牛雙芽巴貝斯焦蟲病pcr快速診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，它包括紅細胞裂解液，TBS液，蛋白酶K，裂解液，PCR酶，DL2000Marker，引物，陽性對照，陰性對照，TE緩沖液，吸附柱。本發明研制了用于檢測牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，可從牛全血臨床樣本中直接檢測到牛雙芽巴貝斯焦蟲病病原核酸，試劑盒的靈敏度約為41.2pg,整個檢測過程從開始到出結果僅需6小時。由此可見，該試劑盒具有快速、靈敏性高、特異性強等特點。適用于牛雙芽巴貝斯焦蟲病的檢測、診斷和流行病學調查。
【專利說明】牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種試劑盒，尤其是一種牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒。【背景技術】
[0002]雙芽巴貝斯焦蟲(Babesia bigemina)病是對牛危害較大的一種血液寄生蟲病。蟲體經微小牛蜱、鐮形煽頭蜱和二棘血蜱等中間宿主傳播給牛體，當蜱叮咬牛時,蟲體隨蜱的唾液進入牛體，隨即由血液進入紅細胞，在紅細胞內以“成對出芽”方式進行繁殖。牛感染上雙芽巴貝斯焦蟲病，其臨床癥狀表現為稽留熱(體溫升高至40~41.5°C)，病畜精神沉郁，食欲不振，腹瀉或便秘，消瘦、貧血，黏膜蒼白、黃膽，后期通常出現血紅蛋白尿，急性病例在4~8天內死亡。
[0003]牛雙芽巴貝斯焦蟲病的流行歷史悠久，極大地威脅著養牛業的發展。凡是引進純種牛、雜交牛和本地牛混合飼養放牧的場所，極容易發生和流行此病，如不及時治療其發病死亡率則占發病數50%~100%，這將給養牛生產帶來嚴重的損失。目前，隨著人們對乳牛制品的需求日益增長，草山草坡資源的綜合開發和利用，人工草地飼養與發展奶牛、改良牛群數量日漸增加，該病的發生和流行日趨增加，對于確診該病，有效地控制和預防該病的發生和流行顯得尤為重要。傳統的診斷方法是根據臨床癥狀和血涂片光學顯微鏡檢查確診，但由于該蟲在顯微鏡下難于與附紅體、牛巴貝斯蟲、泰勒焦蟲等血液原蟲區分，這為準確判斷該病造成了影響；有許多血清學方法可檢測該病原，如:補體結合試驗，間接免疫熒光抗體試驗，間接血凝試驗等，但存在一定的假陽性和假陰性，現在市場缺少一種能對牛雙芽巴貝斯焦蟲病臨床樣本進行簡便、快捷、靈敏、準確的檢測試劑盒。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是:提供一種牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，它可以從全血臨床樣本中直接檢測到牛雙芽巴貝斯焦蟲病原核酸，靈敏度約為41.29pg，具有簡便、快捷、靈敏、準確的特點。
[0005]本發明是這樣實現的:牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，它包12mL紅細胞裂解液，6mL TBS 液，1.2mL 蛋白酶 K，5.4mL 裂解液，300μ? PCR 酶，300μ? DL2000Marker, 60μ?引物，60μ?陽性對照，330μ?陰性對照，6mL TE緩沖液，30個吸附柱；引物包括上引物及下引物，上引物及下引物的體積均為30μ?，濃度均為20 μ M ;上引物的序列為:5’ -CCCCTATCACCTTCAACC _3’，下引物序列為:5’ -ACTGCGAGCACTCAATCC -3’。
[0006]紅細胞裂解液組成包括1.5Μ NH4CL, IOOmM KHCO3 及 IOmM Na4EDTA,用 IN HCL 或 INNaOH 調 pH 至 7.2-7.4。
[0007]TBS 液包括 10mmoL/L 的 Tris 含 0.9%NaCL,用 IN HCL 調 pH 至 7.4。
[0008]蛋白酶K用TE溶液配制成20mg/mL。
[0009]裂解液包括IOmM的Tris-HCLUmia^ EDTA、2.5M的NaCL以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液。[0010]TE緩沖液包括:IOmM的Tris-HCL及ImM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7.8。
[0011]PCR 酶的組成包括:10mM 的 Tris-HCL (PH8.3)、50mM 的 KCL、1.5mM 的 MgCL2 以及
0.05U Polymerase/M-L。
[0012]陰性對照為超純水；陽性對照為牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA模板。
[0013]為了驗證本發明的技術效果，進行了以下實驗:
牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒的研制 材料與方法
1、參考蟲株:牛雙芽巴貝斯焦蟲標準蟲株DNA模板，由中國科學院蘭州獸醫研究所寄生蟲病室惠贈。附紅體、環形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA模板，均由本所重大疫病檢測室采集到的病料所提模板而得。
[0014]2、主要試劑
2.1引物(濃度為20 μ M，用TE溶液配制)
根據牛雙芽巴貝斯焦蟲熱休 克蛋白基因片段設計引物，PCR擴增出一長度為318bp大小的特異片段，該序列在Genbank上的登錄號為AF332567.1。引物序列如下:
上引物:5’ -CCC CTA TCA CCT TCA ACC -3，
下引物:5’ -ACT GCG AGC ACT CAA TCC -3’
由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0015]2.2 PCR試劑盒的組成:⑴紅細胞裂解液；(2)TBS液；(3)蛋白酶K J4)裂解液；(5)PCR酶；(6) DL2000 Marker ;(7)引物；(8)陽性對照；(9)陰性對照；(10) TE緩沖液；(11)吸附柱。
[0016]2.3樣本的采集
用檸檬酸鈉或EDTA作為抗凝劑無菌采集牛全血，_20°C保存備用。
[0017]3、模板的提取
3.1全血中DNA的提取:取1000PL全血于1.5mL的離心管中，10000r/min，離心2分鐘,去上清；用1000PL生理鹽清洗，10000r/min，離心2分鐘，去上清，采用同樣的方法共清洗3次，收集沉淀。在收集沉淀的離心管中，加入200μ?的生理鹽水和200-400μ?的紅細胞裂解液，充分搖勻，10000r/min,離心2分鐘，去上清。在離心管中加入20(^LTBS液、40μ?蛋白酶K，搖勻，再加入160μ?裂解液充分混勻，70°C水浴作用15-20分鐘，取出，加入無水乙醇200μ?，充分搖勻，然后倒入吸附柱里，離心2分鐘，去上清，加入500μ?清洗劑進行清洗，10000r/min,離心I分鐘,反復清洗兩次,然后將倒掉了清洗劑吸附柱10000r/min,再離心2分鐘，取出吸附柱，置室溫5分鐘，將清洗劑完全晾干。再將吸附柱放入另一個干凈的收集管中，加入60-100μ?ΤΕ緩沖液，室溫放置2_5分鐘，10000r/min，離心2分鐘。為了獲得更多的DNA模板，可將離心過的溶液再加在吸附柱里，同樣室溫放置2-5分鐘，10000r/min,離心2分鐘。然后將提取得到的DNA模板用加樣槍轉入存放DNA模板的離心管里。
[0018]3.2附紅體、環形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA模板的提取，與上述方法相同。
[0019]4、牛雙芽巴貝斯焦蟲特異性片段的PCR擴增
采用提取的DNA摸板，利用合成的引物在PCR酶的作用下進行擴增。反應體系和條件如下:PCR酶為10μ?，雙芽巴貝斯焦蟲標準蟲株DNA模板2μ?，樣本DNA摸板2μ?，上下引物各?μ?，加入ddH20至25μ?，在Tgradient96擴增儀下進行如下循環:94°C變性3分鐘，94°C 35秒，53.4°C 35秒，72°C 40秒，30個循環，最后72°C延伸10分鐘。反應結束后將擴增產物取7μ?進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳檢測顯示約在318bp處，出現一條PCR目標帶，其結果如圖1所示，與預計的結果非常接近。
[0020] 5、PCR法擴增的特異性測定
分別用附紅體、環形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA為摸板，進行PCR擴增，除牛雙芽巴貝斯焦蟲出現擴增帶，其它的蟲株未見特異性318bp片段擴增。結果如圖2所示。
[0021 ] 6, PCR法擴增的敏感性的測定
采用TU-1800spc紫外可見光光度計，取OD值為260nm，將牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA摸板稀釋100倍，進行濃度的測量。根據摸板濃度(PgZ^L)=A26tlX稀釋倍數X38/1000的方法進行計算。測得牛雙芽巴貝斯焦蟲標準DNA模板的平均OD26tl值為0.05433nm,根據模板濃度的計算方法進行計算，結果得實驗提取的牛雙芽巴貝斯焦蟲標準DNA模板的含量為0.206μδ/KL。在進行敏感性試驗時，按對數稀釋法對DNA模板進行稀釋后，取2 PL模板進行擴增，則牛雙芽巴貝斯焦蟲標準DNA濃度依次為412ng,41.2ng,4.12ng,412pg,41.2pg,4.12pg,412fg，41.2fg，4.12fg。可檢出的牛雙芽巴貝斯焦蟲標準DNA模板的含量最小是41.2pg，即靈敏度為41.2pg。結果如圖3所示。
[0022]7、重復性試驗
應用建立的PCR方法，重復檢測3次，檢驗牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA樣品結果的可靠性。研制結果是:應用建立的PCR方法，重復檢測牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA樣品3次結果均一致。
[0023]8、試劑盒的保存期檢測
將試劑盒在4°C、一 20°C分別保存I個月、3個月、6個月、I年，對陽性樣品進行檢測，以確定試劑盒的保存時間。研制結果是:4°C保存I年條帶較淡，一 20°C保存I個月、3個月、6個月、I年對條帶亮度無影響。
[0024]由于采用了上述技術方案，本發明研制了用于檢測牛雙芽巴貝斯焦蟲病的PCR試劑盒，可從牛全血臨床樣本中直接檢測到牛雙芽巴貝斯焦蟲病原核酸，試劑盒的靈敏度為41.2pg,從開始到出結果整個檢測過程僅需6小時。由此可見，該試劑盒具有快速、靈敏性高、特異性強等特點。適用于牛雙芽巴貝斯焦蟲病的檢測、診斷和流行病學調查。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]附圖1為牛雙芽巴貝斯焦蟲特異性片段試驗圖；
M.Marker DL2000 ；1.標準陰性；2.標準陽性；3.被檢出的陽性樣本；
附圖2為PCR特異性試驗圖；
M.Marker DL2000 ；1.牛雙芽巴貝斯焦蟲；2.附紅體；3.環形泰勒焦蟲；4.巴貝斯焦
蟲；
附圖3為PCR敏感性 試驗圖；
M.Marker DL2000 ；1.DNA 模板為 412ng ；2.DNA 模板為 41.2ng ；3.DNA 模板為 4.12ng ；4.DNA 模板為 412pg ；5.DNA 模板為 41.2pg ；6.DNA 模板為 4.12pg ；7.DNA 模板為 412fg ；8.DNA 模板為 41.2fg。
【具體實施方式】[0026]本發明的實施例:牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，它包12mL紅細胞裂解液，6mL TBS 液，L2mL 蛋白酶 K，5.4mL 裂解液，300μ? PCR 酶，300μ? DL2000 Marker,60μ?引物，60μ?陽性對照，330μ?陰性對照，6mL TE緩沖液，30個吸附柱；引物包括上引物及下引物，上引物及下引物的體積均為30μ?，濃度均為20μΜ;上引物的序列為:5’-CCCCTATCACCTTCAACC _3’，下引物序列為:5’ -ACTGCGAGCACTCAATCC -3’；紅細胞裂解液組成包括 1.5Μ NH4CL, IOOmM KHCO3 及 IOmM Na4EDTA,用 IN HCl 或 IN NaOH 調 pH 至
7.2-7.4 ；TBS 液包括 10mmoL/L 的 Tris 含 0.9%NaCL,用 IN HCl 調 pH 至 7.4 ;蛋白酶 K 用TE溶液配制成20mg/mL ;裂解液包括IOmM的Tris-HCL、ImM的EDTA、2.5M的NaCL以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液；TE緩沖液包括:10mM的Tris-HCL及ImM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7.8 ；PCR酶的組成包括:10mM的Tris-HCL (PH8.3)、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U Polymerase/^L ;陰性對照為超純水；陽性對照為牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA模板。
[0027]本發明中，M表示摩爾濃度單位，即是moL/L ;mM毫摩爾濃度單位，即是mmoL/L，N的當量濃度單位。
[0028]試劑盒中通常還配備清洗劑，清洗劑的用量是30mL，一般可以自己配制，成分是質量百分比為70%的 乙醇。
【權利要求】
1.一種牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:它包12mL紅細胞裂解液，6mL TBS 液，1.2mL 蛋白酶 K，5.4mL 裂解液，300μl PCR 酶，300μ? DL2000 Marker,.60μl引物，60μ?陽性對照，330μ?陰性對照，6mL TE緩沖液，30個吸附柱；引物包括上引物及下引物，上引物及下引物的體積均為30μ?，濃度均為20μΜ;上引物的序列為:.5’ -CCCCTATCACCTTCAACC -3’，下引物序列為:5’ -ACTGCGAGCACTCAATCC -3’。
2.根據權利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:紅細胞裂解液組成包括 1.5Μ NH4CL, IOOmM KHCO3 及 IOmM Na4EDTA,用 IN HCL 或 IN NaOH調 pH至 7.2-7.4。
3.根據權利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:TBS液包括 10mmoL/L 的 Tris 含 0.9%NaCL,用 IN HCL 調 pH 至 7.4。
4.根據權利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:蛋白酶K用TE溶液配制成20mg/mL。
5.根據權利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:裂解液包括IOmMTris-HCL、lmMEDTA、2.5M NaCL以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液。
6.根據權利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:TE緩沖液包括=IOmM的Tris-HCL及ImM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7.8。
7.根據權利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:PCR 酶的組成包括:10mM 的 Tris-HCL (PH8.3)、50mM 的 KCL、1.5mM 的 MgCL2 以及 0.05UPolymerase/M-L 。
8.根據權利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:陰性對照為超純水；陽性對照為牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA模板。
【文檔編號】C12Q1/68GK103509873SQ201310502734
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】吳位珩, 孫啟躍, 楊莉, 文才智, 張劍剛, 楊茂生 申請人:貴州省畜牧獸醫研究所