一種用于檢測b族鏈球菌特有序列的引物、探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明采用聚合酶鏈式反應（PCR）及分子信標熒光探針技術對B族鏈球菌中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷B族鏈球菌的存在。提供了一種可替代的優化的檢測B族鏈球菌的引物、短柄圓環探針序列、以及對應的試劑盒，對B族鏈球菌的PCR熒光法檢測技術起到推動作用。樣品檢測最快可以在2-3小時內完成，具有檢測速度快、檢測成本低的特點。
【專利說明】一種用于檢測B族鏈球菌特有序列的引物、探針及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于檢測細菌的裝置和方法，尤其涉及一種用于檢測B族鏈球菌特有序列的引物、短柄圓環探針、以及試劑盒。
【背景技術】
[0002]B族鏈球菌(GBS)學名為無乳鏈球菌(S.agalactiae)，是一種有莢膜的細菌，能夠引起牛乳房炎，危害畜牧業非常嚴重，所以早為畜醫界注目。后來發現該細菌能夠感染人類，尤其是新生兒。該細菌所引起的敗血病、腦膜炎、肺炎等疾病的死亡率極高，并且通常伴有神經系統后遺癥，由此又被醫學界所重視。
[0003]B族鏈球菌感染也稱作乙型鏈球菌感染，是新生兒敗血癥和腦膜炎、以及母親感染的重要原因。1990年以來，美國由于分娩前采取預防性篩查，使早發的B族鏈球菌感染降低了 70%。根據分娩前得到篩查結果，患者可在住院后立即得到靜脈注射抗生素治療。
[0004]目前，通常采用標準細菌培養方法來檢測B族鏈球菌的存在，該方法從陰道和肛門取材，由于需要進行細菌培養，需要在35-37周孕期取材，大約需要18-48小時得到檢測結果，比較費時，不能夠有效、快速地檢測出B族鏈球菌的存在。如果檢測結果為陽性，需要給孕婦使用抗生素以預防她將細菌傳染給嬰兒。
[0005]專利號為200410049736.4，名稱為“用于檢測B族鏈球菌特有序列的引物、短柄圓環探針、試劑盒及方法”的發明專利是一種用PCR擴增法檢測B族鏈球菌的存在，該發明最快可以在2-3小時內完成，具有檢測速度快、檢測成本低的優點，但其引物和探針序列可以進一步改進、優化，以增進其檢測的靈敏性、特異性、以及穩定性。
【發明內容】
[0006]因此，針對現有技術存在的不足，本發明的目的在于提供一種替代現有技術的、優化的用于檢測B族鏈球菌特有序列的引物、短柄圓環探針、以及試劑盒，以供實驗室、臨床研究使用，并能夠應用于普查和預防工作，尋找可能的動物來源及從動物到人的轉移與進化。
[0007]本發明采用聚合酶鏈式反應(PCR)及分子信標熒光探針技術對B族鏈球菌中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷B族鏈球菌的存在。
[0008]為了實現上述目的，針對B族鏈球菌的特點，首先選擇相應的靶序列，然后針對所選擇的特定靶序列設計特異性的引物，特異性地擴增出目的DNA片段。因此，根據待測基因兩端的DNA順序的引物設定是本發明的要點。
[0009]本發明提供了一種為進行PCR擴增B族鏈球菌選定的靶序列而設計的引物，其中該引物序列為:上游引物5 ’ -AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3 ’，即SEQ ID NO:1 ;下游引物5，- ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’，即 SEQ ID NO:2 ;且該靶序列選定在 111-211 之間。
[0010]本發明還提供了一種為了檢測該特定靶序列而設計的探針。首先選定用于識別和檢測B族鏈球菌的靶序列，將該靶基因片段選定在111-211之間。將該短柄圓環探針序列設計成兩部分，該短柄圓環探針序列包括兩個序列，一個為圓環序列，為5’ -CCCCCCACGATACT-3’，即SEQ ID NO:3 ;一個為短柄序列，由位于該短柄圓環探針兩端的另外六對互補堿基構成。因此，根據靶基因序列的探針設定也是本發明的要點。
[0011]優選地，該圓環序列與選定的靶基因片段互補。
[0012]優選地，所述短柄圓環探針的5’端標記FAM的熒光素，而3’端標記DABCYL淬滅劑。
[0013]優選地，位于所述短柄圓環探針兩端的另外六對互補堿基分別為:與所述圓環序列的5’端C相連的3’ -GCCGCC- 5’，即SEQ ID NO:4 ;與所述圓環序列的3’端T相連的5’ -CGGCGG -3’，即 SEQ ID NO:5。
[0014]優選地，所述短柄圓環探針用于熒光檢測。
[0015]另外，本發明還提供了一種用于檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒每人份包括:2-5ml運輸液，0.5-lml拭子洗脫液，Tris和5%-10%EDTA緩沖液，pH值在6-8之間；裂解液管，內裝0.05-0.1ml玻璃珠；核酸擴增和雜交反應管，內裝0.02-0.04ml的核酸擴增混和液、dNTP、內參照引物和探針、一對引物、和用于B族鏈球菌的短柄圓環探針；以及
0.02-0.05ml自備試劑。
[0016]所述引物是為進行PCR擴增B族鏈球菌選定的靶序列而設計的引物:上游引物堿基序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物堿基序列如SEQ ID NO:2所示；所述用于B族鏈球菌的短柄圓環探針是這樣的一個探針序列:該短柄圓環探針序列包括兩個序列，一個為圓環序列，堿基序列如SEQ ID NO:3所示，一個為短柄序列，兩端分別為:與所述圓環序列的5’端C相連的SEQ ID NO:4堿基序列；與所述圓環序列的3’端T相連的SEQID NO:5堿基序列。所述內參照引物取自擬南芥基因，所述內參照引物為:Suc-F:5’-CGTCGCTGGAGCTGGTTTAG-3，JPSEQ ID NO:6 ;Suc_R: 5，- CGGCGGTTTGCTAAGCTGAT-3，，即 SEQID NO:7 ;所述內參照探針為:5/ -AATCCGGTGGTGAT -3/，即 SEQ ID NO:8 ;內控引物Suc-F的特異結合區位于擬南芥基因的231~250位，共20個堿基，內控引物Suc-R的特異結合區位于擬南芥基因的1008~1027位，共20個堿基。
[0017]優選地，所述運輸液為經處理的高純水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl。
[0018]優選地，所述運輸液為3%_5%氯化鈉，15%_20%牛肉粉，和6%_12%蛋白胨。所述氯化鈉、牛肉粉和蛋白胨均可來源于市購。
[0019]優選地，所述拭子洗脫液為2%-59ffiDTA。
[0020]優選地，所述玻璃珠直徑為0.1-0.25mm。
[0021]優選地，試劑盒進一步包括0.02-0.05ml自備試劑；
優選地，所述自備試劑為石蠟油。
[0022]優選地，試劑盒進一步包括陽性對照液及陰性對照液。陽性對照液制備由ATCC購得陽性菌株培養滅活所得，陰性對照液由醫院獲得陰性樣本培養滅活所得。
[0023]本發明與現有技術相比，具有以下特點和優點:
1.本發明對比專利號為“200410049736.4”的發明專利，針對的靶序列不相同，提供了一種可替代的優化的檢測B族鏈球菌的引物、短柄圓環探針序列、以及對應的試劑盒，對B族鏈球菌的PCR熒光法檢測技術起到推動作用。樣品檢測最快可以在2-3小時內完成，具有檢測速度快、檢測成本低的特點。[0024]2.根據本發明用于檢測B族鏈球菌的試劑盒，具有靈敏性和特異性高、以及穩定性好的優點，有著廣闊的市場應用前景；以及
3.根據本發明用于檢測B族鏈球菌的試劑盒，可以供實驗室和臨床研究使用，并應用于普查和預防工作。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是靈敏度參比品檢測結果圖；
圖2是精密度參比品檢測結果圖；
圖3是陽性準確性Z1-Z5參比品檢測結果圖；
圖4是Z6-Z10陰性準確性參比品檢測結果圖；
圖5是特異性Tl-TlO參比品檢測結果圖；
圖6是試劑盒中陽性對照、臨界陽性對照、陰性對照參比品檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0026]如圖1所示，本發明用于檢測生物樣本中B族鏈球菌的方法包括以下步驟:
1.本發明根據國際上報道的B族鏈球菌序列來選擇靶點；
2.針對選定靶點設計引物和探針序列；
3.提取患者的DNA樣本；以及
4.進行核酸擴增和雜交檢測DNA樣本中是否存在B族鏈球菌。
[0027]通過以下對上述各個步驟的詳細描述，本領域技術人員可以進一步了解本發明的目的和優點。
[0028]步驟1:選擇靶點
以下為國際上報道的B族鏈球菌序列，結合于此作為參考，該序列是本發明選擇靶點的依據，即SEQ ID NO:9所示。
[0029]
【權利要求】
1.一種為進行PCR擴增B族鏈球菌選定的靶序列而設計的引物，所述引物為以下的一對序列: 上游引物:5 ’ -AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3，； 下游引物:5’ -ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’。
2.一種用于檢測根據權利要求1所述的引物擴增的B族鏈球菌的短柄圓環探針，所述短柄圓環探針包括兩個序列，一個為圓環序列，一個為短柄序列，所述圓環序列為:5’ -CCCCCCACGATACT -3’，所述短柄序列由位于所述短柄圓環探針兩端的六對互補堿基構成。
3.根據權利要求2所述的短柄圓環探針，其特征在于，所述圓環探針的5’端標記FAM的熒光素，而所述圓環探針的3’端標記DABCYL淬滅劑。
4.根據權利要求2或3所述的短柄圓環探針，其特征在于，所述短柄序列為:與所述圓環序列的5 ’端C相連的3 ’ -GCCGCC -5 ’序列，和與所述圓環序列的3 ’端T相連的5 ’ -CGGCGG-3’序列。
5.根據權利要求2或3所述的短柄圓環探針，其特征在于，所述短柄圓環探針用于熒光檢測，所述圓環序列與靶序列是完全互補的序列。
6.一種用于檢測B族鏈球菌的試劑盒,其特征在于,包括:2-5ml運輸液,0.5-lml拭子洗脫液，Tris和5%-109ffiDTA緩沖液，pH值在6_8之間；裂解液管，內裝0.05-0.1ml玻璃珠；核酸擴增和雜交反應管，內裝0.02-0.04ml的核酸擴增混和液、dNTP、內參照引物和探針、一對序列為 5’ -AGGAAGAITTATCGCACCTGAAAT-3’ 和 5’ -ATGCTGGGCAATCAATGITTCT-3 ’ 的引物、以及根據權利要求2-5所述的用于B族鏈球菌的短柄圓環探針；以及0.02-0.05ml自備試劑。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述內參照引物取自擬南芥基因，所述內參照引物為:
Suc-F:5， - CGTCGCTGGAGCTGGTTTAG-3，，
Suc-R:5’ - CGGCGGTTTGCTAAGCTGAT-3’ ； 所述內參照探針為:5’ -AATCCGGTGGTGAT -3’。
8.根據權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括陽性對照液、陰性對照液。
9.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述運輸液為經處理的高純水、Tris-HCl、Triton X-100 或 NaCl。
10.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述自備試劑為石蠟油。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627801SQ201310571103
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】蔡曉沂, 高建平 申請人:福州泰普生物科學有限公司