一種敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT及其構建方法
【專利摘要】一種敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT及其構建方法，它涉及一種自殺質粒及其構建方法。敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT由prcK基因左側片段prcKL、prcK基因右側片段prcKR、四環素抗性基因和質粒pUC18構成。構建方法：一、擴增片段prcKL；二、得到質粒pUC18-KL；三、擴增片段prcKR；四、得到質粒pUC18-KLKR；五、擴增四環素抗性基因Tet；六、得到敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT。本發明用于生物工程研究領域。
【專利說明】—種敲除PrcK基因的自殺質粒pYTKLKRT及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種自殺質粒及其構建方法。
【背景技術】 [0002]近年來研究中研究人員發現在某些G+菌QS體系中的AIP不僅僅是信號分子，它還具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳桿菌的植物乳桿菌素等等。這些抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)的基因簇中除了含有ABC轉運體編碼基因外,還有一個輔助蛋白(accessory protein, AP)編碼基因，它們的產物組成了 AMP輸出和處理體系。AMP的結構基因都位于其相應的免疫蛋白基因之前，產生的AMP大多數富含半胱氨酸，具有疏水性，而且，經研究發現，AMP的最大生產量與產生菌的非最佳生長條件有關。
[0003]根據AMP的性質不同，可將AMP分為兩大類:一類是I型AMPs或硫醚抗生素，它們是一些對熱穩定的肽類，在被分泌之前會被進行高度的翻譯后修飾，如nisin、枯草菌素；另一類是II型AMPs或熱穩定的AMPs，它們具有特征性的雙甘氨酸基序，分泌之前不存在修飾過程，但在分泌后，前體肽的N端會有一個片段被移去，如植物乳桿菌素、乳酸桿菌素P
坐寸O
[0004]副干釀乳桿菌(Lactobacillusparacasei)HDL 7,革蘭氏陽性菌,2003年從齊齊哈爾豐源食品有限公司乳酸酸菜發酵液中分離獲得。它最大的特點是在其發酵液中可產生抑制多種G+、G-和釀酒酵母生長的肽類物質，分子量在IOkD左右，熱穩定，酸性條件下(PH2~6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更為優越，因為nisin能有效的抑制革蘭氏陽性菌如一些腐敗菌、致病菌和芽孢菌，而對革蘭氏陰性菌起的作用并不大，甚至不起作用。同時經過研究還發現，當將高密度菌體發酵液OlO11個/mL)添加到低密度菌體發酵液(<105個/mL)中時，可促進低密度菌體中這種AMP的生成；發酵24h和48h的菌體發酵液，其抑菌能力相差較大。以上種種現象說明，該菌產生的這種AMP的產量可能受到菌群密度影響和控制。
[0005]國外Nakayama等通過PCR方法克隆到了副干酪乳桿菌擬群體效應相關基因(prcA.prcK和prcR)，但對于這些基因在群體感應中的具體功能，以及AMP產量是否與群體感應有關尚不明確。
[0006]目前，基因功能的研究方法主要有兩種:一種是增強基因表達，然后對獲得的表達產物進行研究；另一種是減弱或者終止基因表達，通過觀察生物整體功能的變化，進而推測相應的基因功能。由于第一種方法往往不能反映基因產物的真實表達情況，而逐漸被拋棄。第二種方法中RNA干擾技術(RNAi)實際上只是在轉錄后水平上降低基因的表達，并不象基因敲除技術可以完全把基因從基因組中剔除掉，有時也會因背景的不干凈導致產生的表型難以分析。因此，采用基因敲除技術成為了目前最為理想和合適的方法。
[0007]基因敲除技術根據基因打靶的目的不同，載體有不同的設計方法，可分為替換性載體和插入型載體。由于參照Genbank提供的prcK基因序列信息所設計的引物對，反復試驗都無法得到副干酪乳桿菌HDl.7的prcK基因特異性條帶，因此“副干酪乳桿菌HDl.7prcK基因敲除載體構建及其電轉化條件初步確立”中不得不采用拼接的方式構建插入型基因敲除載體，不但同源臂的長度短，僅有550bp，而且構建步驟繁瑣、成功率低。又因為無法找到滿足四環素抗性基因(tet基因)插入prcK-550片段要求的酶，該方法還不得已在tet基因擴增上游引物中設計了一個突變的堿基，導致突變位點的引入。
【發明內容】
[0008]本發明為了解決現有副干酪乳桿菌HDl.7的prcK基因敲除載體構建過程中自殺載體內同源片段長度短，構建步驟繁瑣、成功率低，引入突變位點的缺陷，而提供的一種敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT及其構建方法。
[0009]本發明敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT由prcK基因左側片段prcKL、prcK基因右側片段prcKR、四環素抗性基因和質粒pUC18構成；片段prcKL的核酸序列如SEQ IDNO:1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]上述敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT按以下步驟進行構建:
[0011]一、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因左側片段prcKL,擴增片段prcKL的上游引物為prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列為5?-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，擴增片段 prcKL 的下游引物為 prcKL-down，prcKL-down 的核苷酸序列為 5’ -GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR 擴增片段 prcKL 的反應體系為50μ L 由 10 μ L含Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的prcKL-up> 10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKL-down>0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增片段prcKL的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、62°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0012]二、用限制性內切酶Sac I及Kpn I對質粒pUC18和步驟一獲得的片段prcKL分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I prcKL雙酶切片段、5 4 1質粒？阢18雙酶切片段、2.5“110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16 °C過夜連接，得到質粒pUC18_KL ；
[0013]三、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因右側片段prcKR，擴增片段prcKR的上游引物為prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列為5?-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，擴增片段 prcKR 的下游引物為 prcKR-down，prcKR-down 的核苷酸序列為 5’ -CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’, PCR 擴增片段 prcKR 的反應體系為50μ L由 10μ L 含 Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的prcKR-up> 10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKR-down>0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增片段prcKR的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、55°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0014]四、用限制性內切酶Pst I及Kpn I對質粒pUC18_KL和步驟三獲得的片段prcKR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I口代10?雙酶切片段、5 4 1質粒口此18-此雙酶切片段、2.5 4 110\了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，得到質粒pUC18_KLKR ；[0015]五、以pBR322質粒為模板PCR擴增四環素抗性基因Tet，擴增Tet的上游引物為Tet-up, Tet-up 的核苷酸序列為 5，-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3，,擴增 Tet 的下游引物為 Tet-down，Tet-down 的核苷酸序列為 5’ -GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3，,PCR擴增Tet的反應體系為50 μ L由10 μ L含Mg2+的5 X PrimeSTAR Buffer,4 μ L濃度各為2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUO μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 pBR322 質粒、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 Tet-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 Tet_down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增Tet的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、46°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0016]六、用限制性內切酶Kpn I對質粒PUC18-KLKR和步驟五獲得的四環素抗性基因 Tet分別進行酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25 μ I由16.5 μ I四環素抗性基因Tet酶切片段、5 μ I質粒pUC18-KLKR酶切片段、2.5μ 110XT4DNA LigaseBuffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，即得到敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT。
[0017]構建自殺質粒必須選擇出合適的載體,載體質粒在受體菌中不能復制,載體質粒必須帶有一個在整合到染色體內以后可供選擇的抗性標記，載體質粒帶有易于克隆的多克隆位點；必須選擇出足夠長的同源臂，同源臂越長越有利于同源重組的發生，可降低錯誤置換的發生率，而且同源臂又必須滿足酶切位點的單一性，在同源臂內部不能包含插入時用到的限制性酶切位點；必須選擇出合適的目標基因，目標基因片段與替換的片段長度相同，且不含插入時用到的限制性酶切位點，不能引入突變。所以，要同時滿足上述所有條件構建自殺質粒的難度非常大。
[0018]本發明方法無需擴增出副干酪乳桿菌HDl.7的prcK基因，因此避免了因菌株不同造成的影響。而且不必進行基因拼接，構建步驟少，成功率高。
[0019]本發明自殺質粒pYTKLKRT中同源臂的長度達到了 2.71kb，遠遠超過了已知prcK基因自殺質粒敲除技術中同源臂的長度，提高了同源重組率，避免了錯誤基因置換的發生。而且本發明選用的同源臂不含插入時用到的限制性酶切位點，不含突變位點，具有生物安全性。
[0020]本發明利用了四環素抗性基因作為目標基因替換prcK基因，不但使陽性受體菌容易篩選，而且通過四環素抗性的表達證明prcK基因已經被成功的敲除。
[0021 ] 本發明為之后研究prcK基因與副干酪乳桿菌擬群體效應奠定了物質基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是實施例1中步驟二獲得的質粒PUC18-KL的酶切驗證結果圖。
[0023]圖2是實施例1中步驟二獲得的質粒PUC18-KLKR的酶切驗證結果圖。
[0024]圖3是實施例1中步驟二獲得的質粒pYTKLKRT的酶切驗證結果圖。
【具體實施方式】
[0025]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0026]【具體實施方式】一:本實施方式敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT由prcK基因左側片段prcKL、prcK基因右側片段prcKR、四環素抗性基因和質粒pUC18構成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0027]【具體實施方式】二:本實施方式敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT按以下步驟進行構建:
[0028]一、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因左側片段prcKL，擴增片段prcKL的上游引物為prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列為5?-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，擴增片段 prcKL 的下游引物為 prcKL-down，prcKL-down 的核苷酸序列為 5’ -GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR 擴增片段 prcKL 的反應體系為50μ L 由 10 μ L含Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的prcKL-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKL-down>0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增片段prcKL的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、62°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0029]二、用限制性內切酶Sac I及Kpn I對質粒pUC18和步驟一獲得的片段prcKL分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I prcKL雙酶切片段、5 4 1質粒？阢18雙酶切片段、2.5“110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16 °C過夜連接，得到質粒pUC18_KL ；
[0030]三、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因右側片段prcKR，擴增片段prcKR的上游引物為prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列為5?-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，擴增片段 prcKR 的下游引物為 prcKR-down，prcKR-down 的核苷酸序列為 5’ -CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’, PCR 擴增片段 prcKR 的反應體系為50μ L 由 10 μ L含Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的prcKR-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKR-down>0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；`PCR擴增片段prcKR的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、55°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0031]四、用限制性內切酶Pst I及Kpn I對質粒pUC18_KL和步驟三獲得的片段prcKR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I口代10?雙酶切片段、5 4 1質粒口此18-此雙酶切片段、2.5 4 110\了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，得到質粒pUC18_KLKR ；
[0032]五、以pBR322質粒為模板PCR擴增四環素抗性基因Tet，擴增Tet的上游引物為Tet-up, Tet-up 的核苷酸序列為 5，-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3，,擴增 Tet 的下游引物為 Tet-down，Tet-down 的核苷酸序列為 5’ -GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3，,PCR擴增Tet的反應體系為50 μ L由10 μ L含Mg2+的5 X PrimeSTAR Buffer,4 μ L濃度各為2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUO μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 pBR322 質粒、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 Tet-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 Tet_down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增Tet的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、46°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0033]六、用限制性內切酶Kpn I對質粒PUC18-KLKR和步驟五獲得的四環素抗性基因Tet分別進行酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25 μ I由16.5 μ I四環素抗性基因Tet酶切片段、5 μ I質粒pUC18-KLKR酶切片段、2.5μ 110XT4DNA LigaseBuffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，即得到敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT。
[0034]本實施方式引物序列中標注有下劃線的部分為酶切位點。
[0035]本實施方式步驟一擴增出的片段prcKL長度為1343bp，步驟三擴增出的片段prcKR長度為1369bp，步驟五擴增出的片段Tet長度為1407bp。
[0036]由于G_細菌的質粒不能在G+細菌中復制，因此，需在G_細菌的質粒上加上能在G+細菌中表達的抗性基因。本實施方式選擇了 PUC18作為質粒骨架，以四環素基因作為抗性基因，來構建prcK基因敲除載體。該載體轉化進入HDl.7后不能復制，但是能與同源基因發生同源重組整合到HDl.7染色體上，表達出四環素抗性，從而進行篩選。
[0037]酶切與連接是關鍵核心步驟，是影響重組率和實驗繁簡的關鍵因素。實驗中酶切位點個數、酶切位點的位置和內切酶種類的選擇是酶切位點設計中的重中之重和基本因素。
[0038]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】二的不同點在于:步驟二中質粒P UC18酶切反應體系為20 μ L由I μ L濃度為IOU/ μ L的Sac 1、I μ L濃度為IOU/ μ L的KpnΙ、2 μ LlOXBuffer Tango、7y L 濃度為 80ng/μ L 的質粒 pUC18 和 9μ L 無菌 ddH20 組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。其他步驟和參數與【具體實施方式】二相同。
[0039]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】二或三的不同點在于:步驟二中片段prcKL酶切反應體系為20 μ L由I μ L濃度為IOU/ μ L的Sac 1、I μ L濃度為IOU/ μ L的Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、10 μ L 濃度為 80ng/μ L 的片段 prcKL 和 6 μ L 無菌 ddH20 組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。其他步驟和參數與【具體實施方式】二或三相同。
[0040]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】二、三或四的不同點在于:步驟四中質粒？此18-此酶切反應體系為2(^1^由I μ L濃度為IOU/μ L的Pst 1、I μ L濃度為IOU/μ L 的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的質粒 pUC18_KL 和 9 μ L 無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。其他步驟和參數與【具體實施方式】二、三或四相同。
[0041]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】二至五之一的不同點在于:步驟四中片段prcKR酶切反應體系為20μ L由I μ L濃度為IOU/μ L的Pst 1、I μ L濃度為IOU/μ L的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的片段 prcKR 和 9 μ L 無菌 ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。其他步驟和參數與【具體實施方式】
二至五之一相同。
[0042]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】二至六之一的不同點在于:步驟六中質粒PUC18-KLKR酶切反應體系為20 yL由IyL濃度為IOU/ μ L的Kpn 1、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/ μ L 的質粒 pUC18_KLKR 和 10 μ L 無菌 ddH20 組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。其他步驟和參數與【具體實施方式】二至六之一相同。
[0043]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】二至七之一的不同點在于:步驟六中四環素抗性基因Tet酶切反應體系為20yL由IyL濃度為10U/yL的Kpn 1、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L濃度為80ng/ μ L的四環素抗性基因Tet和10 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。其他步驟和參數與【具體實施方式】二至七之一相同。
[0044]實施例1
[0045]敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT按以下步驟進行構建:
[0046]一、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因左側片段prcKL,擴增片段prcKL的上游引物為prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列為5?-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，擴增片段prcKL 的下游引物為 prcKL-down，prcKL-down 的核苷酸序列為 5’ -GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR 擴增片段 prcKL 的反應體系為50μ L由 10μ L 含 Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的prcKL-up> 10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKL-down>0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增片段prcKL的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、62°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0047]二、用限制性內切酶Sac I及Kpn I對質粒pUC18和步驟一獲得的片段prcKL分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I prcKL雙酶切片段、5 4 1質粒？ 阢18雙酶切片段、2.5“110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16 °C過夜連接，得到質粒pUC18_KL ；
[0048]三、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因右側片段prcKR，擴增片段prcKR的上游引物為prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列為5?-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，擴增片段prcKR 的下游引物為 prcKR-down，prcKR-down 的核苷酸序列為 5’ -CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’, PCR 擴增片段 prcKR 的反應體系為50μ L 由 10 μ L含Mg2+的 5 XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP Mixture、10 μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的prcKR-up> 10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKR-down>0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增片段prcKR的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、55°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；
[0049]四、用限制性內切酶Pst I及Kpn I對質粒pUC18_KL和步驟三獲得的片段prcKR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I口代10?雙酶切片段、5 4 1質粒口此18-此雙酶切片段、2.5 4 110\了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，得到質粒pUC18_KLKR ；
[0050]五、以pBR322質粒為模板PCR擴增四環素抗性基因Tet，擴增Tet的上游引物為Tet-up, Tet-up 的核苷酸序列為 5，-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3，,擴增 Tet 的下游引物為 Tet-down，Tet-down 的核苷酸序列為 5’ -GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3，,PCR擴增Tet的反應體系為50 μ L由10 μ L含Mg2+的5 X PrimeSTAR Buffer,4 μ L濃度各為2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUO μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 pBR322 質粒、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 Tet-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 Tet_down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增Tet的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、46°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ；[0051]六、用限制性內切酶Kpn I對質粒PUC18-KLKR和步驟五獲得的四環素抗性基因Tet分別進行酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25 μ I由16.5 μ I四環素抗性基因Tet酶切片段、5 μ I質粒pUC18-KLKR酶切片段、2.5μ 110XT4DNA LigaseBuffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，即得到敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT。
[0052]其中，步驟二中質粒pUC18酶切反應體系為20 μ L由I μ L濃度為IOU/ μ L的SacΙ、1 μ L 濃度為 ?ου/μ L 的 Kpn 1、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的質粒PUC18和9 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段；
[0053]步驟二中片段prcKL酶切反應體系為20μ L由I μ L濃度為lOU/μ L的Sac IUuL濃度為 ?ου/μ L 的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、10 μ L 濃度為 80ng/μ L 的片段 prcKL 和6 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段；
[0054]步驟四中質粒PUC18-KL酶切反應體系為20 μ L由IyL濃度為10U/yL的PstΙ、1 μ L 濃度為 ?ου/μ L 的 Kpn 1、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的質粒PUC18-KL和9 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段；
[0055]步驟四中片段prcKR酶切反應體系為20yL由IyL濃度為10U/yL的Pst IUuL濃度為 ?ου/μ L 的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的片段 prcKR 和9 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段；
[0056]步驟六中質粒pUC18-KLKR酶切反應體系為20 μ L由I μ L濃度為10U/ μ L的KpnΙ、2 μ LlOXBuffer Tango、7yL 濃度為 80ng/μ L 的質粒 pUC18_KLKR 和 10 μ L 無菌 ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段；
[0057]步驟六中四環素抗性基因Tet酶切反應體系為20 μ L由IyL濃度為10U/μ L的Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L濃度為80ng/μ L的四環素抗性基因Tet和10 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。
[0058]將步驟二獲得的質粒pUC18-KL轉化至E.coli DH5 α感受態細胞中，然后接種至卡那霉素濃度為50μ g/mL的篩選平板上進行培養，菌落均為陽性菌，挑選陽性菌進行PCR驗證(引物為prcKL-up和prcKL-down)和酶切驗證(限制性內切酶Sac I及Kpn I)。PCR驗證所有泳道均在1340bp左右有清晰條帶，與prcKL基因片段大小相符；酶切驗證中出現兩條清晰的條帶(如圖1所示)，大小分別與質粒pUC18 (2.6kb)和prcKL (1.34kb)相符,說明pUC18-KL質粒構建成功。
[0059]將步驟四獲得的質粒pUC18-KLKR轉化至E.coli DH5 α感受態細胞中，然后接種至卡那霉素濃度為50μ g/mL的篩選平板上進行培養，菌落均為陽性菌，挑選陽性菌進行PCR驗證(引物為prcKR-up和prcKR-down)和酶切驗證(限制性內切酶Kpn I及Pst I)。PCR驗證所有泳道均在1370bp左右有清晰條帶，與prcKR基因片段大小相符；酶切驗證中出現兩條清晰的條帶(如圖2所示),大小分別與質粒pUC18-KL (3.9kb)和prcKR (1.37kb)相符，說明PUC18-KLKR質粒構建成功。
[0060]將步驟六獲得的自殺質粒pYTKLKRT轉化至E.coli DH5 α感受態細胞中，然后接種至四環素濃度為50 μ g/mL、氨節青霉素(Ampicillin)濃度為100 μ g/mL的篩選平板上進行培養，菌落均為陽性菌，挑選陽性菌進行PCR驗證(引物為Tet-up和Tet-down)和酶切驗證(限制性內切酶Kpn I)。PCR驗證所有泳道均在1400bp左右有清晰條帶，與Tet基因片段大小相符；酶切驗證中出現兩條清晰的條帶(如圖3所示)，大小分別與質粒PUC18-KLKR(5.3kb)和Tet (1.4kb)相符，說明pYTKLKRT質粒構建成功。
[0061]將自殺質粒pYTKLKRT轉化至副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)HDl.7細胞中，電轉化條件為電壓1.8kV、細菌生長濃度為A_=0.78，副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) HDl.7經1%甘氨酸處理，米用AEBl電轉緩沖液。[0062]將自殺質粒pYTKLKRT電轉化的副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) HDl.7細胞接種至四環素濃度為50 μ g/mL、氨節青霉素(Ampicillin)濃度為100 μ g/mL的篩選平板上，挑選陽性菌進行培養再將菌液涂布于含有四環素(70 μ g/mL)和氨芐青霉素(IOOpg/mL)的LB平板、37°C過夜培養，平板上有菌落長出；而接種副干酪乳桿菌HDl.7細胞的陰性對照平板上無菌落出現。因為自殺質粒pYTKLKRT在副干酪乳桿菌HDl.7細胞中并不能表達，陽性菌落的出現說明自殺質粒pYTKLKRT中的四環素抗性基因tet已經在副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)HDl.7 細胞中基因融合、表達。
[0063]根據L.paracasei HDl.7 (副干酪乳桿菌HDl.7)中prcK基因兩側的序列、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板設計出能夠擴增包含prcK基因的引物對，然后利用該特異性引物對自殺質粒pYTKLKRT電轉化的陽性副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)HDl.7細胞進行PCR擴增，再將擴增出的片段連接到質粒pUC18上，然后轉化至E.coli DH5a感受態細胞中，然后接種至卡那霉素濃度為50 μ g/mL的篩選平板上進行培養，菌落均為陽性菌，說明自殺質粒pYTKLKRT已經敲除了副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)HDl.7中的prcK基因。挑選陽性菌進行PCR驗證(引物為Tet-up和Tet-down)和酶切驗證(限制性內切酶Kpn I)。PCR驗證所有泳道均在1400bp左右有清晰條帶，與Tet基因片段大小相符；酶切驗證中也有1400bp左右的清晰條帶出現。
【權利要求】
1.一種敲除PrcK基因的自殺質粒pYTKLKRT，其特征在于敲除prcK基因的自殺質粒PYTKLKRT由prcK基因左側片段prcKL、prcK基因右側片段prcKR、四環素抗性基因和質粒PUC18構成；片段prcKL的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；片段prcKR的核酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.上述敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT的構建方法，其特征在于敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT按以下步驟進行構建: 一、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因左側片段prcKL，擴增片段prcKL的上游引物為prcKL-up，prcKL-up的核苷酸序列為5’-CCGGAGCTCTACCTTAATGATTTAGATGCGAGCG-3’，擴增片段prcKL的下游引物為prcKL-down，prcKL-down的核苷酸序列為 5’-GTCGGTACCGATTGTTCCTTCGGTGTGGATGTGT-3’，PCR擴增片段prcKL 的反應體系為 50 μ L由 10 μ L含Mg2+的 5XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUOy L濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 prcKL-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKL_down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增片段prcKL的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性10s、62°C退火15s、72°C延伸1.5min，共30個循環，再72°C延伸IOmin ； 二、用限制性內切酶SacI及Kpn I對質粒pUC18和步驟一獲得的片段prcKL分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I prcKL雙酶切片段、5 4 1質粒？阢18雙酶切片段、2.5“110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，得到質粒pUC18_KL ； 三、以L.paracasei HDl.7基因組DNA為模板PCR擴增prcK基因右側片段prcKR，擴增片段prcKR的上游引物為prcKR-up，prcKR-up的核苷酸序列為5’-GTCGGTACCGGTTTTGCCGTCATCAGCGCACTTG-3’，擴增片段prcKR的下游引物為prcKR-down，prcKR-down的核苷酸序列為 5’-CCGCTGCAGACTAATCAGCTGGACTAAGGTGTAT-3’，PCR擴增片段prcKR 的反應體系為 50 μ L由 10 μ L含Mg2+的 5XPrimeSTAR Buffer、4 μ L濃度各為 2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUOy L濃度為 25ng/ μ L 的 L.paracasei HDl.7 基因組 DNA、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 prcKR-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 prcKR-down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增片段prcKR的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性10s、55°C退火15s、72°C延伸1.5min，共30個循環，再72°C延伸IOmin ； 四、用限制性內切酶PstI及Kpn I對質粒pUC18-KL和步驟三獲得的片段prcKR分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I prcKR雙酶切片段、5 4 1質粒口此18-此雙酶切片段、2.5 4 110父了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16 °C過夜連接，得到質粒pUC18_KLKR ； 五、以pBR322質粒為模板PCR擴增四環素抗性基因Tet，擴增Tet的上游引物為Tet-up, Tet-up 的核苷酸序列為 5’-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3’，擴增 Tet 的下游引物為 Tet-down，Tet-down 的核苷酸序列為 5’ -GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3’，PCR擴增Tet的反應體系為50 μ L由10 μ L含Mg2+的5 X PrimeSTAR Buffer,4 μ L濃度各為2.5mmol/L 的 dNTP MixtureUO μ L 濃度為 25ng/ μ L 的 pBR322 質粒、10 μ L 濃度為 lpmol/μ L 的 Tet-up、10 μ L 濃度為 lpmol/ μ L 的 Tet_down、0.5 μ L 濃度為 2.5U/ μ L 的 PrimeSTARHS DNA聚合酶和5.5 μ L滅菌ddH20組成；PCR擴增Tet的反應條件為98°C預變性3min，98°C變性 10s、46°C退火 15s、72°C延伸 1.5min，共 30 個循環，再 72°C延伸 IOmin ； 六、用限制性內切酶Kpn I對質粒PUC18-KLKR和步驟五獲得的四環素抗性基因Tet分別進行酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切片段，酶連體系為25μ I由16.5μ I四環素抗性基因了6丨酶切片段、5“1質粒口此18-虬10?酶切片段、2.5 4 110\了40嫩Ligase Buffer和I μ I濃度為3U/ μ L的T4DNA連接酶組成，16°C過夜連接，即得到敲除prcK基因的自殺質粒 pYTKLKRT。
3.根據權利要求2所述的敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT的構建方法，其特征在于步驟二中質粒PUC18酶切反應體系為20μ L由I μ L濃度為10U/yL的Sac 1、lyL濃度為 lOU/μ L 的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的質粒 pUC18 和 9 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。
4.根據權利要求2所述的敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT的構建方法，其特征在于步驟二中片段prcKL酶切反應體系為20μ L由I μ L濃度為10U/yL的Sac 1、lyL濃度為 lOU/μ L 的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、10 μ L 濃度為 80ng/μ L 的片段 prcKL 和 6 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。
5.根據權利要求2所述的敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT的構建方法，其特征在于步驟四中質粒PUC18-KL酶切反應體系為20yL由I μ L濃度為10U/yL的Pst IUuL濃度為 lOU/μ L 的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的質粒 pUC18_KL和9 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。
6.根據權利要求2所述的敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT的構建方法，其特征在于步驟四中片段prcKR酶切反應體系為20μ L由I μ L濃度為lOU/yL的Pst 1、lyL濃度為 lOU/μ L 的 Kpn Ι、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/μ L 的片段 prcKR 和 9 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。`
7.根據權利要求2所述的敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT的構建方法，其特征在于步驟六中質粒PUC18-KLKR酶`切反應體系為20yL由I μ L濃度為10U/yL的Kpn 1、2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L 濃度為 80ng/ μ L 的質粒 pUC18_KLKR 和 10 μ L 無菌 ddH20 組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。
8.根據權利要求2所述的敲除prcK基因的自殺質粒pYTKLKRT的構建方法，其特征在于步驟六中四環素抗性基因Tet酶切反應體系為20μ L由I μ L濃度為10U/μ L的Kpn 1、`2 μ LlOXBuffer Tango、7 μ L濃度為80ng/ μ L的四環素抗性基因Tet和10 μ L無菌ddH20組成；37°C恒溫酶切2h，并用酶切產物膠回收酶切片段。
【文檔編號】C12N15/66GK103614408SQ201310572458
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】葛菁萍, 王洋, 由田, 平文祥 申請人:黑龍江大學