動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法
【專利摘要】本發明公開了一種動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法。多重Taqman-MGB探針實時熒光PCR方法可對流產嗜衣原體（Ch.abortus）、家畜嗜衣原體(Ch.pecorum)、鸚鵡熱嗜衣原體（Ch.psittaci）進行快速檢測。本檢測方法以三種衣原體靶序列MOMP的保守區域為基礎，設計3對引物和3條Taqman-MGB探針。本發明只需要兩步法擴增法及簡單的反應條件就可以快速、高效、特異性、高靈敏度地檢測目的靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，對操作人員沒有技術上的要求，檢測成本低，檢測時間短。可避免因進行瓊脂糖電泳而可能造成的交叉污染，從而提高檢測的準確率和可信度。
【專利說明】動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物分子生物學檢驗方法及檢驗試劑領域，具體涉及一種動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和方法。
【背景技術】
[0002]動物衣原體病ipilamydiosis)是由各類衣原體{Chlamydia)感染哺乳動物、禽類等動物所發生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行，常造成很大危害及經濟損失。衣原體科的最新分類研究表明，衣原體科分為衣原體屬{Chlamydia )和嗜衣原體屬iChlamydophila)，包括沙眼衣原本{ChlamydiatracAoffiaiis)、豬源衣原體{Chlamydia Swi1S)、鼠沙眼衣原體OiuridarumsKH產嗜衣原體 iChlamydophila aAoriws)、貓嗜衣原體{Chlamydophilafelis~)、家畜靖灰盾、體 ipilamydophila pecorum)、肺炎衣原體{Chlamydophila pneumoniae)和鶴踏熱衣原體{Chlamydophila psittaci)。動物衣原體病中嬰I踏熱衣原體病和流產衣原體病被國際動物衛生組織(Office International des Epizooties, 0IE)列為 B 類疾病,
我國農業部動物疫病分類方法(1999-02-12)將衣原體病歸為三類動物病原微生物。根據OIE《陸生動物手冊》相關規定:進出口來自于衣原體疫區或國家的相關動物及其產品須獸醫主管部門出具相關證明，嚴格限制，這極大的影響畜牧業和國際貿易的發展。同時由于部分衣原體病屬于人獸共患傳染病，在公共衛生安全領域尤其畜牧從業人員、醫護人員等影響較大，為此對衣原體的檢測，顯得十分必要。為了方便對進出口的肉質產品進行檢驗，減小人類和動物感染衣原體的可能性，對衣原體的檢測顯得尤為重要。
[0003]TaqMan探針是一種募核昔酸探針，突光基團鏈接在探針的5’末端,洋滅基團則在3，端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發射熒光。一分子的產物生成就會伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷的積累。因此TaqMan探針檢測的是積累熒光。目前，水解探針已被用于基因檢測、病毒定量、癌細胞基因微突變檢測、細胞因子基因定量等，其結果都具有高特異性與高敏感性。
[0004]TaqMan — MGB探針是近年來的一種新型探針，它的淬滅基團是一種非熒光的淬滅基團，本身不會發生熒光，這樣就降低了 PCR反應熒光本底信號的強度，進一步提高了其敏感性。
[0005]中國發明專利(申請號為:200910103457.4、200910094278、200480005196.8、201310009019.8、20 1 1800 I 5 187.7、20 11 10143186.2、20 1 1 10279330.5、200910200396.3,200910200393.X ,200910094272.1,200910094279.3 等)分別公開了采
用熒光定量PCR擴增技術檢測病菌和動物疫病的方法。但是，目前尚無利用TaqMan — MGB探針熒光定量PCR擴增技術檢測三種衣原體分型的試劑盒及檢測方法的報道。
【發明內容】
[0006]為克服現有技術的不足，本發明的第一個目的是提供一種三種衣原體(流產嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體)TaqMan — MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物，第二個目的是提供使用該引物的試劑盒，第三個目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒對進出口的肉質產品進行檢驗的檢測方法。
[0007]為了實現上述第一目的本發明米用的技術方案是:一種動物衣原體Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物，包括流產嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ IDN0.1 ;流產嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ;流產嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為 SEQ ID N0.3。
[0008]家畜嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.4 ;家畜嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.5 ;家畜嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.6。
[0009]鸚鵡熱衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.7 ;鸚鵡熱衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.8 ;鸚鵡熱衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.9。
[0010]為了實現本發明的第二目的采用的技術方案是:動物衣原體Taqman — MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，它包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中:
所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成:
DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的流產嗜衣原體上游引物0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的流產嗜衣原體下游引物0.4 μ L ;` DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的流產嗜衣原體MGB探針0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.4的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.5的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.6的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體MGB探針0.1 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.7的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.8的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.9的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體MGB探針0.2 μ L ;
2X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ;
滅菌去離子水3.9μ L ;
合計17 μ L,為單次反應的用量；
所述陽性對照管，管內為所述流產嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體三種衣原體的陽性重組質粒的混合DNA，體積為20 μ L ;
所述陰性對照管，管內為無所述三種衣原體感染的上皮組織基因組DNA，體積為20 μ L ；
所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
[0011]上述三種探針，流產嗜衣原體MGB探針、家畜嗜衣原體MGB探針和鸚鵡熱衣原體MGB探針的5’端分別標記有報告基團NED、FAM和VIC，它們的3’端標記有非淬滅基團。
[0012]為了實現上述第三目的本發明采用的技術方案是:動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法，包括如下步驟:I)制備待檢模板DNA:選用市售化的細胞培養液DNA提取試劑盒，提取待檢樣品中DNA，獲得待檢模板
DNA ；
2)擴增反應體系為:17μ L擴增反應液；3 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20 μ L;
3)三種衣原體熒光定量PCR擴增:將配制好的步驟2)中的擴增反應體系進行PCR管反應，條件:預變性95°C 30s ；95°C 5s, 58 °C 30s~34s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環；在58°C 30s進行熒光信號的采集；
4)結果判定:將擴增反應在35個循環以內及擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0013]本發明的原理是:針對三種衣原體1000bp左右的靶序列上MOMP保守區域分別設計3對引物和3條MGB探針，利用探針只與模板特異性地結合，其結合的位點在兩條引物之間。三條探針的5’端標記有報告基團分別為FAM、VIC、NED，3’端標記有非淬滅基團，本身不產生熒光，可以大大降低本低信號的強度。同時探針上還連接有MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，可以將MGB探針設計的更短，既降低了合成車成本，也使得探針設計的成功率大為提高。這種實驗方法所使用的儀器比較簡單，同時克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本等缺點、此外，該檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡單，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。
[0014]TaqMan—MGB探針熒光定量PCR擴增技術是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增方法。將此基因擴增技術與普通PCR或普通的TaqMan探針技術進行比較，可發現該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上優于上面的技術，且不依賴于任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測。現有的豬衣原體的檢測周期較長，約I天，操作繁瑣，而本發明的試劑盒僅需50min左右。`
[0015]本發明的優點是(I)、不需要特殊試劑與設備；(2)、高特異性:應用MOMP的保守區段，3對引物及3條MGB探針，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，陽性率可達于99.2%，假陽性率小于0.2% ; (3)、快速、高效擴增:檢測時間50min左右；(4)、靈敏度高--最低檢測極限達分別達到2.02X10拷貝/ μ L，3.08拷貝/ μ L，1.6X 10拷貝/ μ L。標本的檢出率達到98.8%; (5)、鑒定簡便:通過最后的擴增曲線就可以進行結果的精確的，無需電泳等其他任何分析步驟；(6)、用途:可用于三種衣原體及其相關產品的快速檢測及分型。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為特異性試驗結果；
圖2為流產嗜衣原體的靈敏度試驗結果；
圖3為家畜嗜衣原體的靈敏度試驗結果；
圖4為鸚鵡熱衣原體的靈敏度試驗結果；
圖5為穩定性試驗結果；
圖6為家畜嗜衣原體標準曲線；
圖7為流產嗜衣原體標準曲線；
圖8為鸚鵡熱衣原體標準曲線；圖9為三種衣原體同時擴增的標準曲線；
圖1中:分別采用了家畜嗜衣原體菌株VR-1575，肺炎衣原體菌株53592，流產嗜衣原體菌株VR-656，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對照。
【具體實施方式】
[0017]實施例1，引物的設計及篩選 三種衣原體(包括流產嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體)熒光定量PCR擴增引物及探針，其設計是根據GenBank公布的三種衣原體MOMP基因的參考序列，用MEGA5進行比對，分析序列并在其保守區域進行引物與探針的設計。采用探針設計軟件PrimerExpress 3.0，設計12套熒光定量引物，由英駿(上海)有限公司合成，利用ABI 7500 FASTPCR儀對反應進程中的擴增情況進行實時監控，對不同引物組及探針擴增的起始時間、進入最大擴增速率的時間、最大擴增速率及達到平臺期所需時間等參數進行分析，篩選出擴增速率最高、特異性好的三組熒光定量PCR擴增引物與探針，分別標記為SEQ ID N0.1~SEQID N0.9，其中引物與探針的的濃度均為10 ymol/L。同時，利用PCR引物軟件設計陽性重組質粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分別為:PCR上游引物:SEQ ID N0.10 ;PCR下游引物:SEQ ID N0.11 ;它們的體積比為1:1。
[0018]SEQ ID N0.1 代表的序列為:5’ -GCATGGGTGCAGTTCCTACA-3’
SEQ ID N0.2 代表的序列為:5’ -TGGGTCTATCCGTAGGAGTTTTG-3’
SEQ ID N0.3 代表的序列為:5’ NED-ACCGCAGCAGCTAA-MGB3’
SEQ ID N0.4 代表的序列為:5’ -GCAGAGCCAAGTTTATTAATTG-3’。
[0019]SEQ ID N0.5 代表的序列為:5’ -TAGCGCAAGGATCACATG-3’
SEQ ID N0.6 代表的序列為:5’ FAM-ACCGCAGCAGCTAA-MGB3’
SEQ ID N0.7 代表的序列為:5’ -GCAACTCCTACGCAGGCTACA-3’
SEQ ID N0.8 代表的序列為:5’ -TCGGTCTGCCATTTGCTTCT-3’
SEQ ID N0.9 代表的序列為:5’ VIC-AACGCAAGTAATACTAATCA-MGB3’
SEQ ID N0.10 代表的序列為:5’ -CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’。
[0020]SEQ ID N0.11 代表的序列為:5’ -GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’
實施例2，陽性對照品的制備
用試劑盒提取流產嗜衣原體細胞培養物的核酸，將其核酸進行PCR及電泳鑒定，采用PCR上游引物SEQ ID N0.10和PCR下游引物SEQ ID N0.11按照常規PCR擴增方法進行擴增，并使用膠回收試劑盒回收擴增的條帶。按照1:10的比例和PMD19T載體進行連接反應，4°C連接過夜，轉化DH5 α菌，經抗性選擇和PCR鑒定陽性后，再測序驗證，利用分光光度計測定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8^2.0之間。獲得流產嗜衣原體陽性重組質粒DNA。按照上述方法制備家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體陽性重組質粒DNA。將三種陽性重組質粒按照1:1:1的體積比例混合。
[0021 ] 實施例3，陰性對照品的制備
用試劑盒提取無上述三種衣原體的上皮組織的DNA，進行PCR及電泳鑒定。
[0022]實施例4，三種衣原體熒光定量PCR擴增快速檢測方法:包括如下步驟:O制備待檢模板DNA:選用商品化的DNA提取試劑盒，提取樣品中的DNA，獲得待檢模
板 DNA ；
2)擴增反應體系為:17μ L擴增反應液；3 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20 μ L;
3)三種衣原體熒光定量PCR擴增:將配制好的步驟2)的擴增反應體系進行PCR管反應條件:預變性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環；在58°C 30s進行熒光信號的采集。
[0023]4)結果判定:將擴增反應在35個循環以內及擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0024]實施例5，三種衣原體熒光定量PCR擴增的特異性試驗
采用實施例4的反應體系及反應條件進行特異性的試驗，所采用的模板分別是家畜嗜衣原體菌株VR-1575，肺炎衣原體菌株53592，流產嗜衣原體菌株VR-656，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123,貓衣原體，陰性對照。本方法為多重PCR方法，可以同時擴增出三種不同的衣原體，參見圖1的結果顯示，圖中三條曲線分別表示家畜嗜衣原體、流產嗜衣原體、鸚鵡熱衣原體。
[0025]實施例6，三種衣原體熒光定量PCR擴增的靈敏度試驗
將所建立的三種陽性重組質粒標準品分別進行10倍倍比稀釋，采用實施例4的反應體系及反應條件進行靈敏度試驗，結果顯示出，建立的該方法最低能夠檢測出分別為:流產嗜衣原體為2.02X10拷貝/ μ L，家畜嗜衣原體為3.08拷貝/ μ L，鸚鵡熱衣原體1.6 X 10拷貝/ UL的DNA樣品。`
[0026]結果如圖2、3、4所示:圖2表示中從左到右表示的濃度分別是:2.02Χ106拷貝/ μ L、2.02Χ105 拷貝 / μ L、2.02X 104 拷貝 / μ L、2.02X IO3 拷貝 / yL、2.02X 102 拷貝/ yLd.C^XlO1拷貝/ 1^、2.02父10°拷貝/ μ L ;圖3表示家畜嗜衣原體的靈敏度，從左到右表示的濃度分別是:3.08 X IO6拷貝/ μ L、3.08 X IO5拷貝/ μ L、3.08 X IO4拷貝/ μ L、3.08X 103 拷貝 / μ L、3.08X 102 拷貝 / μ L、3.08X IO1 拷貝 / μ L、3.08X 10。拷貝/ μ L ;圖4表示鸚鵡熱衣原體的靈敏度，從左到右表示的濃度分別是:1.6XIO6拷貝/ μ L、1.6 X IO5 拷貝 / μ L、1.6 X IO4 拷貝 / μ L、1.6 X IO3 拷貝 / μ L、1.6 X IO2 拷貝 / μ L、1.6 XlOlfW/ μ L、1.6Χ10° 拷貝 / μ L。
[0027]實施例7，三種衣原體熒光定量PCR擴增的重復性試驗
以重組質粒標準品(三種衣原體的混合重組質粒)1.7 X IO6拷貝/ μ L與1.7 X IO7拷貝/μ L為模板，采用實施例4的反應體系及反應條件進行重復性試驗，組內與組間重復試驗變異系數為0.595%~1.642%，表明該方法具有較好的重復性。參見圖5的結果顯示。
[0028]實施例8，三種衣原體熒光定量PCR擴增的標準曲線的建立
把三種衣原體的混合重組質粒標準品進行五個倍比稀釋，進行標準曲線的制作，以熒光強度的對數值為橫坐標，循環數為縱坐標作圖，得到標準曲線，相關系數都為R2=0.999，擴增效率分別達到:家畜嗜衣原體CL pecorum 99.5 % ;鸚鵡熱衣原體CL Psi ttaci103.2% ;流產嗜衣原體CA abortus 103.2% ;其擴增方程分別為:家畜嗜衣原體(CApecorum) Y= - 3.34x+38.80,嬰I踏熱衣原體{Ch.psittaci) Y= - 3.25x+40.36,流產嗜衣原體(^?.abortus) Y= - 3.24x+38.51。由此可見本實驗所建立的標準曲線的擴增效率是較好，其熒光曲線與所檢測的靶基因濃度之間的相關性較好，準確度較高。參見圖6、7、8、9的結果顯示。
【權利要求】
1.一種動物衣原體Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物，其特征在于:包括流產嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1 ； 流產嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ； 流產嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.3 ； 家畜嗜衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.4 ； 家畜嗜衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.5 ； 家畜嗜衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.6 ； 鸚鵡熱衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.7 ； 鸚鵡熱衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.8 ； 鸚鵡熱衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.9。
2.動物衣原體Taqman— MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:它包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中: 所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成: DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的流產嗜衣原體上游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的流產嗜衣原體下游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的流產嗜衣原體MGB探針0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.4的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.5的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體上游引物0.2 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.6的10 μ mo I/L的家畜嗜衣原體MGB探針0.1 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.7的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.8的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體上游引物0.6 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.9的10 μ mo I/L的鸚鵡熱衣原體MGB探針0.2 μ L ;
2 X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ; 滅菌去離子水3.9μ L ; 合計17 μ L,為單次反應的用量； 所述陽性對照管，管內為所述流產嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體三種衣原體的陽性重組質粒的混合DNA，體積為20 μ L ; 所述陰性對照管，管內為無所述三種衣原體感染的上皮組織基因組DNA，體積為20 μ L ； 所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
3.根據權利要求2所述動物衣原體Taqman— MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:所述流產嗜衣原體MGB探針、家畜嗜衣原體MGB探針和鸚鵡熱衣原體MGB探針的5’端分別標記有報告基團NED、FAM和VIC，它們的3’端標記有非淬滅基團。
4.利用權利要求2所述試劑盒進行動物衣原體Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法，包括如下步驟:其中所述動物衣原體包括流產嗜衣原體、家畜嗜衣原體和鸚鵡熱衣原體； 1)制備待檢模板DNA:選用市 售化的細胞培養液DNA提取試劑盒，提取待檢樣品中DNA，獲得待檢模板DNA ； 2)擴增反應體系為:17μ L擴增反應液；3 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20 μ L; 3)三種衣原體熒光定量PCR擴增:將配制好的步驟2)中的擴增反應體系進行PCR管反應，條件:預變性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s~34s 40個循環；在58°C 30s進行熒光信號的采集； 4)結果判定:將擴增反應在35個循環以內及擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
【文檔編號】C12Q1/04GK103555842SQ201310540233
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】聶福平, 王昱, 李應國, 楊俊 , 肖進文, 袁曾壯, 王國民, 李賢良 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心