miR-218模擬物、其應用以及一種篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法
【專利摘要】一種篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，步驟包括：利用定量PCR法檢測待篩選藥物對Bmi1轉錄水平的抑制作用；將待篩選藥物轉染膠質瘤細胞后利用Trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，定量PCR法檢測Bmi1轉錄水平；利用劃痕法對膠質瘤細胞的遷移進行檢測；利用transwell法對膠質瘤細胞的侵襲進行檢測。本發明工藝簡單，成本低，能夠有效的篩選出對膠質瘤細胞的遷移和侵襲活性具有抑制作用的藥物。本發明還公開了一種RNA分子miR-218模擬物及其在抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物中的應用。
【專利說明】mi R-218模擬物、其應用以及一種篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術的應用領域,特別涉及一種miRNA的應用。
【背景技術】
[0002]膠質瘤是臨床上最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，約占所有原發性顱內腫瘤的45%左右。按膠質瘤的惡性程度分為I 一 IV級，級別愈高，其惡性程度愈大。在所有膠質瘤病人中，25%~50%的為II級；50%~75%的為III級；75%~100%為IV級。惡性度高者瘤內常有壞死與出血，血管豐富，血管外層及內皮細胞均有明顯增生，除手術切除外，膠質瘤的藥物療效和放療效果都不甚理想，因此膠質瘤是療效最差的惡性腫瘤之一，據統計，膠質瘤病人的一年總生存率低于30%，級別高的病人中位生存期只有大概15個月。膠質瘤預后差的一個主要原因為膠質瘤的高度侵襲能力，惡性程度高的膠質瘤呈浸潤性生長，腫瘤成份與正常腦組織的分界模糊，手術往往不能將腫瘤組織完整切除，術后膠質瘤的復發率較高。復發的膠質瘤中，超過90%起源于手術區的浸潤瘤細胞或手術區邊緣的癌細胞。理解膠質瘤的遷移機制，尋找和發現新的膠質瘤發生、發展和預后密切相關的基因和信號途徑對于膠質瘤的分子干預具有重要的意義。
[0003]原癌基因Bmil (B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertionsitel)是在1991年首次被報道，屬于多梳基因家族(Polycomb Group genes, PcG)成員，是與細胞周期轉換和細胞增殖相關的重要轉錄抑制因子，直接參與細胞生長、增殖的調節，Bmil基因在多種惡性腫瘤如膠質瘤、肺癌、白血病、前列腺癌、結腸癌、乳腺癌等中大量表達，并且與這些腫瘤的侵襲、轉移、預后密切相關。INK4a/ARF是Bmil基因調節細胞增殖和老化的靶點，在Bmil缺陷的小鼠成纖維細胞(MEF)和淋巴細胞中，INK4a/ARF表達水平明顯升高，相反，Bmil過度表達的MEF細胞中INK4a/ARF蛋白下調，細胞可發生永生化，所以Bmil通過抑制INK4a/ARF基因的表達來維持細胞的自我更新。Bmil在人膠質瘤細胞中高表達，并且敲除Bmil的膠質瘤細胞在體成瘤能力減弱。
[0004]MicroRNA (miR,也稱miRNA)是一類長度為20-25核苷酸的非編碼的單鏈RNA，是由具有發夾結構的約70-90個核苷酸大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，通過與mRNA互補結合在轉錄后水平抑制靶基因的表達，參與調控心臟疾病、血管疾病、神經和腫瘤等多種疾病的發生和發展過程。腫瘤的侵襲性是區別惡性腫瘤和良性腫瘤的重要生物學特征，也是目前惡性 腫瘤難以治愈最終導致死亡的重要原因，因此研究腫瘤侵襲的調控機制一直是腫瘤領域的主要方向。但是腫瘤的侵襲是一個多基因參與的復雜調控過程，所以能夠同時調控多個靶基因表達的mircoRNA自從發現之日起就成為了腫瘤發生和侵襲過程中研究熱點。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的篩選方法，該方法工藝簡單，成本低，應用該方法成功篩選并驗證了 miR-218模擬物具有抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲的效果，從而達到抑制膠質瘤的目的。
[0006]本發明的第一方面，涉及一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含miR-218核酸序列“莖-環”結構的發夾狀結構，主序列如下:5’ -UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’ (SEQID N0.3)。
[0007]本發明的第二方面，涉及根據本發明第一方面的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物中的應用。
[0008]本發明的第三方面，涉及一種篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括:
[0009](1)利用定量PCR法檢測待篩選藥物對Bmi 1轉錄水平的抑制作用；
[0010]將待篩選藥物轉染膠質瘤細胞后利用trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,定量PCR法檢測Bmil轉錄水平。
[0011]擴增Bmil的引物如下:
[0012]Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG (SEQ ID N0.1)，
[0013]Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC (SEQ ID N0.2)；[0014](2)利用劃痕法對膠質瘤細胞的遷移進行檢測；
[0015](3)利用transwell法對膠質瘤細胞的侵襲進行檢測。
[0016]優選地，所述步驟(1)中定量PCR體系為:10μ 1的Premix Ex Taq (SYBR qPCR)(2X)，10ymol/L的Bmil上下游上下游引物各0.5μ 1，待檢cDNA模板或陰性對照1μ 1，加滅菌去離子水補足體積至20 μ 1。
[0017]優選地，步驟(1)中PCR反應條件為:95°C預變性30s ;然后95。。15s，60°C 20s，72°C 20s，反應40個循環。
[0018]步驟(2)中采用“劃痕法”對膠質瘤細胞的遷移進行檢測的步驟為，用待篩選藥物轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液繼續培養細胞12h對其進行饑餓干預。用滅菌槍頭勻速勻力的向一個方向劃單層膠質瘤細胞，每孔平行的劃1次，形成1條無細胞劃痕區。PBS清洗細胞2次，加入無血清的膠質瘤細胞培養液。在0小時，12小時和24小時顯微鏡下觀察劃痕兩側的距離變化并計算刺激前后劃痕兩側的距離。
[0019]步驟(3)中，利用transwell法對膠質瘤細胞的侵襲進行檢測的步驟為，待篩選藥物轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液稀釋，種5X 105個細胞在transwell小室中，外面加入膠質瘤細胞培養液，培養48小時后，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞，用甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機數10個視野中的細胞數目，判斷帶篩選藥物能否抑制膠質瘤細胞侵襲。
[0020]進一步地，上述篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，在步驟(1)之前還包括步驟:構建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut重組質粒，兩種質粒分別與待篩選藥物共轉染工具細胞293T細胞株。
[0021]重組質粒pmirGL0-Bmil3’ -UTR的構建方法為:根據NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218結合位點的長度為390bp的3’_UTR序列，兩端含有的酶切位點為Sac I, Xbal,利用這兩位點連接入pmirGLODual-Luciferase miRNA TargetExpression Vector 載體(promega)。插入序列如下:[0022]>Bmil-wt
[0023]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGAAGCACAATTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAAAAGCACAATGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.4)
[0024]重組質粒pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut的構建方法為:根據NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218結合位點突變的長度為390bp的3‘_UTR序列，具體突變是將pmirGL0-Bmil3’-UTR中的兩處長度為8bp的序列:AAGCACAA替換為TTTGTGTT。兩端含有的酶切位點為Sac I, Xbal,利用這兩位點連接入pmirGLO Dual-Luciferase miRNATarget Expression Vector 載體(promega)。插入序列如下:
[0025]>Bmil_mut
[0026]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGTTTGTGTTTTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAATTTGTGTTTGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.5)
[0027]重組質粒圖譜如圖1所示。
[0028] 進一步地，上述篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，在步驟(1)之后，還包括步驟:利用Western blot法檢測待篩選藥物對Bmil蛋白表達的抑制作用。具體步驟為:
[0029]按每孔50 μ g蛋白上樣量等量上樣。以400mA恒壓轉膜lOOrnin。將膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后的Bmil抗體(Cell SignalingTechnology)或對照 a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗體一抗(Bmil 抗體按 2:1000稀釋，抗a-tubulin抗體按1:2000稀釋)，4°C振蕩孵育過夜。吸凈一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀釋后的二抗(均為1:4000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆蓋濕潤NC膜表面，靜置lmin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數據。
[0030]有益效果
[0031]本發明工藝簡單，成本低，能夠有效篩選出可以抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲活性的藥物，同時為膠質瘤的防治提供有效干預靶點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為重組質粒圖譜；
[0033]圖2為計算機軟件分析顯示Bmil的3’非翻譯區存在兩個miR-218的作用靶點；
[0034]圖3顯示了 miR-218模擬物能夠抑制攜帶Bmil靶序列熒光素酶的相對活性；
[0035]圖4顯示了 miR-218模擬物能夠抑制Bmil在轉錄水平的表達；[0036]圖5顯示了 miR-218模擬物能夠抑制Bmil在蛋白質水平的表達；
[0037]圖6顯示了 miR-218模擬物有效減少膠質瘤細胞的遷移；
[0038]圖7顯示了 miR-218模擬物有效減少膠質瘤細胞的侵襲。
[0039]本發明中所述生化試劑及生物材料均可從市售渠道獲得，比如工具細胞293T細胞株可以通過上海拜力生物科技有限公司購買獲得，膠質瘤細胞(U251)購自中國科學院細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，Bmil抗體購自Cell SignalingTechnology)公司。
【具體實施方式】
[0040]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0041]實施例1
[0042]1.miR-218靶基因的篩選
[0043]運用PicTar、TargetScan等軟件檢索miR-218可能的祀基因，發現Bmil基因的3’非翻譯區(3’ UTR)含有2個miR-218的靶位點(附圖2)。因此miR-218類似序列可能具有抑制原癌基因Bmil表達的功能。
[0044]2.報告基因驗證Bmil是miR-218的靶基因
[0045]構建pmirGL0_Bmil3’ -UTR 和 pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut 重組質粒
[0046]構建方法:人工合成了含有miR-218結合位點的Bmi 13 ’ -UTR的長度為390bp的序列，通過限制性內切酶Sac I, Xbal連接入相同酶切的pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression Vector 載體中即獲得 pmirGL0_Bmil3’ -UTR 載體。將pmirGL0-Bmil3’ -UTR兩處長度為8bp的序列:AAGCACAA替換為TTTGTGTT就構建成pmirGL0_Bmil3，-UTR - mut 載體。
[0047]pmirGL0-Bmil3’ -UTR載體中將含有可以與miR-218結合的位點Bmil3’ -UTR序列與螢火蟲熒光素酶基因融合，使轉錄出來的螢火蟲熒光素酶3’ -UTR含有miR-218的結合位點，這樣在和miR-218共轉染的時候，miR-218將會通過與結合位點的結合在轉錄后水平抑制螢火蟲熒光素酶的表達。在pmirGL0-Bmil3’ -UTR - mut載體中miR-218結合位點被突變掉，所以與miR-218共轉染的時候不會影響螢火蟲熒光素酶的表達。載體中海參熒光素酶作為內參，測定螢火蟲熒光素酶與海參熒光素酶的活性比值就可以確定系統中螢火蟲熒光素酶的含量，進而判斷出預測的miR-218結合位點是否真的和miR-218結合。具體方法:將 pmirG LO 空載體,pmirGL0-Bmil3’ -UTR 載體與 pmirGL0_Bmil3’ -UTR - mut 分別與miR-218模擬物共轉染工具細胞293T，轉染24h后用專用裂解液裂解細胞，每孔100 μ 1，打均勻，充分裂解后樣品備用。采用Promega公司的熒光素酶檢測試劑盒，在1.5ml離心管中加入LARII50 μ 1和裂解液5 μ 1混勻，酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶；加入50 μ 1 Stop&Glo溶液滅活螢火蟲熒光素酶，酶標儀檢測海參熒光素酶，計算螢火蟲熒光素酶與海參熒光素酶的比值。結果顯示，轉染miR-218的模擬物后熒光素的表達下降了約50%左右，而突變與miR-218的模擬物結合位點以后螢火蟲熒光素酶的表達恢復(見附圖3)，證明Bmil是miR-218的直接靶基因。
[0048]3.利用定量PCR法和Western blot法檢測miR-218模擬物對Bmil轉錄水平和蛋白表達的抑制作用
[0049]miR-218模擬物或miR-對照轉染膠質瘤細胞72小時后利用trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA ;定量PCR體系為:10 μ 1的Premix Ex Taq(SYBR qPCR) (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待檢cDNA模板或陰性對照1 μ 1，加滅菌去離子水補足體積至20 μ KPCR反應條件為:95°C預變性30s ;然后95°C 15s,60°C 20s,72°C 20s，反應40個循環。發現增加了 miR-218模擬物在膠質瘤細胞的表達量后，Bmil轉錄水平的表達量明顯下降。
[0050]miR-218模擬物或miR-對照轉染膠質瘤細胞72小時后，收集細胞蛋白樣品進行電泳。電泳時，按每孔50 μ g蛋白上樣量等量上樣。以400mA恒壓轉膜lOOmin。將膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后的Bmil抗體(Cell SignalingTechnology)或對照 a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗體一抗(Bmil 抗體按 2:1000稀釋，抗α-tubulin抗體按1:2000稀釋)，4°C振蕩孵育過夜。吸凈一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀釋后的二抗(均為1:4000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆蓋濕潤NC膜表面，靜置lmin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數據。結果可見，增加了miR-218模擬物在膠質瘤細胞的表達量后，Bmil蛋白的表達量明顯下降。(見附圖5) [0051]4.膠質瘤細胞的遷移實驗
[0052]采用“劃痕法”對膠質瘤細胞的遷移活性進行研究。miR-218模擬物或miR-對照轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液繼續培養細胞12h對其進行饑餓干預。此時細胞應布滿培養板底，形成單層細胞。用200 μ 1滅菌槍頭勻速勻力的向一個方向劃單層膠質瘤細胞，每孔平行的劃1次，形成1條無細胞劃痕區。PBS清洗細胞2次，加入無血清的膠質瘤細胞培養。在顯微鏡下用記號筆在培養板底部為細胞劃痕邊緣做記號并拍攝照片。在0小時，12小時和24小時鏡下觀察劃痕兩側的距離變化并拍照。用Image-proplus6.0軟件計算刺激前后劃痕兩側的距離。結果發現，轉染miR-對照的膠質瘤細胞遷移活性大大增加，劃痕愈合為12小時是25.1%, 24小時為43.2%。而運用miR-218模擬物增加膠質瘤細胞miR-218的表達量能夠明顯抑制膠質瘤細胞向劃痕區的遷移，劃痕愈合率為12小時是19.2%24小時為34.2%(見附圖6)。
[0053]5.膠質瘤細胞的侵襲實驗
[0054]利用transwell法對膠質瘤的侵襲活性進行研究。miR-218模擬物或miR-對照轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液稀釋，種5X 105個細胞在transwell小室中，外面加入膠質瘤細胞培養液，培養48小時后，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞，用100%甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機數10個視野中的細胞數目，發現運用miR-218模擬物增加膠質瘤細胞miR-218的表達量能夠明顯抑制膠質瘤細胞侵襲(見附圖7)。
[0055]以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術領域】中技術人員依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術 方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含如下序列:5，-U腳GCUUGAUCUAACCA腳-3'
2.如權利要求1所述的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物中的應用。
3.一種篩選能夠抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括:(1)利用定量PCR法檢測待篩選藥物對Bmil轉錄水平的抑制作用；將待篩選藥物轉染膠質瘤細胞后利用Trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，定量PCR法檢測Bmil轉錄水平。擴增Bmil的引物如下:Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG,Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC ；(2)利用劃痕法對膠質瘤細胞的遷移進行檢測；(3)利用transwell法對膠質瘤細胞的侵襲進行檢測。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述步驟(1)中的定量PCR體系為:10μ1的PremixEx Taq (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待檢cDNA模板或陰性對照1 μ 1，加滅菌去離子水補足體積至20 μ 1。
5.如權利要求4所述的方法，其中，所述步驟(1)中的PCR反應條件為:95°C預變性30s ;然后 95°C 15s，60°C 20s，7`2°C 20s，反應 40 個循環。
6.如權利要求3所述的方法，其中，步驟(2)中采用“劃痕法”對膠質瘤細胞的遷移進行檢測的步驟為，用待篩選藥物轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液繼續培養細胞12h對其進行饑餓干預。用滅菌槍頭勻速勻力的向一個方向劃單層膠質瘤細胞,每孔平行的劃1次，形成1條無細胞劃痕區。PBS清洗細胞2次，加入無血清的膠質瘤細胞培養液。在0小時，12小時和24小時顯微鏡下觀察劃痕兩側的距離變化并計算刺激前后劃痕兩側的距離。
7.如權利要求3所述的方法，其中，步驟(3)中，利用transwell法對膠質瘤細胞的侵襲進行檢測的步驟為，待篩選藥物轉染膠質瘤細胞48小時后換無血清的膠質瘤細胞培養液稀釋，種5X105個細胞在transwell小室中，外面加入膠質瘤細胞培養液，培養48小時后，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞，用甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機數10個視野中的細胞數目，判斷帶篩選藥物能否抑制膠質瘤細胞侵襲。
8.如權利要求3所述的方法，其中，在步驟(1)之前還包括步驟:構建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0-Bmil3’ -UTR-mut重組質粒，兩種質粒分別與待篩選藥物共轉染工具細胞293T細胞株。
9.如權利要求3所述的方法,其中，在步驟(1)之后,還包括步驟:利用Westernblot法檢測待篩選藥物對Bmil蛋白表達的抑制作用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740809SQ201310567075
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】金衛林, 高興春, 涂艷陽, 崔大祥 申請人:上海交通大學