利用秸稈水解液發酵生產二十二碳六烯酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用秸稈水解液發酵生產二十二碳六烯酸的方法。該方法包括如下步驟：（1）利用氨氣爆破法預處理秸稈粉，得到預處理后的秸稈粉；（2）用纖維素酶、β-半乳糖苷酶和果膠酶酶解所述預處理后的秸稈粉，得到秸稈水解液；（3）向所述秸稈水解液中加入培養基，然后接入裂殖壺菌（Aurantiochytrium）進行發酵培養，獲得裂殖壺菌發酵液；（4）用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發酵液，得到提取液；所述提取液經干燥即得二十二碳六烯酸。本發明制備的DHA產量穩定，在不添加外源葡萄糖情況下，采用本發明獲得的菌體干重可達58～66g/L，油脂占細胞干重的40.8～53.3%，DHA占油脂干重的42.1～45.3%，DHA產量為10.3～15.4g/L。
【專利說明】利用秸稈水解液發酵生產二十二碳六烯酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用秸桿水解液發酵生產二十二碳六烯酸的方法。
【背景技術】
[0002]二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,簡稱DHA)是人體必需的一種長鏈高度不飽和脂肪酸，具有顯著的抗心血管疾病、降血脂、降血壓、預防各種癌癥、促進嬰幼兒智力發育，改善成年人的大腦機能和防止老年癡呆等重要生理功能，已被開發成各種藥品、保健品、高級化妝品、食品及飼料等，市場巨大。DHA的傳統資源是深海魚油，但是由于過度開發捕撈深海魚類，魚油資源難以滿足人們對DHA日益增長的需求。近年來，利用微生物發酵法生產富含DHA的油脂成為熱點。海洋真菌一裂殖壺菌不僅像細菌一樣二分裂繁殖，生長速度快，而且其油脂含量高，提取簡單，極具有產業開發前途。國內外許多機構正在或已經申請裂殖壺菌發酵生產DHA的相關專利:申請號為201010104774.0的專利公布了利用豆柏水解物生產裂殖壺菌菌體的工藝，其所使用的碳源為葡萄糖70~80g/L ；申請號為200910130628.2的專利公布了利用高密度培養裂殖壺菌發酵生產DHA的工藝，所使用的培養基碳源為葡萄糖120~125g/L ;申請號為201010150460.4的專利公布了全合成培養基用于培養裂殖壺菌的方法，所使用的培養基碳源為葡萄糖60~150g/L ；申請號為201010237946.1的專利公布了以裂殖壺菌為生產菌株發酵生產多烯不飽和脂肪酸的方法，其特征是在發酵培養基中添加甘氨酸甜菜堿或海藻糖以提高油脂含量。上述申請并公開的專利，主要以裂殖壺菌利用葡萄糖或淀粉質原料發酵生產DHA，而利用廉價碳源，如木質纖維素水解物生產DHA的方法尚未見報道。
[0003]秸桿是農村常見的木質纖維素原料，目前我國農村對秸桿的常見處理方式有焚燒、堆肥、還田、制作簡易材料等方式，利用率低且不利于工業化推廣。此外，秸桿資源的綜合利用方法還有直接發酵生產沼氣、發酵生產燃料乙醇、乳酸等，但附加值較低，無法真正實現秸桿資源的高效綜合利用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種利用秸桿水解液發酵生產二十二碳六烯酸的方法，本發明利用廉價的秸桿木質纖維素為原料，經水解得到水溶性碳水化合物，經裂殖壺菌轉化獲取DHA，將顯著降低DHA的生產成本，形成節約耕地、可連續生產DHA的工藝，并且還有利于環境保護和社會經濟可持續發展。
[0005]本發明所提供的一種利用秸桿水解液發酵生產二十二碳六烯酸的方法，包括如下步驟:
[0006](I)利用氨氣爆破法預處理秸桿粉，得到預處理后的秸桿粉；
[0007](2)用纖維素酶、P -半乳糖苷酶和果膠酶酶解所述預處理后的秸桿粉，得到秸桿水解液；
[0008](3)向所述稻桿水解液中加入培養基,然后接入裂殖壺菌(Aurantiochytrium)進行發酵培養，獲得裂殖壺菌發酵液；
[0009](4)用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發酵液，得到提取液；所述提取液經干燥即得二十二碳六烯酸。
[0010]上述的方法中，步驟(1)中，所述秸桿粉由玉米秸桿、水稻秸桿、甘蔗秸桿、小麥秸桿、棉花秸桿和高粱秸桿中至少一種制成；
[0011 ] 所述秸桿粉的粒徑小于5mm ；
[0012]在制備所述秸桿粉之前，最好將秸桿進行干燥，如可在鼓風烘箱中于80°C下干燥約2天。
[0013]上述的方法中，步驟(1)中，所述氨氣爆破法包括如下步驟:
[0014]將所述秸桿粉調控至質量含水量為40%~60%，具體可為40%、45%、50%、55%或60%,然后加入高壓反應器中；然后利用氨氣在3.0~4.0MPa下處理所述秸桿粉，可采用夾套蒸汽加熱的方式進行，具體可在3.0MPa, 3.5MPa或4.0MPa下進行；
[0015]上述的方法中，步驟(1)中，所述處理的溫度可為80°C~100°C，具體可為80°C、90。。、95。。或100°C，時間可為30~60分鐘，具體可為30分鐘、45分鐘或60分鐘；
[0016]所述預處理后的秸桿粉的質量含水量可為60%~70%，具體可為60%、65%或70% ；
[0017]所述處理結束 后，即可打開放氣閥，讓高壓反應器中的壓力聚降；將所述預處理后的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發，存于4°C保存，用于下一步的反應。
[0018]上述的方法中，步驟(2)中，所述纖維素酶、半乳糖苷酶和果膠酶酶解的用量可為=IKg所述預處理后的秸桿粉需要加入125000~225000CMC U所述纖維素酶、32500~58500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550~3100U所述果膠酶，如IKg所述預處理后的秸桿粉加入125000CMC U所述纖維素酶、32500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550U所述果膠酶、175000CMC U所述纖維素酶、45500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和2325U所述果膠酶、225000CMC U所述纖維素酶、58500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和2325U所述果膠酶、150000CMC U所述纖維素酶、39000pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550U所述果膠酶或150000CMC U所述纖維素酶、39000pNPG U所述β -半乳糖苷酶和3100U所述果膠酶；具體可米用加入Accellerasel500和Multifect pectinase的方式進行酶解；
[0019]酶活單位的定義:1CMC U纖維素酶活為在50°C、pH為4.8的條件下，I分鐘水解羧甲基纖維素生成Iymol葡萄糖等量物所需的酶量；IpNPG U β -半乳糖苷酶活為在50°C、pH為4.8的條件下，I分鐘水解對硝基酚-β -葡萄糖苷生成I μ mo I對硝基酚所需的酶量;1U果膠酶活為在50°C、pH為4.3的條件下，I分鐘分解果膠產生I μ mol葡萄糖等量物所需的酶量。
[0020]上述的方法中，所述酶解的條件如下:
[0021]在pH為4.0~5.5和溫度為50°C~55°C的條件下處理6~7天，具體可在pH為
4.0和溫度為50°C的條件下處理7天、pH為4.5和溫度為55°C的條件下處理6天、在pH為
5.0和溫度為50°C的條件下處理7天、在pH為5.0和溫度為55°C的條件下處理6天、在pH為5.5和溫度為55°C的條件下處理7天或在pH為5.0和溫度為50°C的條件下處理6天。
[0022]上述的方法中，步驟(3)中，每IOOmL所述培養基的組成如下:
[0023]1.0~2.0g蛋白胨；L O~2.0g酵母浸出粉；2.0~3.0g海水晶；0.04~0.06gKH2PO4 ；0.02 ~0.03g (NH4)2SO4 ；0.2 ~0.4g Na2SO4 ;和余量的水；[0024]每IOOmL所述培養基的組成具體可為下述任一種:
[0025]I) 1.0~1.8g蛋白胨；1.0~1.8g酵母浸出粉；2.0~2.5g海水晶；()? 04~0.06gKH2P04 ；0.02 ~0.03g (NH4)2SO4 ；0.2 ~0.4g Na2SO4 ;和余量的水；
[0026]2) 1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.02g(NH4)2SO4 ；0.2g Na2SO4 ;和余量的水；
[0027]3) 1.5g 蛋白胨；1.5g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；0.4g Na2SO4 ;和余量的水；
[0028]4) 2.0g 蛋白胨；2.0g 酵母浸出粉；3.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；0.3g Na2SO4 ;和余量的水；
[0029]5) 1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；
0.4g Na2SO4 ;和余量的水；
[0030]6) 1.8g 蛋白胨；1.8g 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g(NH4)2SO4 ；
0.4g Na2SO4 ;和余量的水。
[0031]上述的方法中，步驟(3)中，所述裂殖壺菌(Aurantiochytrium)接入的初始濃度為每IOOmL所述培養基接入10~12mL所述裂殖壺菌菌種。
[0032]上述的方法 中，步驟(3)中，所述發酵培養的條件如下:
[0033]在所述發酵培養開始至75~85小時內，控制所述發酵培養的溫度為27.5~28.5°C，繼續發酵培養至85~95小時內，控制所述發酵培養的溫度為24.5~25.5°C ;繼續培養至發酵結束，控制所述發酵培養的溫度為19.5~20.50C ；
[0034]且在所述發酵培養開始至55~65小時內，通過補加氨水以維持體系pH為5.8~
6.2，繼續發酵培養至95~105小時內，通過補加所述秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時，停止發酵，即獲得裂殖壺菌發酵液。
[0035]上述的方法中，步驟(4)中，所述乙醇與所述正已烷的體積比可為1:2~5，如1:
2.6。
[0036]上述的方法中，步驟(4)中，在用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發酵液之前，所述方法還包括如下步驟:
[0037]將所述裂殖壺菌發酵液進行離心分離，得到上清液；用生理鹽水洗滌所述上清液后再懸于鹽酸溶液中。
[0038]本發明與現有技術相比，具有以下優點:
[0039](I)原料易購，價格低廉。
[0040]秸桿是農業生產副產物，據統計我國年產量達億噸，目前尚未得到充分利用，部分地區還造成了環境污染。秸桿易于收集，加工粉碎和水解相對容易，水解液主要是纖維素和半纖維素降解的糖，可作為裂殖壺菌生產高附加值DHA的碳源。
[0041](2)本發明制備的DHA產量穩定，在不添加外源葡萄糖情況下，采用本發明獲得的菌體干重可達58~66g/L，油脂占細胞干重的40.8~53.3%，DHA占油脂干重的42.1~45.3%, DHA 產量為 10.3 ~15.4g/L。
[0042](3)水解與發酵過程簡單易行，操作簡便，容易控制，適合工業化生產。【具體實施方式】
[0043]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0044]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0045]下述實施例中所用到的裂殖壺菌(Aurantiochytrium limacinum SR21)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，菌株號為MYA-1381。
[0046]實施例1、玉米秸桿水解液生產DHA
[0047]( I)氨氣爆破法預處理玉米秸桿
[0048]將玉米秸桿在80°C鼓風烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(河南鴻運機械制造廠)進行研磨，用5_孔徑的網篩進行過濾得到玉米秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調節含水量至40%，置于Im3高壓反應器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達到3.0MPa后，通入裝有玉米秸桿粉的Im3高壓反應器。用夾套蒸汽加熱至80°C，維持60min。接著打開放氣閥，讓高壓反應器中的壓力聚降。將氨水預處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發，存于4°C備用。
[0049](2)酶法水解玉米秸桿
[0050]將步驟(1)氨水預處理過的玉米秸桿粉30kg (含水量約為60%)，用IM pH4.0的磷酸鹽緩沖液調節磷酸鹽終濃度 至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至50°C后，用10mol/L HCl調節pH至4.0，再加入15g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC U/g ； β -半乳糖苷酶含量約為650pNPG U/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加入125000CMC U纖維素酶和32500pNPG υβ-半乳糖苷酶)和3g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加入1550U果膠酶)，50°C處理7天。將水解液用管式離心機(上海天本管式離心機GQ145)進行離心,貯存于4°C。2個月內可使用。使用之前,用NaOH調pH至6.0。
[0051](3) DHA 發酵
[0052]在步驟(2)得到的玉米秸桿水解液中加入培養基，每IOOmL所述培養基的組成如下:
[0053]1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.02g (NH4)2SO4 ；0.2gNa2SO4 ;和余量的水。
[0054]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養基接入IOmL裂殖壺菌液體菌種，培養約120小時。其中在發酵開始到80小時內，控制培養溫度為28.0±0.50C ；80小時到90小時內，控制培養溫度為25.0±0.50C ；90小時到發酵結束，控制培養溫度為20.0±0.5°C。同時，在發酵培養開始至60小時內，通過補加氨水以維持體系pH為6.0 ± 0.2，且在發酵培養開始至100小時內，通過補加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時，停止發酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發酵液。
[0055](4) DHA 的提取
[0056]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發酵液體中細胞干重為62g/L。
[0057]取5mL裂殖壺菌發酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，80°C水浴I小時左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細胞干重的41.5%。
[0058]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質聯用儀(安捷倫)，HP-1NN0WAX極性毛細管柱，0.25iimX250iimX30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進樣量I y L ;進樣口溫度為280°C ;檢測器溫度為280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240°C后運行3min。
[0059]測得油脂中，十四烷酸含量為6.9%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.2%，二十碳五烯酸含量為15.2%，DHA含量為44.7%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
5.0%, DHA 產量為 11.5g/L。
[0060]實施例2、水稻稻桿水解液生產DHA[0061 ] (I)氨氣爆破法預處理水稻秸桿
[0062]將水稻秸桿在80°C鼓風烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(河南鴻運機械制造廠)進行研磨，用5_孔徑的網篩進行過濾得到水稻秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調節含水量至45%，置于Im3高壓反應器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達到3.5MPa后，通入裝有水稻秸桿粉的Im3高壓反應器。用夾套蒸汽加熱至90°C，維持45min。接著打開放氣閥，讓高壓反應器中的壓力聚降。將氨水預處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發，存于4°C備用。
[0063]( 2 )酶法水解水稻秸桿
[0064]將步驟(1)氨水預處理過的玉米秸桿粉30kg (含水量約為60%)，用IM pH4.5的磷酸鹽緩沖液調節磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至55°C后，用10mol/L HCl調節pH至4.5，加入21g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC UH半乳糖苷酶含量約為650pNP⑶/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加入175000CMC U纖維素酶和45500pNPG UP-半乳糖苷酶)和4.5g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg玉米秸桿粉需要加A 2325U果膠酶)，55°C處理6天。將水解液用管式離心機(上海天本管式離心機GQ145)進行離心,貯存于4°C。2個月內可使用。使用之前,用NaOH調pH至6.0。
[0065](3) DHA 發酵
[0066]在步驟(2)得到的水稻秸桿水解液中加入培養基，每IOOmL所述培養基的組成如下:
[0067]1.5g 蛋白胨；1.5g 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0068]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養基接入12mL裂殖壺菌液體菌種，培養約120小時。其中在發酵開始到75小時內，控制培養溫度為28.0±0.50C ；75小時到85小時內，控制培養溫度為25.0±0.50C ；85小時到發酵結束，控制培養溫度為20.0±0.5°C。在發酵培養開始至55小時內，通過補加氨水以維持體系pH為6.0 ± 0.2,且在發酵培養開始至95小時內，通過補加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時，停止發酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發酵液。[0069](4) DHA 的提取
[0070]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發酵液體中細胞干重為66g/L。
[0071]取5mL裂殖壺菌發酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，70°C水浴I小時左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細胞干重的53.5%。
[0072]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質聯用儀(安捷倫)，HP-1NNOWAX極性毛細管柱，0.25 μ mX 250 μ mX 30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進樣量I μ L ;進樣口溫度280°C ;檢測器溫度280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240 °C 后運行 3min。
[0073]測得油脂中，十四烷酸含量為6.7%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.5%，二十碳五烯酸含量為14.9%，DHA含量為43.7%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
6.2%, DHA 產量為 15.4g/L。
[0074]實施例3、甘蔗秸桿水解液生產DHA
[0075](I)氨氣爆破法預 處理甘蔗秸桿
[0076]將甘蔗秸桿在80°C鼓風烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(河南鴻運機械制造廠)進行研磨，用5_孔徑的網篩進行過濾得到甘蔗秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調節含水量至50%，置于Im3高壓反應器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達到4.0MPa后，通入裝有甘蔗秸桿粉的Im3高壓反應器。用夾套蒸汽加熱至95°C，維持30min。接著打開放氣閥，讓高壓反應器中的壓力聚降。將氨水預處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發，存于4°C備用。
[0077](2)酶法水解甘蔗秸桿
[0078]將步驟(1)氨水預處理過的玉米秸桿粉30kg (含水量約為65%)，用IM pH5.0的磷酸鹽緩沖液調節磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至50°C后，用10mol/L HCl調節pH至5.0，加入27g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC U/g ； β -半乳糖苷酶含量約為650ρΝΡ⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入225000CMC U纖維素酶和58500pNPG U β -半乳糖苷酶)和4.5g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入2325U果膠酶)，50°C處理7天。將水解液用管式離心機(上海天本管式離心機GQ145)進行離心,貯存于4°C。2個月內可使用。使用之前,用NaOH調pH至6.0。
[0079](3) DHA 發酵
[0080]在步驟(2)得到的甘蔗秸桿水解液中加入培養基，每IOOmL所述培養基的組成如下:
[0081]2.0g 蛋白胨;2.0g 酵母浸出粉；3.0g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.3gNa2SO4 ;和余量的水。[0082]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養基接入IlmL裂殖壺菌液體菌種，培養約120小時。其中在發酵開始到85小時內，控制培養溫度為28.0 + 0.50C ；85小時到95小時內，控制培養溫度為25.0±0.50C ；95小時到發酵結束，控制培養溫度為20.0±0.5°C。且在發酵培養開始至65小時內，通過補加氨水以維持體系pH為6.0±0.2,且在發酵培養開始至105小時內，通過補加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時，停止發酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發酵液。
[0083](4) DHA 的提取
[0084]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發酵液體中細胞干重為61g/L。
[0085]取5mL裂殖壺菌發酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，75°C水浴I小時左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細胞干重的51.6%。
[0086]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質聯用儀(安捷倫)，HP-1NNOWAX極性毛細管柱，0.25iimX250iimX30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進樣量I y L ;進樣口溫度280°C ;檢測器溫度280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240 °C 后運行 3min。
[0087]測得油脂中，十四烷酸含量為7.2%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.6%，二十碳五烯酸含量為15.1%，DHA 含量為45.3%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
3.8%, DHA 產量為 14.3g/L。
[0088]實施例4、小麥稻桿水解液生產DHA
[0089]( I)氨氣爆破法預處理小麥秸桿
[0090]將小麥秸桿在80°C鼓風烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(河南鴻運機械制造廠)進行研磨，用5_孔徑的網篩進行過濾得到小麥秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調節含水量至60%，置于Im3高壓反應器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達到4.0MPa后，通入裝有小麥秸桿粉的Im3高壓反應器。用夾套蒸汽加熱至100°C，維持30min。接著打開放氣閥，讓高壓反應器中的壓力聚降。將氨水預處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發，存于4°C備用。
[0091](2)酶法水解小麥秸桿
[0092]將步驟(1)氨水預處理過的小麥秸桿粉30kg (含水量約為70%)，用IM pH5.0的磷酸鹽緩沖液調節磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至55°C后，用10mol/L HCl調節pH至5.0，加入15g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC UH半乳糖苷酶含量約為650pNP⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入125000CMC U纖維素酶和32500pNPG -半乳糖苷酶)和3.0g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加A 1550U果膠酶)，55°C處理6天。將水解液用管式離心機(上海天本管式離心機GQ145)進行離心,貯存于4°C。2個月內可使用。使用之前,用NaOH調pH至6.0。
[0093](3) DHA 發酵
[0094]在步驟(2)得到的小麥秸桿水解液中加入培養基，每IOOmL所述培養基的組成如下:
[0095]1.0g 蛋白胨；1.0g 酵母浸出粉；2.0g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0096]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養基接入12mL裂殖壺菌液體菌種，培養約120小時。其中在發酵開始到80小時內，控制培養溫度為28.0±0.50C ；80小時到90小時內，控制培養溫度為25.0±0.50C ；90小時到發酵結束，控制培養溫度為20.0±0.5°C。在發酵培養開始至60小時內，通過補加氨水以維持體系pH為6.0±0.2,且在發酵培養開始至100小時內，通過補加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L，停止發酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發酵液。
[0097](4) DHA 的提取
[0098]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發酵液體中細胞干重為65g/L。
[0099]取5mL裂殖壺菌發酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，70~80°C水浴I小時左右，冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細胞干重的50.7%。
[0100]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件:6890C_5975N氣質聯用儀(安捷倫)，HP-1NNOWAX極性毛細管柱，0.25 μ mX 250 μ mX 30m ;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比20:1 ;進樣量為I μ L ;進樣口溫度為280°C ;檢測器溫度為280°C ;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持 5min。240°C后運行 3min。
[0101]測得油脂中，十四烷酸含量為6.3%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為29.5%，二十碳五烯酸含量為14.8%，DHA含量為42.1%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
7.3%, DHA 產量為 13.9g/L。
[0102]實施例5、棉花秸桿水解液生產DHA
[0103](I)氨氣爆破法預處理棉花秸桿
[0104]將棉花秸桿在80°C鼓風烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(河南鴻運機械制造廠)進行研磨，用5_孔徑的網篩進行過濾得到棉花秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調節含水量至55%，置于Im3高壓反應器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達到3.5MPa后，通入裝有棉花秸桿粉的Im3高壓反應器。用夾套蒸汽加熱至100°C，維持30min。接著打開放氣閥，讓高壓反應器中的壓力聚降。將氨水預處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發，存于4°C備用。
[0105](2)酶法水解棉花秸桿
[0106]將步驟(1)氨水預處理過的棉花秸桿粉30kg (含水量約為65%)，用IM pH5.5的磷酸鹽緩沖液調節磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至55°C后，用10mol/L HCl調節pH至5.5，加入18g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC UH半乳糖苷酶含量約為650pNP⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入150000CMC U纖維素酶和39000pNPG -半乳糖苷酶)和3.0g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加A 1550U果膠酶)，55°C處理7天。將水解液用管式離心機(上海天本管式離心機GQ145)進行離心,貯存于4°C。2個月內可使用。使用之前,用NaOH調pH至6.0。
[0107](3) DHA 發酵
[0108]在步驟(2)得到的棉花秸桿水解液中加入培養基，每IOOmL所述培養基的組成如下:
[0109]1.Sg 蛋白胨；1.Sg 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.04g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0110]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養基接入IOmL裂殖壺菌液體菌種，培養約120小時。其中在發酵開始到75小時內，控制培養溫度為28.0±0.50C ；75小時到85小時內，控制培養溫度為25.0±0.50C ；85小時到發酵結束，控制培養溫度為20.0±0.5°C。且在發酵培養開始至55小時內，通過補加氨水以維持體系pH為6.0 ± 0.2,且在發酵培養開始至95小時內，通過補加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時，停止發酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發酵液。
[0111](4) DHA 的提取
[0112]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發酵液體中細胞干重為58g/L。
[0113]取5mL裂殖壺菌發酵液于IOmL離心管中，8000r/min,4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，80°C水浴I小時左右,冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細胞干重的48.5%。
[0114]稱取IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件為:6890C_5975N氣質聯用儀(安捷倫)，HP-1NN0WAX極性毛細管柱，0.25iimX250iimX30m;載氣:氦氣；載氣流量:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比為20:1 ;進樣量為Iu L ;進樣口溫度為2800C ;檢測器溫度為280°C ;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至220°C，保持5min。240°C后運行3min。
[0115]測得油脂中，十四烷酸含量為6.2%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為28.5%，二十碳五烯酸含量為13.8%，DHA含量為43.6%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
7.9%, DHA 產量為 12.3g/L。
[0116]實施例6、高粱秸桿水解液生產DHA
[0117](I)氨氣爆破法預處理高粱秸桿
[0118]將高粱秸桿在80°C鼓風烘箱中干燥約2天，用秸桿粉碎機(河南鴻運機械制造廠)進行研磨，用5_孔徑的網篩進行過濾得到高粱秸桿粉。取IOOkg干秸桿粉，用蒸餾水調節含水量至50%，置于Im3高壓反應器中。取IOOkg氨水于200L不銹鋼壓力罐中，加熱使其壓力達到4.0MPa后，通入裝有高粱秸桿粉的Im3高壓反應器。用夾套蒸汽加熱至95°C，維持45min。接著打開放氣閥，讓高壓反應器中的壓力聚降。將氨水預處理過的秸桿粉放置過夜，讓殘余的氨水蒸發，存于4°C備用。
[0119](2)酶法水解高粱秸桿
[0120]將步驟(1)氨水預處理過的高粱秸桿粉30kg (含水量約為60%)，用IM pH5.0的磷酸鹽緩沖液調節磷酸鹽終濃度至50mM，加蒸餾水至100L，于121°C滅菌30min，降溫至50°C后，用10mol/L HCl調節pH至5.0，加入18g/L Accellerasel500 (杰能科生物工程有限公司，纖維素酶含量2500CMC U/g ； β -半乳糖苷酶含量約為650ρΝΡ⑶/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入150000CMC U纖維素酶和39000pNPG U β -半乳糖苷酶)和6.0g/L Multifectpectinase (杰能科生物工程有限公司，果膠酶含量約為155U/g，則Ikg甘蔗秸桿粉需要加入3100U果膠酶)，50°C處理6天。將水解液用管式離心機(上海天本管式離心機GQ145)進行離心,貯存于4°C。2個月內可使用。使用之前,用NaOH調pH至6.0。
[0121](3) DHA 發酵
[0122]在步驟(2)得到的高粱秸桿水解液中加入培養基，每IOOmL所述培養基的組成如下:
[0123]2.0g 蛋白胨;2.0g 酵母浸出粉；2.5g 海水晶；0.06g KH2PO4 ；0.03g (NH4)2SO4 ；0.4gNa2SO4 ;和余量的水。
[0124]于121°C滅菌30min，冷卻后按照每IOOmL培養基接入IOmL裂殖壺菌液體菌種，培養約120小時。其中在發酵開始到85小時內，控制培養溫度為28.0 + 0.5°C ；85小時到95小時內，控制培養溫度為25.0±0.50C ；95小時到發酵結束，控制培養溫度為20.0±0.5°C。且在發酵培養開始至65小時內，通過補加氨水以維持體系pH在6.0 ± 0.2,且在發酵培養開始至105小時內，通過補加秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時，停止發酵，獲得富含DHA的裂殖壺菌發酵液。
[0125](4) DHA 的提取
[0126]取20mL步驟(3)中得到的裂殖壺菌發酵液于50mL離心管中，8000r/min，4°C冷凍離心lOmin，用去離子水重懸離心，重復2次后移至已知恒重的平板，于85°C烘箱烘干至恒重，測定發酵液體中細胞干重為60g/L。
[0127]取5mL裂殖壺菌發酵液于IOmL離心管中，8000r/min, 4°C冷凍離心IOmin,棄上清，用生理鹽水離心洗滌,重復三次。得到濕菌體重懸于4mL10mol/L鹽酸，70~80°C水浴I小時左右，冷卻后加0.75mL無水乙醇與2mL正己燒,充分搖勻，1200r/min, 2min離心取上清于恒重螺口管中，重復3次，真空抽干即得裂殖壺菌油脂，測得油脂占細胞干重的40.8%。
[0128]稱取 IOOmg所得裂殖壺菌油脂，加入2mL正己烷溶解，再加2mL10%HCl/CH30H62°C恒溫回流酯化I小時，取0.5mL上清GC-MS分析。GC-MS條件:6890C_5975N氣質聯用儀(安捷倫)，HP-1NN0WAX極性毛細管柱，0.25 μ mX 250 μ mX 30m ;載氣:氦氣；載氣流量為:1.0mL/min，恒定流量；上樣模式:分流，分流比為20:1 ;進樣量為I μ L ;進樣口溫度280°C ；檢測器溫度為280°C;升溫程序:150°C下保持lmin，10°C /min升溫至200°C，2°C /min升溫至 220°C，保持 5min。240°C后運行 3min。
[0129]測得油脂中，十四烷酸含量為7.2%，十六烷酸(棕櫚酸)含量為29.5%，二十碳五烯酸含量為13.2%，DHA含量為42.1%，其它雜酸(十五烷酸、十七烷酸和十八烷酸)含量為
·8.0%, DHA 產量為 10 .3g/L。
【權利要求】
1.一種利用秸桿水解液發酵生產二十二碳六烯酸的方法，包括如下步驟: (1)利用氨氣爆破法預處理秸桿粉，得到預處理后的秸桿粉； (2)用纖維素酶、β-半乳糖苷酶和果膠酶酶解所述預處理后的秸桿粉，得到秸桿水解液； (3)向所述稻桿水解液中加入培養基,然后接入裂殖壺菌(Aurantiochytrium)進行發酵培養，獲得裂殖壺菌發酵液； (4)用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發酵液，得到提取液；所述提取液經干燥即得二十二碳六烯酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述秸桿粉由玉米秸桿、水稻秸桿、甘蔗秸桿、小麥秸桿、棉花秸桿和高粱秸桿中至少一種制成； 所述秸桿粉的粒徑小于5mm。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述氨氣爆破法包括如下步驟: 將所述秸桿粉調控至質量含水量為40%~60%，然后加入高壓反應器中；然后利用氨氣在3.0~4.0MPa下處理所述秸桿粉。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述處理的溫度為80°C~100°C，時間為30~60分鐘； 所述預處理后的稻桿粉的質量含水量為60%~70%。`
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述纖維素酶、所述β-半乳糖苷酶和所述果膠酶的用量為=IKg所述預處理后的秸桿粉需要加入125000~225000CMC U所述纖維素酶、32500~58500pNPG U所述β -半乳糖苷酶和1550~3100U所述果膠酶。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述酶解的條件如下: 在pH為4.0~5.5和溫度為50°C~55°C的條件下處理6~7天。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，每IOOmL所述培養基的組成如下: 1.0~2.0g蛋白胨;1.0~2.0g酵母浸出粉;2.0~3.0g海水晶;0.04~0.06g KH2PO4 ；0.02 ~0.03g (NH4)2SO4 ；0.2 ~0.4g Na2SO4 ;和余量的水。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述裂殖壺菌(Aurantiochytrium)接入的初始濃度為每IOOmL培養基接入10~12mL所述裂殖壺菌。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述發酵培養的條件如下: 在所述發酵培養開始至75~85小時內，控制所述發酵培養的溫度為27.5~28.5°C,繼續發酵培養至85~95小時內，控制所述發酵培養的溫度為24.5~25.5°C ;繼續培養至發酵結束，控制所述發酵培養的溫度為19.5~20.50C ； 且在所述發酵培養開始至55~65小時內，通過補加氨水以維持體系pH為5.8~6.2，繼續發酵培養至95~105小時內，通過補加所述秸桿水解液以維持體系中還原糖的濃度大于10g/L，之后，當檢測到體系中還原糖的濃度低于lg/L時，停止發酵，即獲得裂殖壺菌發酵液。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，在用乙醇和正已烷的混合液提取所述裂殖壺菌發酵液之前，所述方法還包括如下步驟: 將所述裂殖壺菌發酵液進行離心分離，得到上清液；用生理鹽水洗滌所述上清液后再懸于鹽酸溶液中。
【文檔編號】C12P7/64GK103614427SQ201310571413
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】黃建忠, 江賢章, 張明亮 申請人:福建師范大學