能滿足下一步的顯微觀察及其它細胞生物學和分子生物學實驗要求。
[0062]轉化時給予不同環境條件處理
[0063]加入PEG后，對轉化體系做了如下處理:(I)室溫放置5min ; (2)室溫放置IOmin ；
(3)室溫放置15min;(4)冰上放置5min，42°C水浴5min，冰上放置5min ; (5)室溫放置5min，42°C水浴5min，室溫放置5min。通過計算轉化效率，得到了下表結果圖5 (1:常溫放置5min ；2:常溫放置IOmin ；3:常溫放置15min ；4:冰上放置5min，42°C熱激5min，冰上放置5min ；5:室溫放置5min，42°C 5min,室溫5min)，室溫放置時間在IOmin左右時，轉化效率明顯高于室溫放置5min和15min，可見轉化時放置時間過短或太長都對轉化效率有消極影響。另外，熱激處理結果顯示，先經過冰上處理再經過熱激處理的轉化體系，最終轉化效率明顯低于只經過熱激處理的轉化體系。由此推斷，在轉化過程中，太過劇烈的溫度變化會對原生質體造成一定的傷害，但在常溫條件下對原生質體進行42°C熱激對轉化效率的提高有促進作用的。
[0064]最后需要說明的是，除本實施例外，本發明還可以有其它實施方式和變形，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。凡本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變 形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法，其特征在于:該方法包括如下步驟: (1)水稻種子去穎殼，消毒； (2)消毒種子在1/2MS培養基上培養10-15天，待其長成15-20cm高的幼苗；培養條件:25°C。，光照12h，黑暗12h，光照強度:8000Lux ； (3)取水稻幼莖，剝去葉鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入滲透劑，暗條件放置20-30分鐘；所述滲透劑為0.3mol/L山梨醇和50mM氯化鈣的混合液TVL ； (4)加入酶解液酶解細胞壁以獲得原生質體；具體方法如下:在室溫22-25°C條件下，將酶解液加入的水稻幼莖和滲透劑的混合液中，真空抽濾Ih ;然后置于水平搖床上60r/min 搖 4h ； (5)用25um的尼龍網膜過濾酶解后的混合物，棄濾渣；濾液上層緩慢滴加等滲的W5溶液，4°C濾液靜置30min以上，待溶液分層； (6)吸取中層IOml的原生質體，用10mlff5溶液洗滌，100g離心5-10min，棄上清，2-3次，即獲得較為純凈的原生質體； (7)原生質體轉化:以終濃度為20%的PEG為媒介，將帶有35S驅動的增強型綠色熒光蛋白EGFP的質粒pSTANl轉化進入原生質體:轉化體系如下:10ul質粒，IOOul原生質體用MMG溶解，11Ou140%的PEG-Cacl2 ;室溫放置5_15min，然后加入W5溶液至反應體系的總體積為Iml以終止反應；100g離心5min，去上清；再加入Iml W5懸浮原生質體，于25°C黑暗條件下培養2-24小時。
2.根據權利要求1所述的快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法，其特征在于:所述的消毒方法如下:體積百分比為70%酒精洗30s ;蒸餾水洗一次；體積百分比為50%NaC10搖洗30min ;滅菌蒸餾水洗8-10次。
3.根據權利要求1所述的快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法，其特征在于:所述的酶解液為3%纖維素酶R-1O和0.6%果膠酶R-10、IM蔗糖、pH5.7的0.2M MES、IM 二水氯化鈣、2M氯化鎂配制成的混合液，55°C溫育lOmin，使蛋白酶失活，冷卻后過濾除菌。
4.根據權利要求1所述的快速高效的水稻原生質體制備和轉化方法，其特征在于--轉化時，原生質體需預先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液懸浮，MMG由4mM MES pH5.7，.0.4M Mannitol，15mM MgCl2 組成，轉化采用的媒介為 PEG,由 40%PEG4000,0.2M Mannitol，IOOmM CaCl2 組成。
【文檔編號】C12N5/04GK103710377SQ201310467412
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年10月9日 優先權日:2013年10月9日
【發明者】朱英, 段煉, 徐恒, 錢君, 郭小雨 申請人:浙江省農業科學院