一種新克隆載體pAT3733的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一個同時具有氨芐青霉素和四環素抗性基因標記的插入失活型克隆載體pAT3733。該載體是通過雙酶切去除pBR322上的Rop基因，補平末端后自連而獲得。pAT3733不僅保留了pBR322的插入失活篩選標記，而且分子量更小，穩定性更高，質粒拷貝數提高3倍以上，便于基因克隆操作，工作效率更高。可替代目前廣泛使用的pBR322質粒，成為通用的高效克隆載體。
【專利說明】—種新克隆載體PAT3733
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【技術領域】
[0002]本發明涉及生物工程【技術領域】，具體涉及一種克隆載體質粒。
[0003]
【背景技術】
[0004]質粒PBR322是最早用人工方法構建成功的一種較理想的克隆載體，至今仍是基因工程中最常用和最具代表性的質粒，被廣泛地用于基因工程，有“萬能載體”之稱。它是由博利瓦(Bolivar)等人于1977年構建而成的，是一個典型的人工質粒載體。它具有較小的相對分子質量，因而裝載較大量的外源DNA ;它具有較高的拷貝數，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便；它還具有兩種抗菌素抗性基因，即氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因。這為檢測重組體質粒提供了方便。但pBR322質粒中的R0P(Repressor Of Primer)因子控制了 PBR322質粒的拷貝數，從而降低了其質粒的復制能力，一般只能有15~20個拷貝。目前，雖然從PBR322中已經開發研制出了諸如pUC序列等許多應用廣泛的質粒，但由于PBR322同時含有氨芐青霉素和四環素兩種抗性篩選基因，非常便于篩選克隆，依然是許多研究者的首選克隆載體。在PBR322中，由于沿設基因的存在，質粒DNA復制受到嚴重影響，DNA的拷貝數低，產 量低，從而影響實驗研究工作效率和效果。
[0005]
【發明內容】
[0006]為了克服pBR322質粒拷貝數低的缺點，本發明提供一種克隆載體，該克隆載體不僅保留了便于篩選重組子的氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因，而且去除了抑制質粒DNA復制的基因，分子量較小，在同等培養條件下的大腸桿菌宿主細胞中，其質粒拷貝數和產量均比pBR322增加了 3倍以上。
[0007]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
1、質粒PBR322經過限制性內切酶I +Aor 13H I雙酶切后，得到兩個DNA片段，大小分別為632bp和3729bp。其中632bp的小片段是含有沿設基因的DNA片段，棄除。而3729bp大片段含有完整的辦?//、Tetjf,以及7?印基因，回收該片段備用。
[0008]2、用DNA聚合酶I (Klenow fragment)在dNTP存在的條件下,將回收的3729bpDNA片段末端補平，在T4 DNA連接酶的催化下自連，自連產物用熱擊轉化法轉化到大腸桿菌JM109中。在含有氨芐青霉素和四環素的雙抗LB培養基上篩選。獲得的轉化子，提取質粒DNA進行酶切鑒定驗證。
[0009]3、最終獲得的新質粒pAT3733，其分子量大小為3733bp。該新質粒不含有沿設基因。
所述的PAT3733屬于大腸埃希氏菌，拉丁文名稱為Escherichia coli，于2013年7月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為:7918。
[0010]本發明的有益效果是，該克隆載體不僅保留了便于篩選重組子的氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因，而且去除了抑制質粒DNA復制的辦/7基因，分子量較小，在同等培養條件下的大腸桿菌宿主細胞中，其質粒拷貝數和產量均比PBR322增加了 3倍以上。
[0011]【專利附圖】
【附圖說明】 [0012]附圖是本發明的限制性內切酶圖譜。
[0013]圖中I~39分別表示pAT3733上的39個限制性內切酶酶切位點，依次代表-.CleiI (24)(括號內為酶切位點所在的整個分子內核苷酸位置，下同III (29), Afa I(165)、&oR I (187)、船e I (229), Bfa I (230)、^a?H I (375), Ban II (475), Ban II(489)、&o0109 I (524)、5^ I (566),Sal I (651),Nine II (653),Bgl I (935)、&o52I (939),Bgl I (1169)、&oT14 I (1369)、I (1425)、&o0109 I (1439)、&o0109 I(1481)、及fa I (1489)、々?aL I (2159)、及fa I (2430)、及fa I (2593)I (2604)I(2623),BgI I (2858)、/^^Β I (2910)、及fa I (2928),Pst I (2983),Pvu I (3108)^/aI (3218),Sca I (3218)、歷ic II (3279)I (3315)I (3405)II (3660)、
0109 I (3714)、&oR I (3731)。
[0014]圖中A表不四環素抗性基因，所在核苷酸位置是86~1276bp,分子大小1190bp ;B表不氨節青霉素抗性基因，所在核苷酸位置是2665~3525bp,分子大小為860bp ；C表不復制子，所在核苷酸位置是1891~2505bp，分子大小為614bp。
[0015]
【具體實施方式】
[0016]本發明中所涉及的生物材料pBR322為已公開或商品化的材料，具體購于Takara公司。
[0017]在附圖所示的實施例中，第86_1276bp為四環素抗性基因，大小為1190bp，其中有&oR V (187bp)、漢.Η I (375bp),5a7 I (651bp)等多個限制性內切酶酶切位點。第1891-2505bp 為 Tfe/?基因，大小為 614bp，其中有I (2159bp)、及fa I (2340bp)等限制性內切酶酶切位點。第2665-3525為氨芐青霉素抗性基因，大小為860bp，其中有汝./ I(2858)、I (2963bp)、A^ I (3108)等多個限制性內切酶酶切位點。整個質粒的大小為 3733bp。
【權利要求】
1.一種克隆載體質粒，由一個四環素抗性基因和一個氨芐青霉素抗性基因，以及一個復制子構成，其特征是在四環素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因之間只有一個復制子序列，不含有 Rop基因序列。
2.權利要求1所述的質粒，其分子大小為3733bp。
【文檔編號】C12N15/63GK103602694SQ201310486521
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月17日 優先權日:2013年10月17日
【發明者】韋建福 申請人:云南農業大學