一種新型柴油污染型場地微生物降解菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型柴油污染型場地微生物降解菌，其是保藏號為CGMCCNO.7896的醋酸鈣不動桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明醋酸鈣不動桿菌對柴油污染土壤有良好的修復效果。
【專利說明】一種新型柴油污染型場地微生物降解菌【技術領域】
[0001]本發明屬于土壤污染防治領域，涉及一種新型柴油污染型場地微生物降解菌。
【背景技術】
[0002]自然界中能降解柴油的微生物廣泛存在于土壤、水和大氣等環境中，能夠降解烴類的微生物非常多，大約有100余屬，200多個種，分別屬于細菌、放線菌、霉菌、酵母、藻類等(張輝等，2007)。細菌和真菌是烴類生物降解的主導作用者，細菌主要包括:短桿菌屬(PrevibeictGrimi)、弧菌屬(yibrio)、不動細菌屬(Acinetobacter')、螺菌屬iSpirilluni)、節細菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬{Bacillus、、脫硫弧菌屬{Pesulfovibrio)、無色桿菌屬(Achromobacter)、棒桿菌屬{Coryhebacterium')、假單胞菌屬(Pseudomonas')、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、氣單胞菌屬(Aoromoims')、假桿菌屬 iPseuclobacteriuni)、微球菌屬(Micrococcus)、小單胞菌屬(Micromonospora)、分枝桿菌屬iMycobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterimi)等。真菌主要包括:曲霉屬(Aspergillus')、內孢霉屬iEndomyces、、隱球酵母屬(Mryptococcusl擲孢酵母屬{Sporobolomyces)、紅酵母屬(0iodo torula)、絲抱酵母屬{Trichosporon)、畢赤酵母屬iPicAia )、假絲酵母屬{Candit/a)、漢遜酵母屬{Hansenula )、新月酵母屬{SeIeno tiIa)、球擬酵母屬(Jorulopsis)、著霉罵iPeniciIIiim)等(梁生康，2005)。放線菌中有諾卡氏菌屬(/Vocart/ia)、放線菌屬(Actinomycetes');藻類對烴類污染物的降解也起到了一定的作用，如隱球藻屬(Aphanocapsa)、魚腥藻屬(Analaena)、雙眉藻屬(Amphora)、杜氏藻屬(JJunaliella)、翅線藻屬 iPetalonema)、衣藻屬 ijOhIamyc1morms)、念珠藻 i^Nostoc)、銷藻屬(#icroco7<9W5.)、石藥藻屬(Wiwa)、紫球藻屬(Porphyridium)、,\、豫薇雇i {Chlorella)、顫藻屬(ftsci77aioria)、細柱藻屬{Culindrotheea)等中的一些菌株。
[0003]不同的柴油降解菌對不同烴的降解能力不同，多數降解菌一般只能降解一種或幾種烴類(胡凌燕，2006)。環境中烴類污染物的降解大部分是微生物協同作用的結果，如藻類和細菌間以及植物和細菌之間的協同作用，但應用最多的是在微生物菌群之間的協同作用(賈彩云，2008)。王世杰等(2011)以柴油為唯一碳源，從勝利油田石油污染土壤中篩選出一株柴油降解微生物，通過鑒定將其確定該微生物為不動桿菌屬，在柴油含量為I %的培養基中，柴油去除率為58.6%;張輝等(2007)以市售0#柴油為唯一碳源篩選得到2株為分別為芽孢桿菌屬和黃桿菌屬的高效降解柴油菌種，在接種量為10%的條件下，經過48h培養后除油率分別為79.25%和77.23% ;Richard等(1999)將以柴油為碳源富集得到由7株菌組成的的混合菌系在初始柴油濃度為1%的液體培養基中培養50天，柴油降解率達90% ；Mukherji等(2004)將從阿拉伯海油田附近底泥分離得到的混合菌系在好氧條件下培養8天后柴油去除率達39%，在厭氧條件下培養50天柴油降解率達到18% ；白潔等(2007)從勝利油田石油污染土壤中富集分離出以柴油為碳源和能源的混合菌，在含油量為0.5%的無機鹽液體培養基中培養7d后柴油的去除率達到90.4% ;武金裝等(2008)從石油污染土壤中以0#柴油為惟一碳源篩選出9株菌，發現一株菌在柴油初始濃度為500 mg/L的培養液中，振蕩培養3d降解率達到了 71.7%，經鑒定將其確定為假單胞菌屬。
【發明內容】
[0004]本發明提供一種對柴油污染土壤有良好的修復效果的醋酸鈣不動桿菌，該菌是以柴油為唯一碳源和能源的柴油降解菌，對污染土壤有良好的修復效果。
[0005]本發明所提供的技術方案是:一種新型柴油污染型場地微生物降解菌，其是保藏號為CGMCC N0.7896的醋酸鈣不動桿菌difleioAacier保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0006]該醋酸鈣不動桿菌(JcifleioAacier已于2013年Z月8日為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏號為CGMCC N0.7896，經檢測存活。
[0007]本發明還提供所述新型柴油污染型場地微生物降解菌在對柴油污染土壤修復中的應用。
[0008]所述的應用，在柴油污染土壤中接種所述的醋酸鈣不動桿菌，同時還加入表面活性劑，30%H202，有機溶劑。
[0009]所述的應用，優選地，所述表面活性劑為十二烷基苯磺酸鈉，有機溶劑為甲醇，油污土壤中柴油量為2-6g/kg時，所述的醋酸鈣不動桿菌的接種量為1-4% (重量)，更優選地，油污土壤中柴油量為4g/kg時，所述的醋酸鈣不動桿菌的接種量為2%。
[0010]本發明具有以下有益效果:
(I)從人工柴油污染土壤中富集分離篩選出一株以柴油為惟一碳源和能源的柴油降解菌，通過進行生理生化反應實驗和16SrDNA測序將其歸于不動桿菌屬；其16SrDNA序列與醋酸鈣不動桿菌的同源性達99.8%。
[0011](2)本發明柴油柴油降解菌對污染土壤有良好的修復效果，從單因素實驗結果可知，菌種降解柴油的最佳條件為:柴油添加量4g/kg,十二烷基苯磺酸鈉6 mg/ g, H2O2累計加入量16 mL,甲醇2 mLo
[0012](3)在最佳條件下，添加菌種、未加菌對照和疊氮化鈉滅菌土壤中的柴油降解率分別為69.82%,22.12%和13.65%，半衰期分別為37、165、347d，可見本發明醋酸鈣不動桿菌對柴油污染土壤有良好的修復效果。
【具體實施方式】
[0013]I實驗材料
1.1菌種來源
本實驗將取自廣州市南沙區的實地土壤自然風干、除雜、磨碎，過2_篩，用市售0#柴油污染后裝入土柱(高lm，內徑0.25m),并從中取樣對微生物菌種進行富集、分離、篩選和鑒定。
[0014]1.2實驗試劑與儀器
(O實驗試劑:色譜純:二氯甲烷；分析純:氯化鈉、無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀、氯化銨、硫酸鐵、氯化鈣、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、硫酸鎂、甲醇、30%雙氧水、十二烷基苯磺酸、乙醇；此外還包括牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、結晶紫、草酸銨、碘、碘化鉀、番紅、溴甲酚紫、明膠。
[0015](2)實驗儀器:超聲波清洗器(KQ3200DE)、紫外-可見分光光度計(UV759)、無菌操作臺、高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-18 SI )、生化培養箱(MGC-3 50HPY-2 )、水浴恒溫振蕩器(SHA-B )、離心機(AK/QC-058 )、精密電子天平、冰箱(TCLBC-92B )、光電顯微鏡、梯度PCR 儀(S1000-96)B4394-4324-l、凝膠成像系統(Gel DOC XR+) A3107-3190、電泳系統(Min1-Protean Tetra) B4393-4323、牛皮紙、培養皿、酒精燈、接種環、棉塞等。
[0016]1.3培養基的配置
(1)無機鹽培養基(富集篩選培養基)=K2HPO40.8g, MgS04*7H20 0.25g, CaCl2 0.03g,KH2PO4 0.2g, FeSO4*7H200.09g, pH=7.2 ~7.4，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20 min ；
(2)牛肉膏蛋白胨培養基(菌種純化培養基):牛肉膏5g，蛋白胨10 g，NaCl 5g，瓊脂18 g，蒸餾水 1000 mL，pH=7.2 ~7.4，121°C 滅菌 20 min ；
(3)斜面保存培養基:與牛肉膏蛋白胨培養基一致，制作時倒入試管中，傾斜放置，待冷卻后即為斜面保存培養基。
[0017](4)休和利夫森二氏(半固體)培養基:蛋白胨5g，NaCl 5g, K2HPO4 0.2g，糖醇(葡萄糖或其它糖、醇)10g，瓊脂5飛g，I %溴甲酚紫(溴百里香草酚藍)3mL,蒸餾水1000mL,ρΗ7.0-7.2，分裝試管，培養基高度約4.5cm, 115°C滅菌20min。
[0018](5)明膠蛋白胨培養基:牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，明膠120g，蒸餾水1000mL, pH 7.2~7.4，115°C滅菌 20min。
[0019](6)西蒙斯氏檸檬酸鹽培養基:氯化鈉5g，硫酸鎂0.2g，磷酸二氫銨lg，磷酸氫二鉀lg，檸檬酸鈉5g,瓊脂20g,蒸懼水1000mL, 0.2%溴磨香草酹藍溶液40mL, pH6.8。
[0020](7)碳源利用培養基:磷酸氫二銨0.5g，磷酸二氫鉀1.3g，磷酸氫二鈉3.2g，硫酸鈉0.8g，硝酸鈉lg，待測物質2-10g，蒸餾水1000mL。將各成分溶于水中，校正pH 7.2，分裝,116 °C 滅菌 15min。
[0021]2實驗方法
2.1柴油降解菌的富集、分離和純化
在土柱的7個取樣點分別取土樣5g，裝入含有100 mL無機鹽培養基的250 mL錐形瓶中，以濃度為10 mg/mL的柴油為唯一碳源,并以不加土壤的培養液為空白，在130 rpm的轉速，30°C溫度下振蕩培養5 d。然后吸取5mL上述培養液接種于新鮮培養基，在相同條件下培養5 d，如此連續富集培養5次。用接種環沾取培養液在牛肉膏蛋白胨培養基平板上劃線，觀察平板上的菌落挑取形態、顏色一致的菌落進行平板劃線分離重復進行多次，直至得到單一的菌株，將純化菌株于試管斜面培養后保存于4°C冰箱。
[0022]2.2柴油降解菌的鑒定
將該菌株接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，放在30°C生化培養箱中培養48h后觀察菌落形態特征并進行一系列的生理生化實驗，并通過分析16SrDNA序列進行分子生物學鑒定，參考《伯杰細菌鑒定手冊》、《常見細菌系統鑒定手冊》、《分子克隆實驗指南》(第三版)及相關文獻，最終將菌株鑒定到屬。
[0023](I)革蘭氏染色
在無菌操作條件下挑取幼齡培養的菌落于干凈載玻片涂布均勻，自然風干后在火焰上固定，然后進行革蘭氏染色實驗:①初染:用草酸銨結晶紫染色lmin，水洗去掉浮色；
②媒染:用碘-碘化鉀溶液染色lmin，傾去多余溶液；
③脫色:用中性脫色劑如乙醇或丙酮脫色，革蘭氏陰性菌被褪色而成無色，革蘭氏陽性菌不被褪色而成紫色；
④復染:用番紅染液復染Imin。
[0024]染色完成后在光學顯微鏡下，用油鏡觀察菌體顏色及形態，革蘭氏陽性菌仍成紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。
[0025]( 2 )葡萄糖氧化發酵實驗
將幼齡菌株穿刺接種到休和利夫森二氏(半固體)培養基中，另外不接種者為空白對照，25°C恒溫培養72h后觀察，如果產酸指示劑變黃為陽性，如產氣而指示劑不變或變藍(紫)則為陰性。
[0026](3)接觸酶實驗
將斜面菌種經過24h培養后，用接種環挑取一環涂布于已滴有3%過氧化氫的載玻片上，如若有氣泡產生則為陽性，無氣泡即為陰性。
[0027](4)氧化酶實驗
在干凈的培養皿里放一張濾紙，滴上二甲基對苯撐二胺的1%溶液，僅使濾紙濕潤即可，不可過濕。用滅菌棒取培養18~24h的菌苔涂抹在濕潤的濾紙上，在10秒內呈現紅色者為陽性，10^60秒出現紅色者為延遲反應，60秒以上出現紅色者不計，則視為陰性。
[0028](5)明膠液化實驗
將培養24h的菌株穿刺接種在明膠蛋白胨培養基中，以未接種的為空白，在20°C條件下培養2~7d，觀察其生長情況和明膠是否被液化。
[0029](6)溶血性實驗
將幼齡菌種接種至血平板上在30°C條件下培養24h后觀察，如菌落周圍出現溶血環則為陽性，反之則為陰性。
[0030]( 7 )檸檬酸利用實驗
在西蒙斯氏檸檬酸鹽培養基斜面上劃線接種，30°C培養3~7d，培養基由黃色變為藍色，此為陽性；顏色不變者為陰性。
[0031](8)碳源利用實驗:將幼齡培養物接種到碳源利用基礎培養基中，連續三代移種，生長著為陽性。
[0032](9)柴油降解菌的分子生物學鑒定
本發明采用16S rDNA序列分析法，從分子水平上對其進行鑒定，具體操作步驟如下:①菌種DNA的提取:將純培養物接種于5mL新鮮配制的牛肉膏蛋白胨培養基上，培養1~2天；將培養物全部轉至IOmL離心管中，6000rpm室溫離心5min,棄去上清液,將離心管倒置于干凈的吸水紙上曬干殘余液體，加入2.7mLDNA抽提Buffer，充分混勻懸浮菌體后加入20 μ L 10mg/ml的蛋白酶K,混勻后置于恒溫水浴振蕩器中37°C下振蕩30min (225rpm)；然后加入0.3mL20%SDS,混勻后放入65°C恒溫水浴鍋中溫浴2h，每隔15~20min上下顛倒幾次直至裂解完全后室溫下離心IOmin ;將上清液轉至新的離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)抽提lOmin，然后室溫下離心lOmin，重復操作此過程兩到三次；將上清液轉至干凈的離心管后加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后在室溫下靜置lh，室溫離心20min( 14000rpm),收集粗DNA ;將粗DNA用70%冰乙醇輕輕刷洗，將刷洗液放在干凈工作臺上晾干后加入10(T200yL無菌超純水(或TE)溶解DNA后轉至滅菌的1.5mL離心管中，-20°C保存備用。
[0033]②DNA純度和濃度檢測:取I μ LDNA樣品，加水至100 μ L混勻后采用核酸/蛋白質分析儀于Nucleic Acid程序下測定。
[0034]③PCR擴增:本研究采用梯度PCR儀對菌種進行16srDNA擴增，所采用的反應體系如表2-2所示，并設含有除模板核酸外的所有成分的空白對照，PCR反應體系為:
【權利要求】
1.一種新型柴油污染型場地微生物降解菌，其是保藏號為CGMCC N0.7896的醋酸鈣不動桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.—種權利要求1所述的新型柴油污染型場地微生物降解菌在對柴油污染土壤修復中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:在柴油污染土壤中接種所述的醋酸鈣不動桿菌，同時還加入表面活性劑，30%H202和有機溶劑。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述的有機溶劑是甲醇。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述表面活性劑為十二烷基苯磺酸鈉。
6.根據權利要求1-5任一項所述的應用，其特征在于:油污土壤中柴油量為2-6g/kg時，所述的醋酸鈣不動桿菌的接種量為1_4%。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于:油污土壤中柴油量為4g/kg時，所述的醋酸鈣不動桿菌的接種 量為 2%。
【文檔編號】C12N1/20GK103695332SQ201310490169
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】陳志良, 劉沙沙, 彭曉春, 董家華 申請人:環境保護部華南環境科學研究所