一種耐高溫中性蛋白酶HuPro及其基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種具有耐高溫中性蛋白酶HuPro及其基因和應用。本發明提供了一種來源于Humicola?sp.P8的中性蛋白酶HuPro，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，且本發明提供了編碼上述中性蛋白酶的編碼基因hupro。本發明的中性蛋白酶具有以下性質：最適pH8.0，在中性和堿性范圍內依然保持較高酶活，最適溫度65℃，良好的pH和熱穩定性，并且具有廣泛的底物特異性。
【專利說明】—種耐高溫中性蛋白酶HuPro及其基因和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種耐高溫中性蛋白酶HuPiX)及其基因和應用。
【背景技術】
[0002]蛋白酶是一類催化多肽或蛋白質水解的酶的統稱。按水解底物的部位可分為內肽酶和外肽酶，前者水解蛋白質中間部分的肽鍵，后者則自蛋白質的氨基或羧基末端逐步降
解氨基酸殘基。
[0003]中性蛋白酶有著廣泛的應用，例如:造紙，釀造，紡織，飼料等領域。但是，不同的工業應用，對蛋白酶的性質的需求是不同的，如:飼料工業需要嗜酸的蛋白酶，能源、紡織工業需要中堿性的中性蛋白酶。目前工業應用的中性蛋白酶,主要來自Trichoderma和Penicillium spp.,這些酶的最適pH在5.0左右,最適溫度在50-60度之間，而中性、熱穩定性好的酶則有更好的優勢:耐熱可以提高反應速率，降低底物的粘度，同時還可以抑制其他微生物的生長。
[0004]本發明的中性蛋白酶具有以下性質:最適pH8.0，在pH5.0~10.0范圍內具有50%以上的酶活力，最適溫度65°C，良好的熱穩定性，在65°C處理I個小時酶活幾乎沒有損失，并且具有很高耐蛋白質變性劑和有機溶劑等特性。熱穩定性優良并在中性和堿性范圍內具有較高酶活力的特性使其在洗滌、紡織、食品工業應用上具有很大的潛力。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種能高效應用的耐熱中性蛋白酶。
[0006]本發明的再一目的是提供編碼上述耐熱中性蛋白酶的基因。
[0007]本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008]本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009]本發明的另一目的是提供一種制備上述耐熱中性蛋白酶的基因工程方法。
[0010]本發明的另一目的提供上述耐熱中性蛋白酶的應用。
[0011]本發明從腐質霉(Humicola sp.L8)中分離得到一種新的耐高溫中性蛋白酶HuPro ο
[0012]本發明提供了一種中性蛋白酶HuPro，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]SEQ ID N0.1:
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[0021]其中，該酶包括535個氨基酸和一個終止密碼子，N-端15個氨基酸為信號肽，因此，成熟的中性蛋白酶HuPro的理論分子量為56.3kDa[0022]因此，成熟的中性蛋白酶HuPro的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示
[0023]aprasvdtihsdaapi Isssnaeivpnsyiikfkkhvnddkvqahhawiqeihsdreaqradlrkrglvddvfrglkhtykigs
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[0030]本發明的HuPix)同時具有好的熱穩定性，常溫下，在中性和堿性的范圍內均具有高活性。本發明的中性蛋白酶，其最適pH值為8.0，在pH5.0~10.0的范圍內維持50%以上的酶活性；最適溫度為65°C，在65°C和70°C具有良好的熱穩定性。
[0031]本發明提供了編碼上述耐熱中性蛋白酶的基因hupro。具體地，該基因的序列如SEQ ID N0.2 所示:
[0032]atgagaggccttttcgctctctctctcgcggcctgcgtcgctgctgcgccgcgcgccagcgtcgacaccatccacagtgatgccg
[0033]ctcccattctctcatcttctaacgccgagattgtccccaactcgtacatcatcaagttcaagaagcatgtcaacgacgacaaggttca
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[0051]成熟中性蛋白酶HuPio編碼基因序列如SEQ ID N0.4所示
[0052]gcgccgcgcgccagcgtcgacaccatccacagtgatgccgctcccattctctcatcttctaacgccgagattgtccccaactcgta
[0053]catcatcaagttcaagaagcatgtcaacgacgacaaggttcaggcccaccatgcttggatccaggagattcattcggaccgtgag
[0054]gcgcagcgcgccgacctccggaagcgtggcctggttgacgacgtcttccgcggcttgaagcacacctacaagatcggctccga
[0055]cttcatcggctactcgggccactttgatgacgaggtcatcgagaaggtccggaggcacccagatgttgagtacattgagcgcgac
[0056]agcgtcgtccataccatgcgctacgttgaggaggagagcaagtgcgacggtgacgttgagaaggctgccCCttggggtctggcc
[0057]cgtatctcgcaccgggaacgcctcggcttctccaccttcaataagtacctctacgcctctgagggtggt
【權利要求】
1.一種耐高溫中性蛋白酶HuPro，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.3所示。
2.一種耐高溫中性蛋白酶基因hupro，其特征在于，編碼權利要求1所述的耐高溫中性蛋白酶HuPro。
3.如權利要求2所述的耐高溫中性蛋白酶基因hupro，其特征在于，其堿基序列如SEQID N0.2 或 SEQ ID N0.4 所示。
4.包含權利要求2所述耐高溫中性蛋白酶基因hupro的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為載體pPIC-hupix)
6.包含權利要求2所述耐高溫中性蛋白酶基因hupro的重組菌株。
7.根據權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，
8.一種制備權利要求1所述耐高溫中性蛋白酶HuPix)的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株； 2)培養重組菌株，誘導重組中性蛋白酶表達； 3)回收并純化所表達的中性蛋白酶HuPro。
9.權利要求1所述耐高溫中性蛋白酶`HuPro的應用。
【文檔編號】C12N9/58GK103497943SQ201310478921
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】詹志春, 張菁 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司