多氧霉素Polyoxin B組分高產菌株及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種多氧霉素B分高產菌株及其構建方法，該多氧霉素B組分高產菌株是其polF基因發生同框突變，喪失功能。該高產菌株CXR3的制備方法是將S.aureochromogenes工業菌多氧霉素生物合成基因簇中polF基因通過同框缺失的方法進行定向突變，得到了定向積累多氧霉素B組分的高產菌株CXR3，提高了多氧霉素中B組分的產量，提高了多氧霉素的相對生物效價。
【專利說明】多氧霉素Po Iyoxin B組分高產菌株及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多氧霉素B組分高產菌株及其構建方法，屬于生物制藥領域。
【背景技術】
[0002]多氧霉素(Polyoxin，POL)是重要的肽基核苷類抗生素，由于其對農作物、果蔬及一些經濟植物真菌病害有良好防治作用，加之對環境友好，故自創制成功便在農業上大規模推廣使用，迄今為止，多氧霉素仍是世界上投產與使用最廣泛且未產生耐藥性的農用抗生素之一。
[0003]多氧霉素屬于多組分抗生素,在所有的組分中,polyoxin A與polyoxin H為主要組分，polyoxin B,polyoxin D,polyoxin K以及polyoxin L是少量組分,但是生物活性最高的組分卻是后四者。因此提高polyoxin B、polyoxin D、polyoxin K或polyoxin L的含量，是提高多氧霉素抗菌能力的重要手段。
[0004]在傳統育種實踐中，通過誘變篩選的方式來提高多氧霉素的效價，但是這種方式，不確定因素多，篩選工作大，育種緩慢，并且往往是整體對多氧霉素產生影響，生物活性較弱的組分效價也相應提高，難以有效提高特定活性組分的含量。
【發明內容】
[0005]本發明的第一個目的 在于針對上述不足提供一種能夠定向積累多氧霉素Polyoxin B組分的高產菌株；
本發明的第二個目的在于提供構建上述高產菌株的方法；
本發明的第三個目的在于提供用于構建上述高產菌株的專用載體。
[0006]本發明前期研究已成功克隆S.aureochromogenes工業菌株中多氧霉素生物合成基因簇。Polyoxin A與B組分的區別在于前者含有POIA基團，而本發明發現的基因簇中/707/^參與POIA基團的生物合成，本發明選擇/707/^基因進行定向突變，結果獲得了PolyoxinB組分的高產菌株，命名為CXR3。
[0007]據此，本發明提供一種定向積累多氧霉素Polyoxin B組分的基因工程菌，該菌的/707/7基因發生突變,喪失功能。由于/707/7處于polC-polQ2轉錄單元中，同框缺失可避免潛在的極性效應，因此優選所述突變為同框缺失突變。所述基因工程菌的出發菌可以使產多氧霉素的任何菌株，包括但不限于金色產色鏈霉素(5: aureochromogenes)?
[0008]本發明還提供上述多氧霉素Polyoxin B組基因工程菌的構建方法，該方法通過構建/707/^基因敲除載體，將該載體導入到目標菌株后篩選陽性菌株。所述基因敲除載體帶有報告基因。優選所述基因敲除不改變基因的閱讀框。
[0009]具體地，該基因工程菌的構建方法包括如下步驟:
I)以POlFlaF和polFlar (其序列如SEQ ID N0.1&2所示)為引物，擴增2.5_kb的片斷，經BglII切后，克隆到pOJ446的BglII和HpaI位點之間，構建成pJTU4721 ;再以引物poIFraF和poIFraR(其序列如SEQ ID N0.3&4所示)擴增的2.5_kb的片斷克隆到pJTU4721的XbaI和BglII位點之間，構建成polF的同框缺失載體pJTU4722 ；
2)將來自pJTU2180+的tsr基因插入載體pJTU4722的BglII位點，構建成的中斷載體pJTU4723 ；
3)將質粒pJTU4723通過導入多氧霉素工業菌株中，篩選得到tsr插入polF的插入突變株； 4)將的tsr插入突變株中tsr置換出來，并篩選陽性菌株。
[0010]實驗表明，本發明基因工程菌用于多氧霉素的生產能夠有效提高多氧霉素中的Polyoxin B組分,從而提高多氧霉素的活性。
[0011]本發明還提供一種制備多氧霉素的方法，該方法是通過培養上述述的基因工程菌，并從發酵液中分離得到多氧霉素。
[0012]本發明還提供一種用于制備上述基因工程菌的載體，該載體包括基因上下游各2.5kb的基因片段和來自PJTU2180+的tsr基因。本發明通過基因工程手段，對產多氧霉素的工程菌進行改造，將其基因進行突變，得到了定向積累多氧霉素Polyoxin B組分的高產菌株CXR3，提高了多氧霉素組分中Polyoxin B的產量，提高了多氧霉素的相對生物效價。
[0013]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1CXR3突變株的構建方法示意圖及PCR鑒定，其中圖A是CXR3突變株的構建示意圖；圖B是CXR3突變株的PCR鑒定，泳道M是I kb plus ladder，泳道I是CXR3突變株，泳道2是51 aureochromogenes野生型；
圖2CXR3突變株代謝產物的生物活性測定，I是5: aureochromogenes野生型，2-4是CXR3突變株；
圖3CXR3突變株代謝產物的HPLC檢測結果，ST:多氧霉素標準品，WT: S.aureochromogenes野生型的代謝產物；
圖4CXR3突變株代謝產物的質譜鑒定圖，CXR3突變株代謝產物的質譜鑒定ST/POL-B: polyoxin B 標準品的一級質譜(MS)和二級質譜(MS/MS)，CXR3/P0L-B:突變株CXR3的代謝產物的一級質譜(MS)和二級質譜(MS/MS)。
【具體實施方式】
[0015]本發明構建了 Polyoxin B的高產菌株CXR3，還提供了高產菌株CXR3代謝產物的鑒定方法。分別介紹如下。
[0016]l、Polyoxin B組分的高產菌株CXR3的構建
為了實現Polyoxin B的高產，將負責多氧霉素的POIA基團生物合成基因中的進行定向突變。
[0017]首先以polFlaF和polFlaR為引物，擴增2.5_kb的片斷，經BglII切后，克隆到P0J446的BglII和HpaI位點之間，構建成pJTU4721 ;再以引物polFraF和polFraR擴增的
2.5-kb的片斷克隆到PJTU4721的XbaI和BglII位點之間，構建成的同框缺失載體PJTU4722 ;然后將來自PJTU2180+的tsr基因插入pJTU4722的BglII位點，構建成的中斷載體PJTU4723。再將質粒pJTU4723通過接合轉移入多氧霉素エ業菌株中，構建出/
的tsr插入突變株。最后將/70が' 的tsr插入突變株中tsr置換出來，PCR篩選驗證影印實驗顯示獲得ー個候選突變株，為PolF的同框缺失菌株CXR3。如圖1。
[0018]2、CXR3的發酵產物檢測鑒定
接種三株CXR3進行發酵，取發酵液進行生物測定，以野生型作為對照，結果如圖2顯示，I指的是aureochromogenes野生型,2-4指的是CXR3, CXR3的發酵液喪失對指示酵母的生物活性，暗示CXR3產生的多氧霉素組分可能發生變化。
[0019]CXR3發酵液經預處理，進行HPLC分析的結果顯示，徹底喪失了 polyoxin A(34.0min)與polyoxin H (41.0 min)的特征峰，主要化合物與標準品中polyoxin B (16.3 min)的保留時間一致，如圖3 ;該化合物進ー步的LC/MS分析結果顯示，該吸收峰產生特征性的[M+H]+離子流?/z 508.3，其產生的二級斷裂碎片為490.1，429.1及305.1，與polyoxin B標準品完全吻合，從而說明CXR3產生的主要組分為Polyoxin B。如圖4。
[0020]實施例1
多氧霉素Polyoxin B組分的高產菌株CXR3的構建
首先以 polFlaF(5’-GCTCTAGATGCTGCGACTTGTGCTTGGA-3’ )和 polFlaR(5，-GAAGATCTCAGGTCAGCGACGAGGACA-3’ )為引物，以 5: aureochromogenes 野生型(購自中國普通微生物菌種保藏中心)DNA為模板，95 °C解鏈lmin，59°C復性30s，72°C度延伸2.5min,擴增30個循環，得2.5-kb的片斷，經BglII切后，克隆到pOJ446 (Bierman M etal.Gene, 1992，116(1):43 -49.)的 BglII 和 HpaI 位點之間，構建成 pJTU4721 ;再以 polFraF (5，-GAAGATCTGACGCCCAGACCGGAGAG-3’ )和 polFraR(5，-TTCCGCACCTGGCTGTCC-3’ )為引物，以 51 aureochromogenes 野生型 DNA 為模板，95°C解鏈 Imin, 59°C復性 30s,72°C度延伸2.5min,擴增30個循環，得2.5-kb的片斷，經XbaI和BglII切后，克隆至Ij pJTU4721的XbaI和BglII位點之間，構建成/70が' 的同框缺失載體PJTU4722 ;然后將含有tsr基因的pJTU2180+用BamHI酶切回收tsr基因，插入到pJTU4722的BglII位點，構建成/70が的中斷載體PJTU4723。再將質粒pJTU4723通過接合轉移入S.aureochromogenesエ業菌株中，構建出/^が的tsr插入突變株。最后將pJTU4722接合轉移入/70が的tsr插入突變株中將tsr置換出來，PCR篩選驗證影印實驗顯示獲得三個候選突變株，為polF的同框缺失菌株CXR3。如圖1。影印實驗顯示獲得候選突變株(AprsThios)，以polFIDF(5，-ATCGGCTTGITGTTCAGGAGG-3’)和 polFIDR(5’-TGTGACCGTGAACGCTTTGG-3’ )為鑒定引物，進ー步的PCR驗證結果顯示，該候選突變株可擴增到預期的0.44-kb的預期PCR產物，而S.aureochromogenes產生的PCR產物的大小為0.89_kb,說明該候選突變株為polF的同框缺失菌株，命名為CXR3。構建示意圖及電泳驗證，如圖1。
[0021]實施例2
驗證CXR3為polyoxin B的高產菌株,具體操作方法如下:
接種隨機挑選的三株CXR3突變株孢子于TSB中，30°C培養36 h左右，接種到發酵搖瓶中，每隔12 h調節發酵液的pH值至中性，連續培養3 d左右，發酵液用草酸調節pH值至
3-4,過濾后得濾液。
[0022]取酸化處理后的發酵液進行生物測定，同時以野生型作為對照，結果顯示，隨機挑選的CXR3突變株的發酵液與野生型相比，CXR3的發酵液喪失對指示酵母的生物活性，暗示CXR3產生的多氧霉素組分可能發生變化，如圖2。發酵液進一步進行HPLC檢測，流動相為每升含有10 mM己烷磺酸鈉鹽和2 ml的乙酸溶液一乙腈(6:4)，流速為0.5ml/min，檢測波長為264nm,結果顯示，CXR3的樣品相7底喪失了 polyoxin A(34.0 min)與polyoxinH(41.0 min)的特征峰，但是在16.5 min中的位置產生一個新的峰，其與多氧霉素標準品中的polyoxin B組分(16.3 min)的保留時間基本一致，如圖3 ;對該峰進行及LC/MS檢測，結果顯示該峰產生特征性的[M+H]+離子流?/^ 508.3，其產生的二級斷裂碎片為490.1，429.1及305.1，其一級質譜與二級質譜與polyoxin B標準品完全吻合，從而確證CXR3產生的主要組分為Pol yoxin B,如圖4。
【權利要求】
1. 一種產多氧霉素的基因工程菌，其特征在于，該菌的/70が'基因發生突變，喪失功能。
2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述突變為/70が'基因同框缺失突變。
3.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的出發菌為金色產色鏈霉索 C51.aureochromogenes )。
4.權利要求f3所述產多氧霉素基因工程菌的構建方法，其包括如下步驟:通過構建帶有報告基因的/70が'基因敲除載體，將該載體導入到目標菌株后篩選陽性菌株。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述基因敲除載體帶有報告基因。
6.根據權利要求4或5所述的構建方法，其特征在于，所述基因敲除不改變/70が'基因的閱讀框。
7.權利要求r3任一項所述的基因工程菌在制備多氧霉素中的應用。
8.一種制備多氧霉素的方法，該方法是通過培養權利要求f 3任一項所述的基因工程菌，并從發酵液中分離得到多氧霉素。
9.一種用于制備權利要求1或2所述基因工程菌的載體，其特征在干，該載體包括 基因上下游各2.5kb的基因片段和來自PJTU2180+的tsr基因。
【文檔編號】C12P21/02GK103525747SQ201310502123
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】陳文青, 鄧子新, 程放, 汪長春 申請人:武漢大學