一種甘露糖赤蘚糖醇脂的生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種甘露糖赤蘚糖醇脂的生產方法，包括：將經活化的蚜蟲擬酵母（Pseudozyma?aphidis）DSMZ70725接入種子培養液中進行種子培養，培養后分離得到菌體細胞；將菌體細胞接入發酵培養基中，于28～30℃條件下發酵培養7～15d，得到發酵液；從發酵液中分離純化得到甘露糖赤蘚糖醇脂；其中，所述的發酵培養基中含有植物油。本發明以植物油為底物，在合適的工藝下，通過微生物細胞轉化生產甘露糖赤蘚糖醇脂。本發明方法所用底物為可再生資源，產物無毒、環保，所得到的發酵液具有高表面活性；發酵過程中菌絲團小，底物轉化充分，粗產物產量大大提高；生產過程安全、簡便且易操作，產品品質高，容易實現產業化生產。
【專利說明】一種甘露糖赤蘚糖醇脂的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物發酵領域，尤其涉及一種甘露糖赤蘚糖醇脂的生產方法。
【背景技術】
[0002]表面活性劑是能夠顯著降低表面張力的兩親性物質，在工農業生產中發揮著重要作用。但現在國內市場應用的表面活性劑大多數是以石油為原料經人工化學合成的，在其生產過程中容易造成環境污染和質量安全等問題，而由微生物轉化獲得的表面活性劑，即生物表面活性劑則不存在此類問題。因此，生物表面活性劑將成為替代化學合成表面活性劑的選擇之一。生物表面活性劑是微生物在代謝過程中分泌的一種有高表面活性的物質，具有生物相容性、生物可降解性、無毒或低毒等特性，此外還具有多樣性的結構和生理活性。根據結構特點，生物表面活性劑可分為糖脂類、脂肽和脂蛋白類、磷脂和脂肪酸類、聚合表面活性劑類和微粒表面活性劑等五大類。
[0003]甘露糖赤蘚糖醇脂(Mannosylerythritol lipids, MELs)是一種糖脂類生物表面活性劑，與槐糖脂、鼠李糖脂相比，是現今國內研究較少的一類糖脂。MELs不僅具有良好的表面活性、乳化性、生物降解性、較低的臨界膠束濃度，還具有許多特殊的生理活性，如抑制微生物生長、誘導細胞變異、可分化人類骨髓性白血病細胞系和黑素瘤細胞、提高基因轉染效率、與糖蛋白有很強的配位能力等，可應用于環保、食品、化妝品、醫藥等行業。
[0004]關于MELs的生物轉化研究，國內報道較少。華兆哲等研究假絲酵母Candidaantarctic WHS112利用豆油為唯一碳源，獲得了生產甘露糖赤蘚糖醇脂的搖瓶發酵優化條件，最適條件為接種量5%~8%(v/v)，氮源為0.2%硝酸鈉，溫度為25°C，250mL三角瓶裝液量為30mL,初始pH6.0 (華兆哲，陳堅，朱文昌，等.假絲酵母(Candida antarcticWSHl 12)生產生物表面活性劑及降解正構烷烴的研究.南京大學學報(自然科學)，1998，32 (2): 149-154)。但是在該優化條件下,MELs的合成產量不高。Rau等研究了由Pseudozymaaphidis DSM70725發酵生產MELs的條`件。在發酵過程中及時補料，并添加甘露糖和赤蘚糖醇作為碳源，經過10天的發酵,最高產量可達75g/L (U.Rau, L.A.Nguyen, S.Schulz, etal.Formation and analysis of mannosylerythritol lipids secreted by Pseudozymaaphidis.Appl Microbiol Biotechnol，2005，66:551-559)。
[0005]但是，目前產量仍不高，難以工業化生產，主要原因在于現今所釆用的MELs生產方法存在細胞生長密度大、產物難以分離提取、MELs合成量低、不宜連續生產、原料生產成本聞等缺點。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種甘露糖赤蘚糖醇脂的生產方法，解決現有生物法制備甘露糖赤蘚糖醇脂工藝不成熟、原料成本高、產物產量低的問題。
[0007]—種甘露糖赤蘚糖醇脂的生產方法，包括:
[0008](I)將經活化的姆蟲擬酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725接入種子培養液中進行種子培養，培養后分離得到菌體細胞；
[0009](2)將菌體細胞接入發酵培養基中，于28~30°C條件下發酵培養7~15d，得到發酵液；
[0010](3)從發酵液中分離純化得到甘露糖赤蘚糖醇脂；
[0011]其中，所述的發酵培養基中含有植物油。
[0012]本發明所使用菌種為姆蟲擬酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725,該菌種購于德國菌種保藏中心，Deutsche Sammulung von Microorganismen und Zellkulturen(DSMZ)0
[0013]步驟(1)中，所述的活化為:將蚜蟲擬酵母DSMZ70725接種到活化培養基中，于25~30°C培養3~5d ;活化培養基可以為麥芽糖瓊脂培養基。優選地，將蚜蟲擬酵母DSMZ70725接種到麥芽糖瓊脂培養基中，于28°C培養4d，待菌絲體長滿平板備用。
[0014]以重量百分比計，所述的種子培養液包括以下成分:葡萄糖4.0~8.0%，硝酸鈉0.1~0.5%,硫酸鎂0.01~0.05%,磷酸二氫鉀0.01~0.05%,酵母粉0.1~1.0%。優選地，所述的種子培養液包括以下成分:葡萄糖4.0%，硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.03%,磷酸二氫鉀0.03%，酵母粉 0.1%。
[0015]所述種子培養的培養溫度為28~30°C，培養時間為3~5d。
[0016]種子培養完成后，菌體細胞可以通過如下方法分離得到:將培養后的種子液體離心，取菌體細胞，并用濃 度0.9%的氯化鈉溶液洗滌2~3次。
[0017]步驟(2)中，以每升發酵培養基計，所述菌體細胞的接入量可以為10~100g ;優選為 IOgo
[0018]所述的植物油可以為大豆油、橄欖油、菜籽油、葵花籽油、花生油、棉籽油、米糠油、玉米胚芽油、油茶籽油、紅花籽油和小麥胚芽油中的至少一種。植物油可以為單種油或不同植物油調配而成的調和油，以其作為生物轉化的底物，生產所得的表面活性劑安全無毒、品質優良，而且以可再生資源為轉化底物，可以有效減少環境污染，降低生產成本。
[0019]優選地，所述的植物油為大豆油、花生油和菜籽油的混合物，產物產率較高。
[0020]以重量百分比計，所述的發酵培養基包括以下成分:植物油4.0~12.0%，蛋白胨O~1.0%，硝酸鈉0.1~1.0%，硫酸鎂0.01~0.1%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸錳0.01~0.1%，硫酸銅0.01~0.1%，酵母粉0.1~1.0%。優選地，所述的發酵培養基包括以下成分:植物油8.0%，蛋白胨0.1%，硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.03%,磷酸二氫鉀0.03%,硫酸錳0.03%,硫酸銅0.01%，酵母粉1.0%。
[0021]所述的發酵培養基中可以加入已滅菌的玻璃珠，防止菌絲體成團。
[0022]所述發酵培養的培養時間優選為10~15d，使底物能夠被充分轉化。
[0023]所述的發酵培養為搖床振蕩培養，搖床轉速為150~220rpm。
[0024]步驟(3)中，所述的分離純化包括:將發酵液用有機溶劑萃取、分離2~3次，合并有機相，減壓濃縮除去有機溶劑，得到甘露糖赤蘚糖醇脂粗品；采用硅膠柱層析法對甘露糖赤蘚糖醇脂粗品進一步分離純化，先用正己烷洗脫，再用氯仿/甲醇進行梯度洗脫，得到甘露糖赤蘚糖醇脂。
[0025]本發明以植物油為底物，利用假絲酵母菌，在合適的工藝下，通過微生物靜息細胞轉化生產生物表面活性劑甘露糖赤蘚糖醇脂。[0026]本發明方法生產甘露糖赤蘚糖醇脂，所用底物為可再生資源，產物無毒、環保，所得到的發酵液具有高表面活性。發酵過程中菌絲團小，底物轉化充分，粗產物產量大大提高。本發明方法生產過程安全、簡便且易操作，產品品質高，容易實現產業化生產。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例中，所用菌種為Φ牙蟲擬酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725。該菌種購于德國菌種保藏中心，Deutsche Sammulung von Microorganismen und Zellkulturen(DSMZ)0
[0028]實施例1
[0029]本實施例中所用的植物油為大豆油。
[0030](I)菌種活化:以滅過菌的麥芽糖瓊脂平板為活化培養基，接入冷藏保存的菌株蚜蟲擬酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725，在28°C條件下活化培養4d，待菌絲體長滿平板備用。
[0031](2)種子培養:從平板培養基上挑取IcmX Icm的菌絲塊3塊接入裝有50mL種子培養液的250mL三角瓶中，在28°C、220rpm條件下4d ;將培養好的種子液體離心，取菌體細胞，并用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次；
[0032]其中，種子培養液組分包含葡萄糖4.0%，硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.03%,磷酸二氫鉀0.03%，酵母粉0.1%，蒸餾水。
[0033](3)發酵培養:將菌體細胞按濕重比例10g/L接入裝有IOOmL發酵培養基的500mL三角瓶中，在28°C、220rpm條件下培養IOd ；
[0034]其中，發酵培養基的成分包括:大豆油8.0%，蛋白胨0.1%，硝酸鈉0.2%，硫酸鎂0.03%，磷酸二氫鉀0.03%,硫酸錳0.02%,硫酸銅0.02%,酵母粉1.0%，蒸餾水。發酵培養基中加入已滅菌的玻璃珠。
[0035](4)分離純化:發酵培養完成后，離心，除去菌體及玻璃珠，得到發酵液；發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取、分離2次，合并有機相，并用旋轉蒸發儀減壓濃縮除去萃取溶劑，得到甘露糖赤蘚糖醇脂的粗品，約為80g/L。
[0036]所得到的甘露糖赤蘚糖醇脂粗產品，采用硅膠柱層析法進一步分離純化:將3X40cm的玻璃層析柱洗凈烘干，并用氯仿潤濕。用氯仿浸泡200~300目硅膠，除去雜質，濕法裝柱，用氯仿平衡。粗樣品溶于氯仿，緩慢上樣，樣品先用正己烷洗脫。再用氯仿和甲醇按照比例進行梯度洗脫，即氯仿:甲醇=1:10、5:5和O:1逐步洗脫，控制洗脫速率為0.SmL/min0每管收集10mL。分離后的各組分，用TLC鑒定，相同部分合并。得到較純樣品。
[0037]實施例2
[0038]本實施例中所用的植物油為調和油，按照體積比計算，組成為大豆油:花生油:菜籽油=6:3:1。
·[0039](I)菌種活化:以滅過菌的麥芽糖瓊脂平板為活化培養基，接入冷藏保存的菌株蚜蟲擬酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725，在28°C條件下活化培養4d，待菌絲體長滿平板備用。
[0040](2)種子培養:從平板培養基上挑取IcmX Icm的菌絲塊3塊接入裝有50mL種子培養液的250mL三角瓶中，在28°C、220rpm條件下4d ;將培養好的種子液體離心，取菌體細胞，并用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次；
[0041]其中，種子培養液組分包含葡萄糖4.0%，硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.03%，磷酸二氫鉀0.03%，酵母粉0.1%，蒸餾水。
[0042](3)發酵培養:將菌體細胞按濕重比例10g/L接入裝有IOOmL發酵培養基的500mL三角瓶中，在28°C、220rpm條件下培養IOd ；
[0043] 其中，發酵培養基的成分包括:調和油10.0%，硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.03%,磷酸二氫鉀0.03%，硫酸錳0.02%，硫酸銅0.02%，酵母粉1.0%，蒸餾水。發酵培養基中加入已滅菌的玻璃珠。
[0044](4)分離純化:發酵培養完成后，離心，除去菌體及玻璃珠，得到發酵液；發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取、分離2次，合并有機相，并用旋轉蒸發儀減壓濃縮除去萃取溶劑，得到甘露糖赤蘚糖醇脂的粗品，約為88g/L。
[0045]所得到的甘露糖赤蘚糖醇脂粗品，采用硅膠柱層析法進一步分離純化:將3X40cm的玻璃層析柱洗凈烘干，并用氯仿潤濕。用氯仿浸泡200~300目硅膠，除去雜質，濕法裝柱，用氯仿平衡。粗樣品溶于氯仿，緩慢上樣，樣品先用正己烷洗脫。再用氯仿和甲醇按照比例梯度洗脫，即氯仿:甲醇=1:10、5:5和O:1逐步洗脫，控制洗脫速率為0.8mL/min。每管收集10mL。分離后的各組分，用TLC鑒定，相同部分合并。得到較純樣品。
[0046]實施例3
[0047]本實施例中所用的植物油為大豆油。
[0048](I)菌種活化:以滅過菌的麥芽糖瓊脂平板為活化培養基，接入冷藏保存的菌株蚜蟲擬酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725，在28°C條件下活化培養4d，待菌絲體長滿平板備用。
[0049](2)種子培養:從平板培養基上挑取IcmX Icm的菌絲塊3塊接入裝有30mL種子培養液的250mL三角瓶中，在28°C、220rpm條件下3d ;將培養好的種子液體離心，取菌體細胞，并用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次；
[0050]其中，種子培養液組分包含葡萄糖4.0%，硝酸鈉0.2%，硫酸鎂0.02%,磷酸二氫鉀
0.02%，酵母粉0.1%，蒸餾水。
[0051](3)發酵培養:將菌體細胞按濕重比例10g/L接入裝有IOOmL發酵培養基的500mL三角瓶中，在28°C、220rpm條件下培養15d ；
[0052]其中，發酵培養基的成分包括:大豆油8.0%，硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.03%,磷酸二氫鉀0.03%，硫酸錳0.02%，硫酸銅0.01%，酵母粉1.0%，蒸餾水。發酵培養基中加入已滅菌的玻璃珠。
[0053](4)分離純化:發酵培養完成后，離心，除去菌體及玻璃珠，得到發酵液；發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取、分離2次，合并有機相，并用旋轉蒸發儀減壓濃縮除去萃取溶劑，得到甘露糖赤蘚糖醇脂的粗品，約為80g/L。
[0054]所得到的甘露糖赤蘚糖醇脂粗品，采用硅膠柱層析法進一步分離純化:將3X40cm的玻璃層析柱洗凈烘干，并用氯仿潤濕。用氯仿浸泡200~300目硅膠，除去雜質，濕法裝柱，用氯仿平衡。粗樣品溶于氯仿，緩慢上樣，樣品先用正己烷洗脫。再用氯仿和甲醇按照比例梯度洗脫，即氯仿:甲醇=1:10、5:5和O:1逐步洗脫，控制洗脫速率為0.8mL/min。每管收集10mL。分離后的各組分，用TLC鑒定，相同部分合并。得到較純樣品。
【權利要求】
1.一種甘露糖赤蘚糖醇脂的生產方法，包括: (1)將經活化的蚜蟲擬酵母(Pseudozymaaphidis) DSMZ70725接入種子培養液中進行種子培養，培養后分離得到菌體細胞； (2)將菌體細胞接入發酵培養基中，于28~30°C條件下發酵培養7~15d，得到發酵液； (3)從發酵液中分離純化得到甘露糖赤蘚糖醇脂； 其中，所述的發酵培養基中含有植物油。
2.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟(1)中，以重量百分比計，所述的種子培養液包括以下成分:葡萄糖4.0~8.0%，硝酸鈉0.1~0.5%，硫酸鎂0.01~0.05%,磷酸二氫鉀0.01~0.05%，酵母粉0.1~1.0%。
3.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟(1)中，所述種子培養的培養溫度為28~30°C，培養時間為3~5d。
4.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟(2)中，以每升發酵培養基計，所述菌體細胞的接入量為10~100g。
5.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，所述的植物油為大豆油、橄欖油、菜籽油、葵花籽油、花生油、棉籽 油、米糠油、玉米胚芽油、油茶籽油、紅花籽油和小麥胚芽油中的至少一種。
6.根據權利要求5所述的生產方法，其特征在于，所述的植物油為大豆油、花生油和菜籽油的混合物。
7.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟(2)中，以重量百分比計，所述的發酵培養基包括以下成分:植物油4.0~12.0%，蛋白胨O~1.0%，硝酸鈉0.1~1.0%，硫酸鎂0.01~0.1%，磷酸二氫鉀0.01~0.1%，硫酸錳0.01~0.1%，硫酸銅0.01~0.1%，酵母粉0.1~1.0%。
8.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟(2)中，所述發酵培養的培養時間為10~15d。
9.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的發酵培養為搖床振蕩培養，搖床轉速為150~220rpm。
10.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的分離純化包括:將發酵液用有機溶劑萃取、分離2~3次，合并有機相，減壓濃縮除去有機溶劑，得到甘露糖赤蘚糖醇脂粗品；采用硅膠柱層析法對甘露糖赤蘚糖醇脂粗品進一步分離純化，先用正己烷洗脫，再用氯仿/甲醇進行梯度洗脫，得到甘露糖赤蘚糖醇脂。
【文檔編號】C12R1/645GK103589764SQ201310540906
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】陳啟和, 范琳琳, 董亞晨 申請人:浙江大學