提取乳酸菌基因組dna的試劑盒及相應的提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒及相應的提取方法，試劑盒包括Buffer-1～Buffer-6，以及其它試劑，組成簡單，成本低；其提取方法操作簡單、方便，成本低，適用于乳酸菌多樣性分析時，大量常規樣品的乳酸菌基因組DNA的提取。本發明適用于乳酸菌基因組DNA的提取。
【專利說明】提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒及相應的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，涉及一種DNA的提取試劑盒及相應的提取方法，具體涉及一種提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒及相應的提取方法。
【背景技術】[0002]乳酸菌是一群形態代謝性能和生理學特征不完全相同且能發酵碳水化合物產生乳酸的革蘭氏陽性細菌。目前在自然界中已發現的乳酸菌在細菌分類學上可以劃分為43個屬，包括373個種及亞種，其中絕大多數是厭氧菌或兼性厭氧菌。人類對乳酸菌的分類鑒定和利用已經有久遠的歷史，并積累了豐富的經驗和知識，形成了至今一直沿用的傳統分類鑒定方法，包括形態特征、生理生化反應及血清學反應等，這些方法都是基于微生物表面受體的特異性，屬于表型分類法。
[0003]隨著科技的進步，分子生物學方法以其較高的準確性及穩定性等優點逐步替代傳統的形態學和生理學檢測方法，并已成功介入到益生菌的鑒定領域。由于乳酸菌的細胞壁厚，肽聚糖含量較高，交聯程度大，細胞裂解困難等問題，因此提供一種高效的提取乳酸菌基因組DNA的方法及其試劑盒具有非常重要的意義。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題，是提供一種提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒及相應的提取方法，試劑盒包括Buffer-1~Buffer-6，以及其它試劑，組成簡單，成本低；其相應的提取方法操作簡單、方便，成本低，適用于乳酸菌多樣性分析時，大量常規樣品的乳酸菌基因組DNA提取。
[0005]為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是:
一種提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒，它包括以下試劑:
Buffer-1為質量百分比為10%的十二烷基硫酸鈉溶液；
Buffer-2為150~200mg/mL的溶菌酶,用無菌水配制；
Buffer-3 為 15 ~20mg/mL 的蛋白酶 K，用 20mM Tris-HCL 配制，其 pH 值為 7.5 ；Buffer-4 為 10mol/L CTAB,由 4.1g NaCl 溶于 80mL 水中，再緩慢加入 IOg CTAB 配制而成；
Buffer-5 為 5M NaCl 溶液；
Buffer-6 為 IOmM Tris-HCl,I mM EDTA，0.lmg/mL RNaseA ；
其它試劑:體積比為25:24:1的苯酚:氯仿:異戊醇混合的抽提液；
異丙醇；
體積百分比為70%的乙醇。
[0006]本發明還提供了相應的提取乳酸菌基因組DNA的方法，它按照以下步驟順序進行:
(O取對數生長期的乳酸菌菌液3mL,于12000rpm離心Imin收集菌體，菌體用Buffer-6洗滌兩次，后用500 μ L Buffer-6重懸菌體，得菌體懸濁液I ;
(2)將菌體懸濁液I中加入50μL Buffer-1和20 μ L Buffer-2溶液，37°C，溫箱溫育lh，裂解細胞壁，得菌體懸濁液2 ；
(3)將菌體懸濁液2中加入10μ L Buffer-3,混勻后于55°C溫箱過夜消化，使蛋白變質或降解，得菌體懸濁液3;
(4)將菌體懸濁液3中加入IOOyLBuffer_4和IOOyL Buffer-5溶液，混勻，65°C水浴加熱15min,沉淀蛋白，得菌體懸池液4 ；
(5 )用等體積的抽提液將菌體懸濁液4抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心IOmin,取上清液，得上清液5，再使用等體積的抽提液將上清液5抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心IOmin,取上清液,得上清液6 ；
(6)將上清液6用0.8倍體積的異丙醇沉淀基因組DNA，得沉淀7 ；
(7)沉淀7用70%乙醇洗滌沉淀2次，抽干后用30μ L Buffer-6溶解沉淀，最終得乳酸菌基因組DNA溶液。
[0007]由于采用了上述的技術方案，本發明與現有技術相比，所取得的技術進步在于: 針對乳酸菌細胞壁厚、肽聚糖含量高、交聯程度大以及細胞裂解困難的問題，本發明
提供了一種高效穩定提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法，操作簡單、方便，成本低，適用于乳酸菌多樣性分析時，大量常規樣品的乳酸菌基因組DNA提取，提取濃度高，所提取的DNA濃度90~373ng/ μ L，DNA純度較好，其0D26(l/0D28(l值在標準范圍1.70-1.90之間。
[0008]本發明適用于提取乳酸 菌基因組DNA。
[0009]本發明下面將結合說明書附圖與具體實施例作進一步詳細說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為本發明實施例7的DNA電泳圖；其中，泳道I為本發明實例I提取的乳酸菌DNA ;泳道2為本發明實施例6提取的乳酸菌DNA ;泳道3為23130bp DNA Maker。
[0011]圖2為本發明實施例8的16s rDNA PCR擴增圖；其中，泳道I為2000bp DNAMaker ;泳道2為實例I提取的乳酸菌DNA ;泳道3為實施例6提取的乳酸菌DNA。
[0012]圖3為本發明實例9的DNA電泳圖；其中，泳道I為23130bp DNA Maker ;泳道2-5為提取君樂寶乳業公司保存的乳酸菌菌種的DNA，編號分別為乳酸乳球菌103、干酪乳桿菌Wl 18、植物乳桿菌3301、糞腸球菌1-1。
[0013]
【具體實施方式】
[0014]實施例1 一種提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒及相應的提取方法 一種提取乳酸菌基因組DNA的方法，它按照以下步驟順序進行:
(O取對數生長期的乳酸菌體液3mL，于12000rpm離心Imin收集菌體，菌體用Buffer-6洗滌兩次，后用500 μ L Buffer-6重懸菌體，得菌體懸濁液I ;
(2)將菌體懸濁液I中加入50μ L Buffer-1和20 μ L Buffer-2溶液，37°C，溫箱溫育lh，裂解細胞壁，得菌體懸濁液2 ；(3)將菌體懸濁液2中加入10μ L Buffer-3,混勻后于55°C溫箱過夜消化，使蛋白變質或降解，得菌體懸濁液3;
(4)將菌體懸濁液3中加入IOOyLBuffer_4和IOOyL Buffer-5溶液，混勻，65°C水浴加熱15min,沉淀蛋白，得菌體懸池液4 ；
(5 )用等體積的抽提液將菌體懸濁液4抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心IOmin,取上清液，得上清液5，再使用等體積的抽提液將上清液5抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心IOmin,取上清液,得上清液6 ；
(6)將上清液6用0.8倍體積的異丙醇沉淀基因組DNA，得沉淀7 ；
(7)沉淀7用70%乙醇洗滌沉淀2次，抽干后用30μ L Buffer-6溶解沉淀，最終得乳酸菌基因組DNA溶液，DNA濃度為295ng/ μ L，OD260/OD280值為1.83。
[0015]其中，提取乳酸菌基因組DNA使用的試劑盒包括以下試劑:
Buffer-1為質量百分比為10%的十二烷基硫酸鈉溶液；
Buffer-2為200mg/mL的溶菌酶,用無菌水配制；
Buffer-3 為 20mg/mL 的蛋白酶 K，用 20mM Tris-HCL 配制，其 pH 值為 7.5 ；Buffer-4 為 10mol/L CTAB,由 4.1g NaCl 溶于 80mL 水中，再緩慢加入 IOg CTAB 配制而成；
Buffer-5 為 5M NaCl 溶液；
Buffer-6 為 IOmM Tri s-HCl,I mM EDTA，0.lmg/mL RNaseA ；
其它試劑:體積比為25:24:1的苯酚:氯仿:異戊醇混合的抽提液；
異丙醇；
體積百分比為70%的乙醇。
[0016]實施例2-5 提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒
實施例2-5分別為一種提取乳酸菌基因組DNA使用的試劑盒，本實施例將它們用于按照實施例1的提取方法提取乳酸菌基因組DNA。這些試劑盒與實施例1所涉及的試劑盒的不同之處僅在于Buffer-2和Buffer-3的濃度不同，具體如下表所示:
【權利要求】
1.一種提取乳酸菌基因組DNA的試劑盒，其特征在于它包括以下試劑: Buffer-1為質量百分比為10%的十二烷基硫酸鈉溶液； Buffer-2為150~200mg/mL的溶菌酶,用無菌水配制；
Buffer-3 為 15 ~20mg/mL 的蛋白酶 K，用 20mM Tris-HCL 配制，其 pH 值為 7.5 ；Buffer-4 為 10mol/L CTAB,由 4.1g NaCl 溶于 80mL 水中，再緩慢加入 IOg CTAB 配制而成；
Buffer-5 為 5M NaCl 溶液；
Buffer-6 為 IOmM Tris-HCl,I mM EDTA，0.lmg/mL RNaseA ； 其它試劑:體積比為25:24:1的苯酚:氯仿:異戊醇混合的抽提液； 異丙醇； 體積百分比為70%的乙醇。
2.一種提取乳酸菌基因組DNA的方法，其特征在于它按照以下步驟順序進行: (O取對數生長期的乳酸菌菌液3mL,于12000rpm離心Imin收集菌體，菌體用Buffer-6洗滌兩次，后用500 μ L Buffer-6重懸菌體，得菌體懸濁液I ;
(2)將菌體懸濁液I中加入50μL Buffer-1和20 μ L Buffer-2溶液，37°C，溫箱溫育lh，裂解細胞壁，得菌體懸濁液2 ； (3)將菌體懸濁液2中加入10μ L Buffer-3,混勻后于55°C溫箱過夜消化，使蛋白變質或降解，得菌體懸濁液3; (4)將菌體懸濁液3中加入100μ L Buffer-4和100 μ L Buffer-5溶液，混勻，65°C水浴加熱15min,沉淀蛋白，得菌體懸池液4 ； (5 )用等體積的抽提液將菌體懸濁液4抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心IOmin,取上清液，得上清液5，再使用等體積的抽提液將上清液5抽提基因組DNA，除去蛋白，12000rpm離心IOmin,取上清液,得上清液6 ； (6)將上清液6用0.8倍體積的異丙醇沉淀基因組DNA，得沉淀7 ； (7)沉淀7用70%乙醇洗滌沉淀2次，抽干后用30μ L Buffer-6溶解沉淀，最終得乳酸菌基因組DNA溶液。
【文檔編號】C12N15/10GK103509788SQ201310502121
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】王世杰, 薛玉玲, 朱宏 申請人:石家莊君樂寶乳業有限公司