一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)-Rg3的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物醫藥領域，涉及稀有人參皂苷20(S)-Rg3的制備方法，尤其涉及利用重組表達的來源于Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶和Thermotogapetrophila的β-葡萄糖苷酶轉化人參皂苷Rbl、Rb2、Rc生成20(S)-Rg3。
【背景技術】
[0002]人參Panaxginseng是亞洲傳統的名貴中藥材，具有生物活性廣泛，藥理作用獨特等特點，但其化學成分復雜。隨著分析技術的革新，人參主要的化學成分得到了進一步的明確。研究發現，人參皂苷是人參主要的生物活性物質，到目前為止，已經分離鑒定180余種人參皂苷單體，其中5種主要皂苷(人參皂苷Rbl、Rb2、Rc、Re和Rgl)占總皂苷的80%以上，而人參皂苷(Rhl、Rh2、Compound K、Rg2、Fl和Rg3 )含量很低，稱為稀有皂苷(App I i edMicrob1logy and B1technology ,2012,94:673-682)，但其藥理活性優于上述高含量的人參皂苷。
[0003]稀有人參皂苷20(S)_Rg3具有抑制腫瘤細胞增殖、粘附侵襲和轉移，促進腫瘤細胞的凋亡，提高機體免疫機能等生理作用。但稀有皂苷20(S)-Rg3在植物中含量很低，直接提取工藝復雜，成本太高。而人參皂苷Rbl、Rb2和Re是人參總皂苷中含量最高的幾種人參皂苷。它們與稀有人參皂苷20(S)-Rg3具有相似的母核結構，唯一的差別是在20位上的糖基側鏈(圖1)。如果能專一性的切除Rbl、Rb2和Re在20位上的糖基側鏈，就可以得到稀有人參皂苷20(S)-Rg3。
[0004]將人參皂苷Rbl、Rb2、Rc轉化為20(S)_Rg3的方法有化學法和生物法。但化學轉化法因其反應劇烈、選擇性差、無法得到20(S)-Rg3純品等缺點而不被采用。生物轉化具有反應條件溫和，特異性好等特點，而受到青睞。如Cheng等發現新細菌MicrobacteriumSP.GS514能轉化人參皂苷Rbl生成稀有人參皂苷20(S)-Rg3，但存在轉化周期較長，轉化率低下等缺點(Phytochemi s try，2008，69:218-2 24)。本課題組在前期的研究中也發現了一種β-葡萄糖苷酶能轉化人參皂苷Rbl生成稀有人參皂苷20(S)-Rg3(中國專利201410510836.6)。但目前還沒有文獻報道能同時轉化人參皂苷Rbl、Rb2和Re生成20(S)_Rg3。同時轉化人參皂苷Rbl、Rb2和Re，能提高資源利用率和降低人參皂苷原料的提取成本，但各種酶對底物的專一性不同，降解的糖苷鍵類型也各不相同。因此，尋找能高效、特異性降解人參皂苷Rbl、Rb2和Re生產人參皂苷20(S)-Rg3的糖苷水解酶成為了研究關鍵，同時選擇的酶必須有相似的最適反應PH和溫度，能進行協同降解。
【發明內容】
[0005]解決的技術問題:本發明提供了一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)_Rg3的方法，該方法所使用的重組酶分別來源于Thermotoga petrophiIa的β-葡萄糖苷酶和Thermotogathermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0006]技術方案:一種酶法制備稀有人參皂苷20(S)_Rg3的方法，利用來源于ThermotogapetrophiIa的β-葡萄糖苷酶和Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人參皂苷Rbl、Rb2和Re生產20(S)-Rg3。
[0007]上述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]上述阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示ο
[0009]上述β-葡萄糖苷酶是通過重組表達制備的，步驟為:
[0010](I)以提取的Thermotoga petrophila基因組DNA為模板，用具有SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得到β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
[0011](2)將β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，連接并轉化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質粒；
[0012](3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主Ε.coli BL21(DE3)，IPTG誘導β-葡萄糖苷酶表達，收集菌體，破碎細胞，70 0C熱處理30分鐘，獲得純化的β_葡萄糖苷酶。
[0013]上述阿拉伯呋喃糖苷酶是通過重組表達制備的，步驟為:
[0014](I)以提取的Thermotoga thermarum DSM 5069的基因組DNA為模板，用具有SEQID NO:7所示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得到阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子；
[0015](2)將阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子和pET_28a分別用Nco I和Xho I進行雙酶切，連接并轉化得到含有阿拉伯呋喃糖苷的DNA分子的重組質粒；
[0016](3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導阿拉伯呋喃糖苷表達，收集菌體，破碎細胞，70 0C熱處理30分鐘，離心獲阿拉伯呋喃糖苷。
[0017]酶法制備稀有人參皂苷20(S)_Rg3的方法，降解條件為:Rbl、Rb2、Rc各Ig/L，f3_葡萄糖苷酶0.15U，阿拉伯呋喃糖苷酶0.6U，pH 5.0，85°C條件下，降解Ih，最終可以將人參皂苷Rbl、Rb2、Rc轉化為人參皂苷20(S)-Rg3，摩爾得率為97.3%。
[0018]有益效果:
[0019]1.本發明可以同時對人參皂苷Rbl、Rb2和Re轉化生成20(S)_Rg3，可以提高資源利用率和降低人參皂苷原料的提取成本。
[0020]2.本發明中的酶對Rbl、Rb2和Re轉化能力強，本發明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能在Ih內幾乎將人參皂苷Rbl、Rb2和Re完全轉化為20(S)-Rg3。
[0021 ] 3.本發明中所述的β_葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶專一性強，能特異性降解20位側鏈上的糖基，幾乎無反應副產物。
[0022]4.本發明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能協同降解，具有相似的最適反應pH和反應溫度。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發明中Rbl、Rb2、Rc和20(S)_Rg3的結構示意圖；
[0024]圖2是本發明實施例提供的溫度對糖苷酶活性的影響；
[0025]圖3是本發明實施例提供的pH對糖苷酶活性的影響；
[0026]圖4是本發明實施例提供的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶對人參皂苷Rbl、Rb2、Rc的轉化圖。
【具體實施方式】
[0027]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅為本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0028]為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明進行詳細闡述，其中，如無特殊說明，實施例中涉及的各種反應試劑均可以通過商業渠道購買得到;如無特殊說明，實施例中涉及的具體操作參見《分子克隆實驗指南第三版》。
[0029]實施例1:重組質粒pET-20b_bgl的構建
[0030]I.IThermotoga petrophila的培養
[0031 ] Thermotoga petrophi I a購于D SMZ菌種保藏中心(www.dsmz.de)編號為D SM13995 ο其培養基配方為:10g/L可溶性淀粉，3g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，5g/L肉浸液，10g/L2-嗎啉乙磺酸，10mg/L七水合硫酸鐵，lmg/L刃天青，調pH為7.2，煮沸充氮氣，除去氧氣后，培養基在無氧條件下裝入厭氧瓶滅菌。用注射器按照0.5wt接種量接種，85°C靜止培養24h，收集細胞。
[0032]1.2基因組DNA的提取
[0033](I)靜置培養Thermotoga petrophila 24h，取30mL菌液4，000g離心1min收集細胞。
[0034](2)用9.5mL TE緩沖液重懸菌體，加入0.5mL 1wt十二烷基硫酸鈉(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均勻，37°C保溫Ih。
[0035](3)加入 1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)/NaCl，混勻，65°C 溫育 20min。
[0036](4)加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，混勻，6，OOOg離心1min。
[0037](5)為防止剪切力造成基因組DNA斷裂，用粗口吸管將上清轉入另一離心管中，加入等體積酸/氯仿/異戊醇混勾(體積比25:24: I) ,6,OOOg離心1min。
[0038](6)另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕晃動至白色絲狀DNA沉淀清晰可見。
[0039](7)用吸管將DNA纏繞其上，在70vt.%酒精中清洗。
[0040](8)用無菌牙簽將DNA從吸管上刮下，轉入1.5mL離心管中。
[0041 ] (9)室溫下風干，加500yL TE緩沖液溶解。
[0042 ] (10)取50yL用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度。
[0043]1.3重組質粒pET-20b_bgl的構建
[0044]按照已知的Thermotoga petrophila極耐熱β-葡萄糖苷酶基因(YP_001244492.1)設計引物(SEQ ID Ν0:5)下劃線表示Nde I酶切位點；(SEQ ID Ν0:6)下劃線表示Xho I酶切位點，并去除終止密碼子；以提取的Thermotoga petrophila的基因組DNA為模板，用合成的引物進行PCR擴增，擴增的條件是95°C，3min;30次循環(94°C，30s;58°C，30s;72°C，2min I Os); 72 °C，I Omin;反應停止，4 °C保溫。通過凝膠回收試劑盒對PCR擴增產物進行純化。得到Thermotoga petrophiIa極耐熱β-葡萄糖苷酶基因。
[0045]得到Thermotoga petrophi Ia極耐熱β-葡萄糖苷酶基因和pET_20b分別用Nde I和Xho I進行雙酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌ToplOF’感受態細胞，轉化產物涂布到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)固體培養基上37°C過夜培養，接種幾個單菌落到LB(添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L)液體培養基中培養8-10小時后，收集菌體提取質粒，酶切驗證去除空載質粒，將重組質粒進行核酸序列測定，得到正確的重組表達載體pET20b-bgl。
[0046]2.重組極耐熱β_葡萄糖苷酶的表達及純化
[0047]將重組質粒pET-20b_bgl轉化大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Amp(100yg/mL)的LB平板(LB培養基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L)上經過37 °C培養過夜，挑轉