專利名稱：木聚糖酶的基因、質粒、菌株及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種耐高溫耐強堿的木聚糖酶的基因、生產 菌株及該基因編碼的木聚糖酶在紙漿漂白的應用。
背景技術：
造紙工業是支撐我國國民經濟的重要產業之一，但也是我國重要的工業污染源之 一。這是因為目前制漿造紙工業仍主要采用硫酸鹽法制漿和氯漂技術，含氯漂劑是造紙工 業中普遍使用的漂白劑。長期以來，人們一直認為氯是紙漿漂白中最經濟有效的漂白劑。但 在傳統的氯漂工藝中，漂白廢水中含有大量對人體有害的物質，其中以二噁英為代表的有 機氯化物對環境的危害尤為嚴重，它們具有強致癌作用，帶來了嚴重的環境污染。隨著全世 界范圍內對紙和紙板不斷增加的需求和越來越嚴的造紙廢液排放的要求，加劇了漂白工藝 向少氯和無氯漂白的方向發展。在1986年國際紙漿造紙工業生物技術研討會上，芬蘭科學家Viikari等首次報道 應用木聚糖酶處理漿料能改善其漂白性能，減少氯氣使用用量，提高紙漿白度的。隨后多項 實驗證實木聚糖酶用于紙漿預漂能有效降低漂白化學用品的消耗量，提高紙漿強度。為了 獲得最佳助漂效果，從微生物中提取的木聚糖酶要求無或低纖維素酶活活性，因為纖維素 酶活性會造成紙漿中纖維素的損失，降低紙漿的質量和增加排放物的處理成本。制漿之后及在用木聚糖酶處理紙漿之前，紙漿處于大約高溫(55_70°C )及在高堿 性PH下(pH9-ll)。高溫和堿性狀態對木聚糖酶制劑提出了嚴格的要求。許多可商購的野 生型木聚糖酶的缺點是這些酶呈現酸性的最佳PH及大約55°C的最佳溫度。如用這些木聚 糖酶進行漂白，紙漿必須酸化為使用的特異性木聚糖酶最佳PH相近的pH。另外，熱紙漿必 須冷卻至接近選擇的木聚糖酶的酶活性的最佳溫度。針對木聚糖酶處理而降低紙漿溫度降 低了隨后化學漂白的效力，而酸化紙漿也需要使用大量酸。另外，加入酸產生侵蝕，對反應 塔提出了新的要求。因此在接近紙漿原漂白條件的溫度和PH條件下活性最佳的木聚糖酶 在紙漿生產中最為理想。200610037416. 6號中國專利申請公開了一種高效表達木聚糖酶基因的方法及在 紙漿漂白工藝中的應用。該專利申請中的木聚糖酶的酶活為526IU/mL，在75°C、pH9. 0時 的半衰期為45分鐘。該木聚糖酶雖然在一定程度上能耐高溫和耐堿，但高溫高堿的條件下 半衰期短，不能滿足紙漿漂白工藝中處理時間1-1. 5小時的要求。
發明內容
本發明的目的之一在于解決現有技術的不足之處而提供一種能夠編碼耐高溫、耐 堿、高效穩定的木聚糖酶的基因。本發明目的可以通過以下技術措施實現一種木聚糖酶的基因，所述的木聚糖酶 基因xyn的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1所示。Gashaw Mamo 等在 2006 年首次克隆了嗜鹽芽孢桿菌(Bcillus halodurans S7)的木聚糖酶A(xyn)基因，并將其在大腸桿菌中成功表達；同年他們報道了其主要的酶學性 質，發現該木聚糖酶具有耐熱性、耐堿性，且不含纖維素酶活，可能具有應用于造紙工業的 理想特性。但此后并沒有看到關于該酶應用于生產的報道。其原因可能在于，其一，在原始 菌株的表達量低；其二，盡管Gashaw Mamo等將其基因在大腸桿菌中表達，但表達的酶活相 對較低，分泌的酶活為5. lU/mL，該酶不能完全分泌，有部分分布在在胞內及周質空間而且 表達量不高，提取酶時必須進行破壁處理，因而限制了其作為工業用酶制劑的進一步開發。本發明采用密碼子優化、基因全合成等方法，實現對S7_Xyn(嗜鹽芽孢桿菌S7 的木聚糖酶A)基因的分子改造和人工組建，得到一種能夠高效表達木聚糖酶的基因。發 明人根據美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上公布的 S7-xyn基因序列，對序列進行優化，替換成畢赤酵母偏好的密碼子，再將優化后的基因序列 用 DNAW0RKS 軟件(http://mcll. ncifcrf. gov/lukowski. html)，設計全基因合成的引物， 設計了 34 條引物，采用兩步法(PCR-base two-step DNA synthesis PTDS)合成 S7_xyn 基 因序列，得到的木聚糖酶基因的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1所示。本發明的另一目的在于提供一個攜帶3個拷貝S7-Xyn的畢赤酵母分泌表達 重組載體pPICZ α A-(XYN) 3。通過在商用畢赤酵母分泌表達載體pPICZ α A中連續三次 連入S7-Xyn的表達盒，構成重組質粒pPICZaA-(XYN)3。攜帶該木聚糖酶基因的菌株 Escherichia coli TOPlO/pPICZ α A-(XYN)3已于2010年7月26日在中國典型培養物保藏 中心保藏，保藏號為CCTCC NO =M 2010186。保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(430072)。重組質粒pPICZ α A-(XYN)3可以通過以下技術措施實現(1)采用第一個發明目的所述方法全基因合成S7-xyn時，在上游和下游已分別 引入了限制性內切酶EcoRI和NotI酶切位點。因此將全基因PCR產物和畢赤酵母分泌表 達載體PPICZ α A質粒(invitrogen)都用EcoRI和NotI雙酶切，體外連接構建重組質粒 pPICZα A-XYN0(2)外源基因的拷貝數的增加有可能提高木聚糖酶基因S7_Xyn在畢赤巴斯德酵 母中的表達，因此通過分子克隆，在體外以多個表達盒串聯的形式構建得到多拷貝的載體。 根據pPICZ α A載體特點設計了引物克隆含成熟S7木聚糖酶基因及表達調控元件完整的表 達盒(Cassette)，上游引物 Fl 5 ‘-GGAAGATCTAACATCCAAAGACGAMGG-3’，含 Bgl II 酶切位 點(以下劃線示出)以及保護堿基；下游引物Rl 5- ‘GTATAGGATCCGCACAAACGAAGGTCTC-3’ ，含BamH I酶切位點(以下劃線示出)以及保護堿基。Bgl II與BamH I是同尾酶，酶切后 產生相同的粘性末端。以質粒pPICZ α A-XYN為模板，Fl和Rl為引物進行PCR擴增。PCR擴增程序94°C 預變性3min ；94°C變性60s，55°C退火60s，68°C延伸3min，共30個循環；第30個循環68°C 延伸lOmin。將PCR產物用BglII和BamH I雙酶切，質粒pPICZ α A-XYN用BamH I單酶 切，16°C下Τ4連接酶作用下連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌宿主菌(T0P10或DH5ci) 經Zecoin抗性平板篩選陽性轉化子。轉化子提取質粒經雙酶切鑒定后得到構建重組質粒 pPICZ α A-(XYN)20 再將重組質粒 pPICZ α A-(XYN)2 用 BamH I 單酶切，與經 Bgl II 和 BamH I雙酶切后的表達盒再次進行體外連接，可得到重組質粒pPICZ α A- (XYN)30本發明的又一目的在于解決現有技術的不足之處而提供一種能高效表達木聚糖 酶的畢赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ α A-(XYN) 3。
畢赤酵母是甲醇營養型酵母中的一類酵母菌，可以利用甲醇作為唯一碳源和能 源。作為真核表達系統，具有許多其它蛋白表達系統所不具備的優點具有強有力的乙醇氧 化酶(AOXl)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達；酵母生長繁殖速度快、營養要求低、 培養基廉價；外源基因能通過質粒整合到巴斯德畢赤酵母基因組上，外源基因不會發生隨 生長繁殖而丟失；表達量高，許多蛋白可達到每升克級以上；同時，畢赤酵母自身分泌的蛋 白(背景蛋白)非常少，有利于純化。畢赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ α A-(XYN)3可以通過以下技 術措施實現以LiCl法將Sac I線性化的重組質粒pPICZ α A- (XYN) 3轉化畢赤巴斯德酵母 宿主菌GS115或Χ33，轉化物涂布于MD平板，培養2_3天。將MD平板上的轉化子分別接種 于含不同濃度的Zeocin (博萊霉素)抗性YPD平板上，培養3_5天。將高濃度Zeocin-YPD 平板上出現的轉化子挑取其對應的單克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作 為模板，進行酵母基因組PCR鑒定，獲得重組轉化子。重組轉化子先接種于200mL的YPD培養基中，培養至0D600到8_12作為種子液。 培養種子液8-10瓶，然后以5-10%的接種量(體積比)轉接至含20-35L BSM培養基的50L 發酵罐中培養。用25%氨水控制pH為5. 0，通氣約1. 5m7h(25L/min)，培養溫度為28°C。 甘油耗完后再補加5-8L 50% (體積比，1 1)的甘油，至二次甘油消耗完，0D_達280-320 左右，饑餓0. 5-lh后，補料甲醇，甲醇流加速度為30g/L h-60g/L · h，溶氧控制在5-10%, 氨水自動流加，發酵120-140h后結束，發酵液中木聚糖酶酶活為1200U/mL左右。本發明的再一目的在于解決現有技術的不足之處而提供一種木聚糖酶在紙漿漂 白的應用。本發明一種畢赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZ α A-(XYN) 3，由 質粒pPICZ α A-(XYN)3轉化畢赤酵母宿主菌Χ33后得到，所述的基因工程酵母菌Pichia Pastoris X33/pPICZ α A_ (XYN) 3產的木聚糖酶可應用在紙漿漂白。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。本發明的具體實驗方法可以參照分子克隆實驗指南(第三版，冷泉港出版社出 版)以及 Pichia Fermentation Process Guidelines(Invitrogen)0實施例1合成木聚糖酶基因(S7-xyn)嗜鹽芽孢桿菌(B. halodurans S7)內切木聚糖酶的基因S7-xyn的基因序列及蛋 白結構信息來源于美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/) 禾口蛋白數據庫(PDB, http://www. rcsb. org/pdb/search/advSearch. do)。根據NCBI上公布的S7_Xyn基因序列，對序列進行優化，全部替換成畢赤酵母 偏好的密碼子，再將優化后的基因序列用DNAW0RKS軟件(http://mcll.nciferf, rov/ lukowski. html)，設計全基因合成的引物，設計了 34條引物(即依次對應于SEQ ID NO 2 SEQ ID NO 35)，其中第1條引物S7-1和第34條引物分別引入了 EcoRI和NotI酶切位點 以及酶切保護堿基，見表1。表1全基因合成S7-xyn基因的引物名稱_序列(S，一3”_
S7-1ACGGAATTCATGATTACTTTGTTTAAGAAGCCATTTGTTGCTGGTTTGG EcoRl
S7-2CAACGTTACCCAAACCACCACCAACCAACAAAGAAATAGCCAAACCAGCAACAAATGGC
S7-3TGGTGGTTTGGGTAACGTTGCTGCTGCTCAAGGTGGTCCACCAAAGTCTGGTGTTTTTG
S7-4CAAGCAAATGGTTGATCGTTTCTCTTTTGGTTTTCACCAAAAACACCAGACTTTGGTGG
S7-5GAAACGATCAACCATTTGCTTGGCAAGTTGCTTCTTTGTCTGAAAGATACCAAGAACAA
S7-6ATTGGTATGGTTCAACAGCAGCACCAATATCAAATTGTTCTTGGTATCTTTCAGACAAA
S7-7GCTGCTGTTGAACCATACCAATTGGAAGGTAGACAAGCTCAAATTTTGAAGCATCATTA
S7-8TGGCTTCATAGCGTTTTCAGCAACCAAAGAGTTGTAATGATGCTTCAAAATTTGAGCTT
S7-9CTGAAAACGCTATGAAGCCAGTTTCTTTGCAACCAAGAGAAGGTGAATGGAACTGGGAA
S7-10TTATGCTTTCTAGCAAATTCAACAATCTTATCAGCACCTTCCCAGTTCCATTCACCTTC
S7-11TTGTTGAATTTGCTAGAAAGCATAACATGGAATTGAGATTTCATACTTTGGTTTGGCAT
S7-12TTTTCATCAATAAAAAACCATTCTGGAACTTGAGAATGCCAAACCAAAGTATGAAATCT
S7-13TCCAGAATGGTTTTTTATTGATGAAAACGGTAACAGAATGGTTGATGAAACTGATCCAG
S7-14TTTCCAACAACAATTGCTTGTTAGCCTTTCTCTTTTCTGGATCAGTTTCATCAACCATT
S7-15CTAACAAGCAATTGTTGTTGGAAAGAATGGAAAACCATATTAAGACTGTTGTTGAAAGA
S7-16AACAACATCCCAAGAAGTAACATCATCCTTGTATCTTTCAACAACAGTCTTAATATGGT
S7-17GATGTTACTTCTTGGGATGTTGTTAACGAAGTTATTGATGATGGTGGTGGTTTGAGAGA
S7-18TTAATGTAATCAGTACCAGTAATTTGGTACCATTCAGATTCTCTCAAACCACCACCATC
S7-19CCAAATTACTGGTACTGATTACATTAAGGTTGCTTTTGAAACTGCTAGAAAGTACGGTG
S7-20GTGTTGTAATCGTTAATGTACAACTTAGCTTCTTCACCACCGTACTTTCTAGCAGTTTC
S7-21AGTTGTACATTAACGATTACAACACTGAAGTTCCATCTAAGAGAGATGATTTGTACAAC
S7-22TGGAACACCTTGTTCCAACAAATCCTTAACCAAGTTGTACAAATCATCTCTCTTAGATG
S7-23TTGTTGGAACAAGGTGTTCCAATTGATGGTGTTGGTCATCAATCTCATATTCAAATTGG
S7-24AAAGAAGCTCTAGTATCTTCAATAGATGGCCAACCAATTTGAATATGAGATTGATGACC
S7-25ATCTATTGAAGATACTAGAGCTTCTTTTGAAAAGTTTACTTCTTTGGGTTTGGATAACC
S7-26CAACCGTACAAAGACATATCCAATTCAGTAACTTGGTTATCCAAACCCAAAGAAGTAAA
S7-27TTGGATATGTCTTTGTACGGTTGGCCACCAACTGGTGCTTACACTTCTTACGATGATAT
S7-28TCTATCAGCTTGAGCTTGAAACAATTCTTCTGGAATATCATCGTAAGAAGTGTAAGCAC
S7-29TGTTTCAAGCTCAAGCTGATAGATACGATCAATTGTTTGAATTGTACGAAGAATTGTCT
S7-30CAATACCCCAAAAAGTAACAGAAGAAATAGTAGCAGACAATTCTTCGTACAATTCAAAC
S7-31TCTTCTGTTACTTTTTGGGGTATTGCTGATAACCATACTTGGTTGGATGATAGAGCTAG
S7-32AATGGAGCATCAACACCAACACCGTTGTTGTATTCTCTAGCTCTATCATCCAACCAAGT
S7-33TGTTGGTGTTGATGCTCCATTTGTTTTTGATCATAACTACAGAGTTAAGCCAGCTTACT
S7-34CAT GCGGCCGCTTAATCAATAATTCTCCAGTAAGCTGGCTTAACTCTGT-3 Notl_本發明采用兩步法(PCR-basetwo-step DNA synthesis PTDS)合成 S7_xyn 基因 序列.1.第一步 PCR 反應將34條引物分3組，其中合成片段1的引物為(S7-1-S7-12)、合成片段2的引物
為(S7-13-S7-24)、片段3的引物為(S7_25_S7_34)進行無模板PCR擴增反應。PCR擴增反應程序為94°C預變性2min ；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸
2min，共30個循環；第30個循環72°C延伸lOmin，PCR產物用凝膠電泳鑒定后存于_20°C備用。2.第二步 PCR 反應以第一步PCR反應得到的三段片段為模板，以S7-1和S7-34引物進行第二輪PCR
反應，PCR擴增反應程序為94°C預變性3min ；94°C變性45s，55°C退火min，72°C延伸2min，
共30個循環；第30個循環72°C延伸lOmin，PCR產物用凝膠電泳鑒定后存于-20°C備用。
將PCR產物測序確認得到所需DNA，如SEQ ID NO 1所示
6
ATGATTACTTTGTTTMGMGCCATTTGTTGCTGGTTTGGCTATTTCTTTGTTGGTTGGT60
GGTGGTTTGGGTMCGTTGCTGCTGCTCMGGTGGTCCACCAMGTCTGGTGTTTTTGGT120
GAAMCCAMAGAGAAACGATCMCCATTTGCTTGGCMGTTGCTTCTTTGTCTGAMGA180
TACCMGMCAATTTGATATTGGTGCTGCTGTTGAACCATACCAATTGGAAGGTAGACAA240
GCTCAMTTTTGMGCATCATTACMCTCTTTGGTTGCTGAAMCGCTATGMGCCAGTT300
TCTTTGCMCCMGAGMGGTGMTGGMCTGGGAAGGTGCTGATMGATTGTTGMTTT360
GCTAGAAAGCATMCATGGAATTGAGATTTCATACTTTGGTTTGGCATTCTCMGTTCCA420
GAATGGTTTTTTATTGATGAAMCGGTMCAGMTGGTTGATGAMCTGATCCAGAAMG480
AGAMGGCTAACMGCMTTGTTGTTGGMAGMTGGAMACCATATTMGACTGTTGTT540
GAMGATACAAGGATGATGTTACTTCTTGGGATGTTGTTAACGAAGTTATTGATGATGGT600
GGTGGTTTGAGAGMTCTGAATGGTACCMATTACTGGTACTGATTACATTMGGTTGCT660
TTTGAMCTGCTAGAAAGTACGGTGGTGMGMGCTMGTTGTACATTMCGATTACMC720
ACTGMGTTCCATCTAAGAGAGATGATTTGTACMCTTGGTTMGGATTTGTTGGMCAA780
GGTGTTCCMTTGATGGTGTTGGTCATCMTCTCATATTCAMTTGGTTGGCCATCTATT840
GAAGATACTAGAGCTTCTTTTGAAMGTTTACTTCTTTGGGTTTGGATMCCMGTTACT900
GAATTGGATATGTCTTTGTACGGTTGGCCACCMCTGGTGCTTACACTTCTTACGATGAT960
ATTCCAGMGAATTGTTTCAAGCTCAAGCTGATAGATACGATCAATTGTTTGMTTGTAC1020
GMGMTTGTCTGCTACTATTTCTTCTGTTACTTTTTGGGGTATTGCTGATMCCATACT1080
TGGTTGGATGATAGAGCTAGAGMTACMCMCGGTGTTGGTGTTGATGCTCCATTTGTT1140
TTTGATCATAACTACAGAGTTMGCCAGCTTACTGGAGMTTATTGATTAA1191結果表明合成的基因片段全長1191bp，與擬合成的S7-xyn優化后的序列一致，且 讀碼框正確。采用兩步PCR方法可以快速地合成目的基因，且錯誤率低。根據測序結果，將 優化后的基因序列與原始序列在NCBI上進行比對，同源性是80%。本發明提供的基因序列也可以通過專門的生物技術公司或機構使用全自動合成 儀合成。實施例2制備含3拷貝的S7-xyn基因的質粒將實施例1得到的PCR產物電泳，切膠回收約1200bp處的目的條帶，回收產物經 EcoRI和NotI雙酶切處理，與同樣經EcoRI和NotI雙酶切、膠回收的表達載體pPICZ α A用 T4DNA連接酶連接。10 μ L體積反應體系如下=PPICZaAlyL(SOng),加入全合成基因產物 6 μ L，含 ATP 的 IOXBuffer 1 μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L，用 ddH20 補足至 10 μ L。稍加離心， 16°C水浴連接過夜，并轉化Ε. coli ToplO中，在含有Zeocin (博萊霉素，25 μ g/mL)的LB 平板上篩選陽性轉化子。隨機挑取一定量的轉化子，小量制備質粒，經限制性內切酶EcoRI 和NotI雙酶切處理后，進行電泳分析。成功連接目的基因的質粒經酶切后，預計可得到 1200bp，和3. 5kb兩個片段，質粒酶切鑒定正確。將重組質粒測序，證實木聚糖酶S7-Xyn基 因編碼框完全正確。將重組質粒命名為pPICZ a A-XYN重組質粒。根據pPICZ a A載體特點設計了引物克隆含成熟S7木聚糖酶基因及表達調控元件 完整的表達盒(Cassette)，上游引物Fl 5 ‘-GGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG-3’，含 BgI II 酶切位點(以下劃線示出)以及保護堿基；下游引物Rl 5-GTATAGGATCCGCACAAACGAAGGTCT C-3’，含BamH I酶切位點(以下劃線示出)以及保護堿基。
以質粒pPICZ α A-XYN為模板，Fl和Rl為引物進行PCR擴增。PCR擴增程序94°C 預變性3min ；94°C變性60s，55°C退火60s，68°C延伸3min，共30個循環；第30個循環68°C 延伸lOmin。將PCR產物用Bgl II和BamH I雙酶切，質粒pPICZ α A-XYN用BamH I單酶 切，16°C下Τ4連接酶作用下連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌宿主菌(T0P10或DH5ci) 經Zecoin抗性平板篩選陽性轉化子。轉化子提取質粒經雙酶切鑒定后得到構建重組質粒 pPICZ α A- (XYN)20 再將重組質粒 pPICZ α A- (XYN) 2 用 BamH I 單酶切，與經 Bgl II 和 BamH I 雙酶切后的表達盒再次進行體外連接，可得到重組質粒pPICZ α A" (XYN) 3。實施例3木聚糖酶S7-Xyn在畢赤酵母中的高效表達通過LiCl法將經Sac I酶線性化完全的實施例2的pPICZ α A_ (XYN)3轉化Pichia pastoris X33。轉化物涂布MD平板，30°C培養2天。將MD平板上的轉化子分別接種于含 Zeocin 100 μ g/mL, 200 μ g/mL, 300 μ g/mL, 400 μ g/mL, 500 μ g/mL 的 YPD 平板上，30°C培養 3天。將較高濃度Zeocin-YPD平板上出現的轉化子挑取單克隆。按Invitrogen操作指南 提取酵母基因組DNA作為模板，利用目的基因序列的PCR引物進行酵母基因組PCR鑒定，總 反應體積為20 μ L，Taq酶量為2U，取2 μ LPCR產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的重組轉化子X33/pPICZ α A-(XYN)3先接種于200mL的YPD培養基中， 培養至OD6tltl到10作為種子液。培養種子液8瓶，然后以5%的接種量(體積比)轉接至含 30L BSM培養基的50L發酵罐中培養，甘油耗完后再補加6L 50% (質量體積比)的甘油， 至二次甘油消耗完，OD600達300，饑餓半小時后，補料甲醇，甲醇流加速度為50g/L · h，溶氧 控制在5-10%，氨水自動流加，發酵120h后結束。發酵液經3000rpm離心后收集上清，上清 測定木聚糖酶酶活為1200U/L。該上清可直接作為木聚糖酶液應用于后續的麥草漿漂白預 處理。酶活的測定原理木聚糖酶在一定條件下水解底物木聚糖，生成木糖等醛糖，醛糖 與3，5-二硝基水楊酸共熱產生棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內還原糖的量和含有呈 色氨基化合物的反應液顏色深淺成正比，在540nm下測其吸光度，從而計算出木聚糖酶酶 活。酶活的測定方法酶液加蒸餾水稀釋至適當的稀釋倍數，取0. 5mL于25mL比色管， 加入ImL 樺木木聚糖，pH7. 0，50°C下準確反應30min，立即拿出流水冷卻后，加入3. OmL DNS，沸水浴5分鐘后定容至25mL，在540nm下測定其吸光度，根據被測液的吸光度，由木糖 標準曲線計算樣品中的總還原糖的濃度，計算木聚糖酶活。DNS試劑配置方法用400mL蒸餾水溶解6. 3g 3，5_ 二硝基水楊酸，逐步加入21g氫氧化鈉，再加入 185g四水合酒石酸鉀鈉、5. Og苯酚、5. Og無水亞硫酸鈉，溫水浴(不超過48°C )，不斷攪拌， 直至溶液清澈透明。用蒸餾水定容至IOOOmL,保存在棕色瓶中，與二氧化碳隔絕，靜置5 7天后使用，貯存期為6個月酶活力的定義為在50°C、pH7. 5的條件下，每分鐘從的木聚糖溶液中降解釋 放1 μ mol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位。實施例4 S7-xyn木聚糖酶的酶學性質本實施例采用的S7_Xyn木聚糖酶為實施例3的發酵后上清液。1、S7-xyn木聚糖酶的最適 pH值和最適溫度
使用不同pH緩沖液(3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0,12. 0) (pH 彡 8. 0
用磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液，PH > 8. 0用甘氨酸氫氧化鈉溶液)分別配制1 %樺木木 聚糖底物溶液及稀釋S7-Xyn木聚糖酶液，測定木聚糖酶在各種不同pH值下的相對酶活。 S7-xyn木聚糖酶最適作用pH值為9. 0，pH6. 0 10. 0范圍內相對酶活維持在90%以上；當 pH< 5.0或> 10.0后，S7-xyn木聚糖酶的酶活降到60%以下。在451、501、551、601、651、701、751、801、851，？冊.0或？!110.0 的條件下 測定S7-Xyn木聚糖酶的相對酶活。在ρΗΙΟ.Ο下，最適作用溫度為70°C，pH9.0下，最適作 用溫度為75°C。在60°C 80°C范圍內，酶活均能維持在85%以上的，即使pH10. 0條件，溫 度為80°C時，相對酶活仍保持在60%以上。2、S7-xyn木聚糖酶的耐熱性及耐堿性將S7-xyn木聚糖酶分別在60°C、65°C及70°C的水浴鍋中保溫，每隔30min時間 取樣，在最適溫度75°C和最適pH9. 0下測定S7-Xyn木聚糖酶活的熱穩定性。S7_Xyn木 聚糖酶在60°C、65及70°C保溫Ih后，木聚糖酶活性都可以維持在80%以上；60°C及65°C 時、S7-xyn半衰期為6h以上(6h時，活力仍保留60% )，70°C條件下，S7-xyn半衰期長達 2. 5h(3h時，酶活力保持在40% )0S7-xyn 木聚糖酶分別被不同 pH 緩沖液(ρΗ3· 0、ρΗ4· 0、ρΗ5. 0、ρΗ6. 0、ρΗ7. 0、 ρΗ8· 0、ρΗ9· 0、ρΗ10· 0、ρΗ11· 0、ρΗ12· 0)處理 12h 后，然后在最適溫度 75°C和最適 ρΗ9. 0 條 件下測定相對酶活變化。經上述處理后，相對酶活均能維持75%以上，而pH9. 0 pH12. 0 時，相對酶活為最大酶活80%以上，S7-Xyn木聚糖酶適合在堿性條件下作用。3、木聚糖酶的底物專一性S7_Xyn木聚糖酶對不同來源的木聚糖表現不同的酶活性，對燕麥木聚糖的水解能 力比樺木木聚糖強，特別是對sigma木聚糖的水解酶活比樺木木聚糖高35%。對不同來 源的燕麥木聚糖也表現出不同的水解酶活，對sigma木聚糖的水解酶活比Fluka木聚糖高 15. 1%。S7-Xyn木聚糖酶對羧甲基纖維素、蔗糖和淀粉作用時沒有酶活性，說明S7_Xyn無 纖維素酶活性實施例5 S7-xyn木聚糖酶在麥草漿ECF和TCF漂白中的應用本實施例采用的S7_Xyn木聚糖酶為實施例3的發酵后上清液。在傳統的氯漂工藝中，漂白廢水中含有大量對人體有害的物質，其中以二噁英為 代表的有機氯化物對環境的危害尤為嚴重，它們具有強致癌作用，造成了嚴重的環境污染。 用Cio2取代氯氣漂白會大大降低漂白廢水中的氯化有機化合物含量，這就是通常所說的無 元素氯(ECF)漂白技術。全無氯漂白(TCF)是指不用任何含氯漂劑而用H2O2、臭氧及過醋 酸等含氧化學藥品對漿樣進行漂白，在整個過程造成的污染小。以氧脫木素和過氧化氫漂 白為主的全無氯漂白(TCF)技術和以二氧化氯漂白為主的無元素氯漂白技術(ECF)，是近 期我國紙漿清潔漂白技術研發和推廣的重點技術。使用木聚糖酶對麥草漿預處理，可以使漿樣中的發色基團、木聚糖、木素碳水化合 物復合體結構等可以發生一定程度的變化，從而使紙漿中殘余木素或發色物質在后續的 ECF和TCF漂白工序中更容易除去，以達提高紙漿白度和物理性能、節約后續漂白劑的用 量，降低成本以及減輕漂白廢水對環境的污染負荷等目的。本實施例考察了重組S7-Xyn木 聚糖酶在麥草漿ECF和TCF漂白中的應用。
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1、S7-xyn木聚糖酶處理對麥草漿DEpP漂白的影響在麥草漿ECF漂白中，選用DEpP漂白工序D (ClO2漂白)，Ep (H2O2強化堿抽提)， P(H2O2漂白)。在ClO2漂白前利用S7-xyn木聚糖酶對麥草漿進行預處理(Xs7DEpP)后，有利 于提高DEpP漂白后的最終白度和物理性能經S7-xyn木聚糖酶處理后，最終白度由處理前 的79. 8% ISO提高到了 81. 9% ISO,比未經過預處理提高了 2. 1% ISO ；抗張指數、撕裂指 數以及耐破度方面均有改善。而且加入S7-xyn木聚糖酶預處理同時減少10% ClO2時，漂 白后麥草漿的性能能達到未經酶處理的所有指標并有所提升(表2)。表2 S7-xyn木聚糖酶處理對麥草漿DEpP漂白的影響
權利要求
一種木聚糖酶的基因，其特征在于，所述的木聚糖酶基因xyn的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一種含有權利要求1所述的木聚糖酶基因的質粒PPICZ α A- (XYN) 3，是將基因xyn串 聯為3個拷貝，連入畢赤酵母分泌表達載體pPICZ α A中，構成重組質粒pPICZ α A_ (XYN) 3 ； 攜帶該木聚糖酶基因的菌株Escherichia coliTOPlO/pPICZ α A_ (XYN) 3的保藏號為CCTCC M 2010186。
3.一種含有權利要求2所述質粒的畢赤酵母基因工程菌株Pichia PastorisX33/ pPICZ α A- (XYN)3,由質粒 pPICZ α A-(XYN) 3 轉化畢赤酵母宿主菌 Pichia Pastoris X33 后 得到。
4.權利要求3所述的基因工程酵母菌產的木聚糖酶在紙漿漂白的應用。
全文摘要
本發明提供一種耐高溫耐強堿、高效穩定的木聚糖酶的基因、表達載體、生產菌株及其在紙漿漂白的用途。本發明提供的木聚糖酶基因利用密碼子優化、多拷貝技術實現在畢赤酵母中的高表達；表達的木聚糖酶無纖維素酶活性，具有耐高溫、耐高堿性質；該木聚糖酶可應用于麥草漿漂白應用于無元素氯(ECF)漂白工序，節省二氧化氯10％；應用于過氧化氫(OP)漂白工序，節省過氧化氫10％。
文檔編號C12R1/84GK101955958SQ201010256129
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月17日 優先權日2010年8月17日
發明者廖超登, 林小瓊, 林影, 鄭穗平, 韓雙艷 申請人:華南理工大學