一種復合微生態飼料添加劑的制備及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及微生態飼料添加劑領域，具體涉及一種復合微生態飼料添加劑的制備及應用。本發明的微生態飼料添加劑由篩選到的活性復合益生菌組成，能夠預防和治療家畜細菌性感染引起的腹瀉。本發明所用的兩株益生菌具有抑制動物常見胃腸道致病菌包括痢疾桿菌、致病性大腸埃希菌、腸炎沙門菌感染的能力，而且還能夠降低痢疾桿菌感染Caco-2細胞引起的毒性、抑制痢疾桿菌對Caco-2細胞的粘附，最后達到刺激動物機體免疫力、提高動物胃腸道消化能力，促進動物生長的明顯效果。菌種的生產工藝采用液體發酵培養技術和低溫冷凍干燥技術，使所獲得菌劑存活率和純度都很高，是一種綠色環保型的飼料添加劑。
【專利說明】—種復合微生態飼料添加劑的制備及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生態飼料添加劑領域，該添加劑主要由篩選到的活性復合益生菌組成，能夠預防和治療家畜細菌性感染引起的腹瀉。
【背景技術】
[0002]數十年以來，國際上以抗生素、防腐劑為主的飼料藥物添加劑為畜牧、家禽、水產等養殖業生產帶來了很大的效益。然而，隨著這些化學藥品的廣泛應用，耐藥菌株的產生、抗生素在畜禽魚產品中的殘留及二重感染等問題受到國際社會的普遍關注與擔憂。許多國家已禁止或限制抗生素、防腐劑作為飼料添加劑的使用。因此，開發和推廣ー些既能有效替代抗生素和防腐剤，又能有效防病、保健、促生長的新型安全飼料添加劑已成為當務之急。
[0003]微生態制劑又稱微生態調節劑，是根據微生態學原理，利用對宿主有益的正常微生物或其促進物質制備成的制劑，具有維持或調整微生態平衡，防治疾病和增進宿主健康的作用。它能有效地克服抗生素和防腐劑所產生的各種副作用，且具有防病、增強動物機體免疫力和促生長的效果。許多中草藥及其成分具有提高免疫力的作用，與微生態制劑結合的生物制劑，又叫合生元(snbyioties),由Gibosnll首先提出，是微生態制劑的一個發展方向，也是現今研究的熱點。
【發明內容】
[0004]本發明從豬的健康糞便中篩選到了一株具有適應動物胃腸道微環境的丁酸梭菌，拉丁名:Clostridium butyricum.代號CPU-1 (簡稱CB),其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC N0.7281。保藏日:2013年3月6日。保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0005]本發明從豬的健康糞便中篩選到了一株具有適應動物胃腸道微環境的嗜酸乳桿菌，拉丁名:Lactobacillus acidophilus,代號CPU-2 (簡稱LA),其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC N0.7282。保藏日:2013年3月6日。保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0006]試驗證明，本發明的CPU-1和CPU-2具有抑制細菌性感染引起的腹瀉的功效，特別是痢疾桿菌(Shigella flexneri,簡稱 SF)、腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis,簡稱SE)、致病性大腸埃希菌(Enteropathogenic Escherichia coli,簡稱EPEC)等細菌性感染引起的腹瀉。并且將CPU-1和CPU-2聯合使用具有協同功效。將兩者組成復合益生菌，具有降低由痢疾桿菌引起的Caco-2細胞的細胞毒性并抑制其粘附細胞的能力。CPU-1和CPU-2優選的重量比例:1:10~10:1，更優選1:1。
[0007]將兩個菌株制備凍干菌粉有利于生產和制備。
[0008]丁酸梭菌CPU-1菌粉的制備:將丁酸梭菌CPU-1從甘油管接種到乳酸菌液體培養基(MRS)中，37°C恒溫靜置培養12h，得到活化的菌種。將種子液按5%的接種量接種到MRS培養基中37°C厭氧發酵即深層靜置培養24h，最后將獲得的發酵液于4°C 1000Orpm離心IOmin,收集菌體加入脫脂奶粉進行低溫冷凍干燥。所述乳酸菌液體培養基優選含如下成分:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸三銨2g/L，MgS040.58g/L，MnS040.25g/L，半胱氨酸鹽酸鹽 0.5g/L 和吐溫 801ml ；pH6.2-6.4，115。。滅菌30min。
[0009]嗜酸乳桿菌CPU-2菌粉的制備:將嗜酸乳桿菌CPU-2從甘油管接種到乳酸菌液體培養基(MRS)中，37°C恒溫靜置培養12h，得到活化的菌種。將種子液按5%的接種量接種到MRS發酵培養基中37°C厭氧發酵24h，將獲得的發酵液于4°C 1000Orpm離心lOmin，收集菌體加入脫脂奶粉進行低溫冷凍干燥。[0010]試驗發現，上述復合益生菌與野生植物牛至草粉聯合使用效果更佳，比較優選的配比是:復合益生菌:野生植物牛至草粉重量配比為1:10~~10:1，更優選7:3。
[0011]牛至草粉可用下列方法制備:將新鮮的牛至草葉置烘箱中，于60°C烘干48h，然后用小型中藥粉碎機粉碎后過40目篩，得到牛至草粉。
[0012]在使用中還可以添加淀粉、果聚糖等輔料混合均勻后制成復合微生態飼料添加劑。
[0013]CPU-1和CPU-2的兩個菌株的分離純化方法詳細描述于實施例中。
[0014]本發明提供了該微生態添加劑在斷奶仔豬細菌性腹瀉的應用試驗，相對于傳統的抗生素治療方式具有以下優勢:該添加劑為綠色生態飼料添加劑對家畜無任何毒副作用，無抗生素殘留。對于常見的胃腸道致病菌具有與抗生素不相上下的抗菌活性，同時有利于其他胃腸道共生菌群的生長；該添加劑所用菌株能夠在胃腸道內高效粘附，適應動物胃腸道微環境，所分泌產生的乳酸及酪酸等能夠提高胃腸道內蛋白酶、淀粉酶的活性，提高飼料轉化率，降低胃腸道內毒性物質的產生。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是丁酸梭菌CPU-1形態圖:A平皿菌落圖；B菌體顯微照片(400 X )
[0016]圖2是嗜酸乳桿菌CPU-2形態圖:A平皿菌落圖；B菌體顯微照片(400 X )
[0017]圖3是丁酸梭菌CPU-1與嗜酸乳桿菌CPU-2的不同配比對痢疾桿菌的抑制作用
[0018]圖4是丁酸梭菌CPU-1與嗜酸乳桿菌CPU-2對痢疾桿菌體外協同抑制作用
[0019]圖5是丁酸梭菌CPU-1與嗜酸乳桿菌CPU-2對致病性大腸埃希菌體外協同抑制作用
[0020]圖6是丁酸梭菌CPU-1與嗜酸乳桿菌CPU-2對腸炎沙門菌體外協同抑制作用
[0021]圖7是丁酸梭菌CPU-1與嗜酸乳桿菌CPU-2對由痢疾桿菌引起的Caco-2細胞毒性的影響
[0022]圖8是丁酸梭菌CPU-1與嗜酸乳桿菌CPU-2對痢疾桿菌的Caco-2細胞粘附性的影響
[0023]圖9是斷奶仔豬腹瀉率測定
【具體實施方式】
[0024]實施例1
[0025]丁酸梭菌CPU-1的分離純化及生理生化鑒定[0026]1、丁酸梭菌CPU-1分離純化
[0027](I)取新鮮的豬的糞便Ig溶于9ml生理鹽水中，放入80°C水浴lOmin，殺死非芽孢菌，然后放入增殖培養基，于37°C培養36h。
[0028](2)將上述培養液置80°C水浴lOmin，轉入菌種梭菌選擇性培養基，其成分為:胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉10g/L，亞硫酸鈉lg/L，枸櫞酸鐵0.5g/L，新生霉素0.02g/L，多粘菌素0.05g/L, pH7.2，121°C滅菌20min，37°C厭氧選擇性富集培養48h。
[0029](3)將樣品分別從KT1到10_7倍比稀釋，涂布于GAM培養基平板上，其培養基組成成分為:月示胨15g/L，胰酪蛋白胨10g/L，大豆胨3g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉粉2g/L，消化血清粉13.5g/L，牛肝浸粉1.2g/L，葡萄糖3g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，氯化鈉3g/L，可溶性淀粉0.3g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，硫こ醇酸鈉0.15g/L，瓊脂粉20g/L，pH7.2，115°C滅菌30min。放入7.5L裝有厭氧產氣袋厭氧盒中，37°C厭氧培養36~48h。
[0030](4)采用影印平板法分離菌種，分別進行好氧和厭氧培養，選取厭氧生長良好的菌株，鏡檢。
[0031]2、丁酸梭菌CPU-1的生理生化鑒定
[0032]菌體形態特征見圖1:丁酸梭菌菌株是典型的厭氧菌，直或微彎的桿菌，產芽孢，孢子卵圓，偏心到次端生，無孢子外壁和附屬絲，端圓，單個或成對，短鏈，偶見長絲狀菌體，以周生鞭毛運動，革蘭氏陽性菌。
[0033]以模式菌株枯草 芽孢桿菌為對照，考察丁酸梭菌CPU-1的生理生化特征，為其菌種鑒定提供依據。按《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《細菌屬的鑒定指導》對分離到的純菌株進行屬的相關試驗，以及群、種的相關生理生化實驗，分別包括:明膠液化試驗、蜜二糖、松三糖、淀粉水解試驗。
[0034]表1 丁酸梭菌菌株CPU-1的生理生化特征
[0035]
測試項目il
淀粉水解+
明膠液化一
葡萄糖利用+
阿拉伯糖利用+
甘露醇利用+
蜜二糖+
松二糖+
果糖+
石蕊牛奶+
[0036]注:“ + ”表示陽性反應或能利用；“一”表示陰性反應或不能利用。
[0037]參照伯杰氏細菌鑒定手冊第九版的分類鑒定，該菌株是丁酸梭菌，其培養特征和個體形態特征見圖1。
[0038]實施例2
[0039]嗜酸乳桿菌CPU-2的分離純化及生理生化鑒定
[0040]嗜酸乳桿菌CPU-2的分離純化方法參見丁酸梭菌的分離純化，選擇培養基為加有3%CaC03的MRS培養基；嗜酸乳桿菌菌體形態特征見圖2，嗜酸乳桿菌為兼性厭氧菌，革蘭氏染色為陽性、兩端鈍圓、中等大小、無芽孢、不運動的桿菌，以單個、成雙或短鏈狀出現。
[0041]表2嗜酸乳桿菌的生理生化特征
[0042]
【權利要求】
1.ー種丁酸梭菌，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物生物中心的保藏號為:CGMCC N0.7281。
2.一種嗜酸乳桿菌，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物生物中心的保藏號為:CGMCC N0.7282。
3.一種復合微生態制劑飼料添加劑，其活性成分由權利要求1的丁酸梭菌和權利要求2的嗜酸乳桿菌組成。
4.權利要求3的復合微生態制劑飼料添加劑，其中權利要求1的丁酸梭菌和權利要求2的嗜酸乳桿菌的重量比為1:10~~10:1。
5.權利要求4的復合微生態制劑飼料添加劑，其中權利要求1的丁酸梭菌和權利要求2的嗜酸乳桿菌的重量比為1:4~~4:1。
6.權利要求5的復合微生態制劑飼料添加劑，其中權利要求1的丁酸梭菌和權利要求2的嗜酸乳桿菌的重量比為1:1。
7.權利要求3的復合微生態飼料添加剤，還含有牛至草粉。
8.權利要求3或7的復合微生態飼料添加劑用于制備治療家畜細菌性感染引起的腹瀉的藥物的用途。
9.權利要求8的 用途，其中細菌性感染是痢疾桿菌、致病性大腸埃希菌或腸炎沙門菌引起的感染。
【文檔編號】C12R1/23GK103602614SQ201310557533
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】周長林, 賈源賓, 方凱, 葛洪, 王藝宙 申請人:南京曜動節能環保科技有限公司