專利名稱：pUC19-TVG質粒的構建及使用方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種能夠有效解決基于酶切位點基因融合問題的新載體及其應用示范。
背景技術：
pBR322質粒是目前在基因克隆中廣泛使用的一種大腸桿菌質粒載體。符號質粒載體pBR322中的“P”代表質粒；“BR”代表兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首； “322”是實驗編號。PBR322是一個人工構建的重要質粒，有萬能質粒之稱。在pBR322質粒載體的構建過程中，一個重要目標是縮小基因組的體積，移去一些對基因克隆載體無關緊要的DNA片段，限制酶識別位點，同時還要設法使質粒同存在任何易位子統統失去功能。易位子的轉移(即易位)有可能導致選擇記號的喪失，甚至也有可能使克隆的DNA片段喪失或重排。PBR322質粒是由來源于pBR322質粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因(amp^，來源于pSClOl質粒的四環素抗性基因(tef)和來源于ColEl的派生質粒Pmbl的DNA復制起點(ori)三部分組成。質粒載體PBR322的大小為4361bp，相對分子質量較小的是它第一個優點。優點之二是它帶有一個復制起始位點，保證了該質粒只在大腸桿菌的細胞中行使復制的功能。具有兩種抗生素抗性基因——氨芐青霉素抗性基因和四環素抗性基因，可供轉化子的選擇標記是它的第三個優點。質粒載體PBR322的第四個優點是具有較高的拷貝數， 經過氯霉素擴增以后，每個細胞中可累積1000-3000份拷貝，該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便。
pUC載體是在pBR322質粒載體的基礎上，組入了一個在其5'-端帶有一段多克隆位點的IacZ'基因，而發展成為具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。一種典型的PUC系列的質粒載體，包括來自PBR322質粒的復制起點(ori)、氨芐青霉素抗性基因 (an^)，但它的DNA核苷酸序列已經發生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的單識別位點、大腸桿菌β-半乳糖酶基因(IacZ)的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結構特稱為IacZ'基因和位于IacZ'基因中的靠近5'-端的一段多克隆位點(MCS)區段，但它并不破壞該基因的功能。PUC質粒載體的優點是(I)具有更小的分 子量和更高的拷貝數， 如pUC8為2750bP，pUC18為2686bP。(2)適用于組織化學方法檢測重組體pUC8質粒結構中具有來自大腸桿菌Iac操縱子的=IacZ'基因，所編碼的α _肽鏈可參與互補作用。(3)具有多克隆位點MCS區段pUC8質粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點 MCS區段，它可以在這兩類載體系列之間來回“穿梭”。PUC19載體是pUC載體系列中極具代表性一種質粒，適合于DNA片段的克隆、進行DNA測序、對外源基因進行表達等。雖然PUC19 載體已被國內外研究工作者廣泛使用，但鑒于其功能單一，目前已逐步被其他載體所取代。發明內容
本發明的目的是提供一種能夠有效解決基于酶切位點基因融合問題的方法，該方法基于一種新型的載體PUC19-TVG。同時該載體還能夠解決長片段基因克隆過程中極易出現的錯配問題。
為實現上述目的，本發明的技術方案提供了一種新型的載體PUC19-TVG，所述載體能夠便于實現多基因片段依賴酶切位點的融合及單一基因的分段和拼接，其特征在于，所述載體是基于限制性內切酶酶切及連接原理由載體PUC19改造而來，載體中不含Xho1、Mlu1、Sac1、Kpn1、Cla I, EcoRV, Nco1、Pst1、Bglll、Sail、Pst1、BamH1、Sca1、XbaI 酶切位點，所述PUC19-TVG多克隆位點處序列為(SEQ ID NO :1)，其結構如圖1所示。
本發明公開了 pUC19-TVG的構建方法，具體包括以下步驟
I)引物設計及基因擴增
a.根據pUC19中多克隆位點區域序列設計反向引物TvectorG,
TvectorG 5 ' ~AAGCTTGCGGCCGCACGCGTTATTCGCAGCATCCTCCG~3 ' (SEQ ID NO 2)；
其中TvectorG的Y端包含酶切位點Hind II1、Not1、Mlu 1(下劃線所示)，為構建質粒及基因拼接提供連接端。
b.在 TvectorG 和 pPICZ α 通用引物 5' AOX(5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')的作用下，以pPICZ α質粒為模板擴增出TVG片段并連至PUCm-T載體上，新載體命名為 pUCm-T-TVG。
2)pUC19_TVG 質粒的構建
a.對pUC19及pUCm-T-TVG載體使用Hind III和EcoR I進行雙酶切，并回收pUC19 大片段及基因TVG。b.使用T4DNA連接酶對以上兩步獲得的片段進行連接，得到新載體pUC19-TVG。
本發明還公開了基于PUC19-TVG質粒的基因融合方法。具體包括以下步驟
I)目的基因含酶切位點的引物設計
為實現目的基因A和B的融合，首先根據兩基因的末端序列設計含有包括酶切位點EcoR1、Mlu I,Not I,Xho I,Hind III在內的兩對引物，限制性酶切位點可根據后續步驟所連載體進行選擇其中每個基因所使用的酶切位點前后不同、兩基因所使用的酶切位點前后對應。使用該引物分別以目的基因A和B為模板進行PCR。PCR產物回收后連接至pUCm-T 載體上并獲得質粒pUCm-T-Α和pUCm-T-B。
2)目的基因A與pUC19-TVG載體的連接
使用所選擇的兩種限制性內切酶對質粒pUC19-TVG和pUCm-T-Α進行雙酶切，酶切回收PUC19-TVG大片段及A基因并使用DNA連接酶進行連接，獲得質粒pUC19_TVG_A。
3)目的基因A與B的融合
使用所選擇的兩種限制性內切酶中的任意一種和兩目的基因中均含有的單酶切位點對質粒PUC19-TVG-A和pUCm-T-B進行雙酶切，回收pUC19_TVG_A質粒大片段和B基因片段并使用DNA連接酶進行連接，獲得包含融合基因的質粒pUC19-TVG-AB。
本發明的有益成果本發明的目的是提供了一種新型的載體PUC19-TVG。該載體是基于限制性內切酶酶切及連接原理由載體PUC19改造而來，載體中含有包括EcoR1、 Mlul、Notl、Xhol、HindIII 在內的多克隆位點，不含 Xho1、Mlu1、Sac1、Kpn1、Cla1、 EcoRV、Nco1、Pst I,Bglll,Sal I,Pst I,BamH I,Sca I,Xba I 酶切位點，因此該載體能夠實現多基因片段依賴酶切位點的融合及單一基因的分段和拼接，同時該載體還可以用于解決長片段基因克隆過程中極易出現的錯配問題，具有一定的應用潛力以及經濟價值。
圖1 :質粒pUC19-TVG的多克隆位點結構示意圖具體實施方式
本發明中所涉及的生物材料均為已公開或商品化的材料，具體可通過以下方式獲得
載體pUC19 :購于 Novagen 公司；
以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。
實施例1質粒pUC19-TVG的構建
質粒pUC19-TVG的構建流程具體步驟如下
I)根據pUC19中多克隆位點 區域序列設計反向引物TvectorG,
TvectorG 5 ' ~AAGCTTGCGGCCGCACGCGTTATTCGCAGCATCCTCCG~3 ' (SEQ ID NO 2)；
其中TvectorG的5'端包含酶切位點HindII1、Not1、Mlu 1(下劃線所示)，為構建質粒及基因拼接提供連接端。在TvectorG和pPICZ α通用引物5' A0X(5' -GACTGGTTC CAATTGACAAGC-3')的作用下，以pPICZ α質粒為模板擴增出TVG片段(94°C 3min ；30個循環，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C lOmin)。將 PCR 產物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析， 回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-TVG)，轉化大腸桿菌JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。
2)對pUC19及pUCm-T-TVG載體使用HindIII和EcoR I進行雙酶切，時間為4h， 使用1. O %瓊脂糖凝膠電泳回收大小約為2. 6kb的大片段和250bp的TVG。使用T4DNA連接酶對以上兩步獲得的片段進行連接得到新載體pUC19-TVG并轉化大腸桿菌JM109。經酶切鑒定正確后送上海生工測序。
實施例2木聚糖酶基因XynllB與xynlID的融合
I)為實現木聚糖酶基因XynllB(目的基因A)前406bp片段和xynllD(目的基因B)后388bp片段的融合，使用限制性內切酶EcoR I和Not I對質粒pUC19_TVG和 pUCm-T-xynllB(專利申請號201010581376. 8)進行雙酶切，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收大小約為2. 6kb的大片段和550bp的XynllB片段。使用T4DNA連接酶對以上兩步獲得的片段進行連接得到新載體pUC19-TVG-XynllB并轉化大腸桿菌JM109。經酶切鑒定正確后送上海生工測序。
2)使用限制性內切酶EcoR I和Sac I對質粒pUC19-TVG_xynllB和 pUCm-T-xynllD (專利申請號:201010581407. X)進行雙酶切，酶切時間為4h，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收大小約為3. Okb的大片段和400bp的XynllD片段。使用T4DNA連接酶對以上兩步獲得的片段進行連接得到含有融合基因的新載體pUC19-TVG-xynllBD并轉化大腸桿菌JM109。經酶切鑒定正確后送上海生工測序。
權利要求
1.一種能夠有效解決基于酶切位點基因融合問題的新載體PUC19-TVG，其特征在于多克隆位點處序列為(SEQ ID NO :1)，其結構如圖1所示。
2.—種構建載體pUC19-TVG的方法，其特征在于具體構建步驟包括 1)引物設計及基因擴增 a.根據pUC19中多克隆位點區域序列設計反向引物TvectorG,TvectorG 5/ -AAGCTTGCGGCCGCACGCGTTATTCGCAGCATCCTCCG-3' (SEQ ID NO 2)； 其中TvectorG的5'端包含酶切位點HindII1、Not1、Mlu I (下劃線所示)，為構建質粒及基因拼接提供連接端； b.在TvectorG 和 pPICZ α 通用引物 5 ' AOX (5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ')的作用下，以PPICZ α質粒為模板擴增出TVG片段并連至pUCm-T載體上，新載體命名為pUCm-T-TVG ； 2)pUC19-TVG質粒的構建 a.對pUC19及pUCm-T-TVG載體使用HindIII和EcoR I進行雙酶切，并回收pUC19大片段及基因TVG ； b.使用T4DNA連接酶對以上兩步獲得的片段進行連接，得到新載體pUC19-TVG。
3.一種基于PUC19-TVG質粒的基因融合方法，其特征在于具體構建步驟包括 1)目的基因含酶切位點的引物設計 為實現目的基因A和B的融合，首先根據兩基因的末端序列設計含有包括酶切位點EcoRI, Mlu1、Not I, Xho1、Hind III在內的兩對引物，限制性酶切位點可根據后續步驟所連載體進行選擇其中每個基因所使用的酶切位點前后不同、兩基因所使用的酶切位點前后對應；使用該引物分別以目的基因A和B為模板進行PCR ；PCR產物回收后連接至pUCm-T載體上并獲得質粒pUCm-T-Α和pUCm-T-B ； 2)目的基因A與pUC19-TVG載體的連接 使用所選擇的兩種限制性內切酶對質粒PUC19-TVG和pUCm-T-Α進行雙酶切，酶切回收PUC19-TVG大片段及A基因并使用DNA連接酶進行連接，獲得質粒pUC19_TVG_A ； 3)目的基因A與B的融合 使用所選擇的兩種限制性內切酶中的任意一種和兩目的基因中均含有的單酶切位點對質粒PUC19-TVG-A和pUCm-T-B進行雙酶切，回收pUC19_TVG_A質粒大片段和B基因片段并使用DNA連接酶進行連接，獲得包含融合基因的質粒pUC19-TVG-AB。
全文摘要
pUC19-TVG質粒的構建及使用方法。本發明的技術方案提供了一種新型的載體pUC19-TVG，其特征在于，所述載體是基于限制性內切酶酶切及連接原理由載體pUC19改造而來，載體中含有包括EcoRI、MluI、NotI、XhoI、HindIII在內的多克隆位點，不含Xho I、Mlu I、Sac I、Kpn I、Cla I、EcoRV、NcoI、Pst I、BglII、Sal I、Pst I、BamH I、Sca I、Xba I酶切位點，因此該載體能夠實現多基因片段依賴酶切位點的融合及單一基因的分段和拼接，同時該載體還可以用于解決長片段基因克隆過程中極易出現的錯配問題。
文檔編號C12N15/64GK102994538SQ201210562490
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者鄔敏辰, 朱天地, 汪俊卿, 李劍芳 申請人:江南大學