一種鏈霉素發酵生產l-多巴黑色素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，采用鏈霉菌T2-10菌株進行生產，包括如下步驟：取鏈霉菌T2-10菌株接種于液體培養基中，27-31℃，250-290rpm振蕩培養24h制成種子液；按1％接種量將種子液接種于液體培養基中，27-31℃，250-290rpm振蕩培養72-96h制成發酵液；將發酵液于4℃下，8000rpm離心15min去掉菌體等不溶物后，發酵清液采用大孔吸附樹脂分離純化，并用甲醇洗脫，烘干后即得L-多巴黑色素結晶。本發明提供的方法易于操作，生產的L-多巴黑色素水溶解性和熱穩定性較好且其中L-多巴含量較高，在食品和醫療等方面具有重要的實用價值。
【專利說明】—種鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物及其應用領域，特別是涉及一種鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，本發明還涉及生產的L-多巴黑色素的理化性質。
【背景技術】
[0002]天然黑色素在動、植物及微生物中均可產生。而動、植物材料生長繁殖受季節、氣候、產地等因素的影響，提取的色素價格昂貴，應用受到局限。微生物如放線菌、真菌和細菌均可產黑色素。微生物所產黑色素一般是由體內的酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，再經一系列氧化過程而形成，屬于氨基酸的衍生物，且無毒、無害。
[0003]酪氨酸酶(EC1.14.18.1，Tyrosinase)，又被稱為多酚氧化酶，是一種含銅的金屬酶，主要參與L-多巴黑色素的合成過程:(I)催化L-酪氨酸羥基化轉變為L-多巴；(2)氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌經一系列反應后形成L-多巴黑色素。酪氨酸酶在生物體中具有重要的生理功能，是L-多巴黑色素生物合成途徑中的關鍵酶。L-多巴是一種重要的生物活性物質，可以通過血腦屏障，在腦組織中脫羧形成一種重要的神經遞質——多巴胺。因此L-多巴可研制成治療老年常見病一帕金森氏病以及其它疾病如肝昏迷、一氧化碳中毒、心力衰竭等的良藥。
[0004]放線菌是土壤中的優勢菌群，除極少數致病菌外，大多數放線菌具有重要的生物學意義。鏈霉菌是一種重要的次生代謝物產生菌種，利用鏈霉菌發酵生產L-多巴黑色素，具有周期短、成本低廉、生產工藝簡單，便于操作，適于工業化生產等優點。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在 于提供一種鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，本發明采用鏈霉菌(Str印tomycessp.) T2-10發酵生產L-多巴黑色素，還涉及所產L-多巴黑色素的理化性質。
[0006]本發明提供的技術方案為:
[0007]一種鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，采用鏈霉菌(Streptomycessp.)T2-10 (CGMCC N0.7449)菌株進行生產。
[0008]優選的是，所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法中，采用鏈霉菌(Streptomycessp.) T2-10 (CGMCC N0.7449)菌株進行生產還包括如下步驟:
[0009](I)種子液制備:
[0010]取所述鏈霉菌T2-10菌株接種于液體培養基中，27-3rC，250-290rpm振蕩培養24h制成種子液；
[0011]⑵發酵培養:
[0012]按1%接種量將所述種子液接種于所述液體培養基中，27-3rC，250-290rpm振蕩培養72-96h制成發酵液；
[0013](3) L-多巴黑色素的提取與純化:[0014]將所述發酵液于4°C下，SOOOrpm離心15min去掉菌體及其他不溶物后，發酵清液采用大孔吸附樹脂分離純化，并用甲醇洗脫，50-60°C烘干后即得L-多巴黑色素結晶。
[0015]優選的是，所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法中，所述液體培養基各組分的質量百分比為:燕麥粉1.0%，可溶性淀粉3.0%，豆柏粉0.3%，大米粉0.5%，葡萄糖
0.5%,酵母粉 0.2%,酵母膏 0.1%, KNO30.2%，K2HPO40.1 %，NaCl0.1 %，MgSO40.05%和CaCO30.3%。
[0016]優選的是，所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法中，所述種子液和發酵液的培養條件為29°C，260rpm振蕩培養。
[0017]優選的是，所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法中，所述大孔吸附樹脂型號為X-5，粒徑范圍0.3~1.25rmm。
[0018]優選的是，所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法中，所述烘干條件為60°C烘4h。
[0019]優選的是，所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法中，所述L-多巴黑色素水溶解性和熱穩定性較好且其中L-多巴含量較高。
[0020]本發明的有益效果:
[0021]本發明提供一種生產L-多巴黑色素的方法，本發明使用鏈霉菌T2-10產L-多巴黑色素，對該菌株的發酵條件進行優化，發酵生產的L-多巴黑色素水溶解性和熱穩定性較好且其中L-多巴的含量較高；并且其生產工藝簡單，操作方便；鏈霉菌T2-10發酵生產的L-多巴黑色素在食品、醫療和保健等方面具有重要的實用價值，并顯示出廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為發酵溫度對產L-多巴黑色素的影響圖；
[0023]圖2為轉速對產L-多巴黑色素的影響圖；
[0024]圖3為本發明所述生產L-多巴黑色素的流程圖；
[0025]圖4為本發明所述L-多巴黑色素OD4citol值與質量濃度的關系；
[0026]圖5為本發明所述L-多巴標準曲線圖；
[0027]圖6為本發明所述L-多巴黑色素的紫外-可見吸收光譜圖；
[0028]圖7為本發明所述L-多巴黑色素的紅外光譜圖；
[0029]圖8為本發明所述鏈霉菌T2-10發酵液中酪氨酸酶活性變化；
[0030]圖9為本發明所述鏈霉菌T2-10發酵液中OD4citol值的變化。
【具體實施方式】
[0031]下面結合具體實施例和附圖對本發明做進一步闡述，但本發明并不限于以下實施例。所述方法和試劑如無特別說明均為常規方法，所述原材料和設備如無特別說明均能從公開商業途徑而得。
[0032]本發明中用于生產L-多巴黑色素的鏈霉菌的分類命名為鏈霉菌(Streptomycessp.)T2-10,該菌株屬于放線菌株，已于2013年4月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7449。
[0033]本發明所述生產L-多巴黑色素的方法:[0034]I材料與方法
[0035]1.1液體培養基:燕麥粉10g，可溶性淀粉30g，豆柏粉3g，大米粉5g，葡萄糖5g，酵母粉 2g，酵母膏 lg，KN032g, K2HPO4Ig, NaCllg，MgSO40.5g 和 CaC033g，溶于蒸餾水中定容至1000mL后，，調節pH為7，112°C滅菌20min后備用。
[0036]1.2發酵條件確定:
[0037]發酵的溫度和轉速 會直接影響發酵產物的產量，因此需要尋找最適的產L-多巴黑色素的條件。
[0038]1.2.1發酵溫度篩選:
[0039]將鏈霉菌T2-10菌株接種于裝有50mL液體培養基(pH7.0)的250mL三角瓶中，于250rpm，分別放入27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 V振蕩培養培養96h后，離心取上清，測0D400nm值。結果如圖1所示，溫度明顯影響黑色素的產出，29°C時，黑色素產量最大。因此，29°C是本試驗發酵產L-多巴黑色素的最適溫度，并且從圖1中也可以看出在27-31°C范圍內，所述鏈霉菌T2-10都能發酵生產L-多巴黑色素。
[0040]1.2.2發酵轉速篩選:
[0041]將鏈霉菌T2-10菌株接種于裝有50mL液體培養基(pH7.0)的250mL三角瓶中，分別于250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm，29°C振蕩培養培養96h后，離心取上清，測OD4citol值。結果如圖2所示，轉速為260rpm時，產黑色素的濃度最大。因此，260rpm是本試驗發酵產L-多巴黑色素的最佳轉速，并且從圖2中也可以看出在250-290rpm范圍內，所述鏈霉菌T2-10都能發酵生產L-多巴黑色素。
[0042]1.3產L-多巴黑色素方法:
[0043]如圖3所示，有如下步驟:
[0044]1.3.1種子液制備:
[0045]取鏈霉菌T2-10菌株接種于裝有50mL液體培養基(pH7.0)的250mL三角瓶中，于260rpm, 29°C振蕩培養24h制成種子液；
[0046]1.3.2發酵培養:
[0047]取7mL種子液，接種于裝有200mL液體培養基(pH7.0)的1000mL三角瓶中，于260rpm, 29°C振蕩培養96h得到發酵液。
[0048]1.3.3L-多巴黑色素的提取與純化:
[0049]所述發酵液于溫度4°C，SOOOrpm離心15min，去掉菌體和其他不溶物；采用大孔吸附樹脂(型號X-5，粒徑范圍0.3~1.25mm)分離純化，并用甲醇洗脫；60°C烘干4h，即得純化的L-多巴黑色素結晶。
[0050]1.4L-多巴黑色素的理化性質研究
[0051]本發明所述鏈霉菌T2-10發酵液及不同L-多巴黑色素溶液中OD4citol值的測定:
[0052]如圖4所示，測定不同時期(0、24、48、72、96h)發酵液和不同L-多巴黑色素溶液中的OD4tltlnm值以反映L-多巴黑色素的質量濃度。
[0053]1.4.1 溶解性
[0054]取提純的L-多巴黑色素晶體分別溶解到pH值3、5、7、9的水及普通有機溶劑中，均按質量濃度為0.1mg.mL-1的量加入L-多巴黑色素，并充分振蕩；以不加L-多巴黑色素的溶劑作為空白對照，測定所有溶液的OD4citol值，結合溶液的顏色變化，比較L-多巴黑色素在不同溶液中的溶解性。
[0055]1.4.2熱穩定性[0056]將質量濃度為0.1mg.ml/1的L-多巴黑色素中性水溶液(pH值為7)置于60°C加熱24h后，快速冷卻至室溫，測定加熱前后OD4citol值的變化。
[0057]1.4.3抗氧化性
[0058]取0、0.5,1.0,1.5mL質量分數為10%的次氯酸鈉溶液，分別加入到IOmL質量濃度為0.1mg.mL-1ρΗ值為7的L-多巴黑色素中性水溶液中，反應10min后測定OD4tltlnm值。
[0059]1.4.4紫外-可見吸收光譜
[0060]將所產L-多巴黑色素配成濃度為0.1mg -mL-1的水溶液，以蒸餾水作空白對照，在190-600nm進行紫外-可見吸收光譜分析。
[0061]1.4.5紅外吸收光譜
[0062]將所產L-多巴黑色素按1:100比例加入KBr，混勻并壓片，在紅外光譜儀4000-400cm_1區間進行紅外掃描分析。
[0063]1.5鏈霉菌T2-10所產L-多巴黑色素中L-多巴含量的測定:
[0064]1.5.1鹽酸溶液配制:
[0065]取濃鹽酸9mL，加水適量使成1000mL,搖勻得鹽酸溶液。
[0066]1.5.2L-多巴標準液的配制及標準曲線繪制:
[0067]用鹽酸溶液配制成0.1mg.ml/1的L-多巴標準液，然后用鹽酸溶液稀釋成0.01、
0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg.πι?Λ測定OD280nm值，繪制L-多巴標準曲線，結果如圖5所
/Jn ο
[0068]1.5.3L-多巴黑色素溶液配制:
[0069]取L-多巴黑色素樣品，稱取0.lg，研細，置于IOOmL容量瓶中，加鹽酸溶液適量，充分振蕩使溶解，用鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得L-多巴黑色素溶液，測定OD28tol值，根據L-多巴標準曲線，計算L-多巴黑色素中L-多巴的含量。
[0070]1.6鏈霉菌T2-10發酵液中酪氨酸酶活性測定
[0071]在5mL試管中加入ImL L-多巴標準液及L 9mL0.1M的PBS緩沖液(pH值為6.8)，充分混勻，于30°C溫育IOmin后，分別加入0.1mL不同時期0、24h、48h、72h、96h的發酵液，立即充分混勻；以高溫滅活發酵液作為對照組，測定OD475nm值，通過OD475nm值隨時間的增長直線斜率求得酪氨酸酶活性(ε =3700cm^.moF1.L)。
[0072]2結果與分析
[0073]2.1L-多巴黑色素的理化性質
[0074]2.1.1 溶解性
[0075]如表1所示，本發明得到的所述L-多巴黑色素溶于中性(pH值為7)和弱堿性(pH值為9)水,其顏色為棕褐色,微溶于pH值小于5的酸性溶液；難溶于普通有機溶劑(如乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚)，但微溶于乙酸。本發明中所述L-多巴黑色素有較好的水溶解性和熱穩定性，可以更好地應用于飲料、糕點等食品及藥品行業。
[0076]表1所述L-多巴黑色素的溶解性[0077]
【權利要求】
1.一種鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，其特征在于，采用鏈霉菌(Streptomycessp.) T2-10 (CGMCC N0.7449)菌株進行生產。
2.如權利要求1所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，其特征在于，采用鏈霉菌(Str印tomycessp.)T2-10(CGMCC N0.7449)菌株進行生產還包括如下步驟: (1)種子液制備: 取所述鏈霉菌T2-10菌株接種于液體培養基(pH7.0)中，27-3rC，250-290rpm振蕩培養24h制成種子液； (2)發酵培養: 按I %接種量將所述種子液接種于所述液體培養基中，27-31°C，250-290rpm振蕩培養72-96h制成發酵液； (3)L-多巴黑色素的提取與純化: 將所述發酵液于4°C下，SOOOrpm離心15min去掉菌體及其他不溶物后，發酵清液采用大孔吸附樹脂分離純化，并用甲醇洗脫，50-60°C烘干后即得L-多巴黑色素結晶。
3.如權利要求2所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述液體培養基各組分的質量百分比為:燕麥粉1.0%，可溶性淀粉3.0 %，豆柏粉0.3 %，大米粉0.5%,葡萄糖 0.5 %，酵母粉 0.2%，酵母膏 0.1 %，KNO30.2 %，K2HPO40.1 %，NaCl0.1 %，MgSO40.05%和 CaCO30.3%。
4.如權利要求2所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述種子液和發酵液的培養條件為29°C，260rpm振蕩培養。
5.如權利要求2所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂型號為X-5，粒徑范圍0.3~1.25mm。
6.如權利要求2所述的鏈霉素發酵生產L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述烘干條件為60°C烘4h。
7.如權利要求2所述的鏈霉菌發酵生產L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述L-多巴黑色素水溶解性和熱穩定性較好且其中L-多巴含量較高。
【文檔編號】C12P1/04GK103540617SQ201310541008
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】唐選明, 丁洋, 李淑英, 聶瑩 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所