穩定表達雞白介素10蛋白的細胞系及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了穩定表達雞白介素10蛋白的細胞系及其構建方法和應用。本發明將去信號肽的雞白介素10編碼基因定向克隆于含有新霉素抗性基因的真核表達載體中，獲得重組質粒并將其轉染中國倉鼠卵巢細胞系CHO-K1細胞，經G418加壓篩選、純化、獲得穩定、高效表達chIL-10蛋白的細胞系CHO-chIL-10M，其微生物保藏號是CGMCC?NO.7659。本發明所構建的細胞系CHO-chIL-10M在制備重組雞白介素10蛋白以及雞白介素10單克隆抗體等方面有廣泛的應用前景。
【專利說明】穩定表達雞白介素10蛋白的細胞系及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株表達重組雞白介素的細胞系，尤其涉及一株穩定表達雞白介素10融合蛋白的細胞系，本發明進一步涉及該細胞系的構建方法及其應用，屬于重組雞白介素10蛋白的制備領域。 【背景技術】
[0002]白細胞介素簡稱白介素，是由白細胞產生的、介導細胞間相互作用的細胞因子，在細胞的活化、增殖和分化中起調節作用。隨著分子生物學的發展，有關雞白介素基因和功能的研究已逐漸成為熱點，迄今為止，已從雞中分離出多種白介素，例如:IL-l、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18等，這些白介素能夠應用于免疫治療劑、免疫增強劑、構建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等細胞因子增強或調節機體的非特異性免疫，不僅會有效防控畜禽疾病，還能在畜牧業生產中產生巨大的經濟效益。
[0003]現有的制備重組雞白介素10蛋白的基因工程方法不同程度的存在著表達效率較低、表達不穩定等缺陷，有待改進。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是提供一株穩定表達雞白介素10蛋白的細胞系；
[0005]本發明的目的之二是提供構建所述穩定表達雞白介素10蛋白的細胞系的方法；
[0006]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0007]本發明分別擴增雞chIL-10全部編碼基因(euchIL-10F)和雞去信號肽編碼基因(euchIL-ΙΟΜ),分別定向克隆于含有報告基因eGFP和新霉素抗性基因(neo)的真核表達載體pEGFP-Nl中，經酶切及測序鑒定，獲得重組質粒Nl-euchIL-10F和Nl-euchIL_10M。本發明將獲得的重組質粒Nl-euchIL-10F和Nl-euchlL-lOM分別轉染中國倉鼠卵巢細胞系CH0-K1細胞，經G418加壓篩選、純化，獲得表達chIL-10蛋白的細胞系CH0-chIL-10M和CH0-chIL-1OFο CHO-chlL-lOM和CH0-chIL-10F細胞系經過連續2次單克隆純化，傳代培養至第26代，在FITC濾光通道下，CHO-chlL-lOM仍能夠觀察到報告基因eGFP蛋白激發的強綠色熒光，而CHO-chlL-lOF熒光較弱；實驗結果表明2種重組真核表達質粒都能在CH0-K1細胞中表達重組雞白介素10蛋白，但是細胞系CHO-chlL-lOM表達重組雞白介素10蛋白的表達效率要遠遠高于CHO-chlL-lOF表達重組雞白介素10蛋白的表達效率，且細胞系CHO-chlL-lOM表達重組雞白介素10蛋白的穩定性要遠遠優于CH0-chIL-10F的穩定性。
[0008]RT-PCR鑒定結果表明，chIL-10全部編碼基因(euchIL-10F)和雞去信號肽編碼基因(euchIL-ΙΟΜ)分別在CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M細胞系中獲得穩定表達，但是CHO-chlL-lOM細胞系中雞去信號肽編碼基因的的表達強度是CHO-chlL-lOF細胞系中chIL-10全部編碼基因的4-6倍左右。
[0009]Western blot檢測結果顯示，chIL-10全部編碼基因(euchlL-lOF)和雞去信號肽編碼基因(euchIL-ΙΟΜ)均在細胞中得到正確表達，但是CH0-chIL-10M細胞系中雞去信號肽的白介素10編碼基因的表達量要遠遠高于CHO-ChIL-1OF中雞白介素10全部編碼基因的表達量。
[0010]IFA檢測結果表明，鼠抗Ch IL-10血清與細胞系CH0_ch IL-1OF和CH0_ch IL-1OM均呈現特異性紅色熒光，而兔抗chIL-10血清不與任何細胞株反應。
[0011]有無信號肽對IL家族成員體外表達的效果是事先難以預期的。李行(李行，穩定表達雞IL-18蛋白細胞系的建立及雞IL-18單克隆抗體的制備，2012，碩士論文)研究發現，在其它條件相同情況下，與不含信號肽相比，雞IL-18有信號肽會明顯促進其體外表達的效率或表達量；本發明的實驗非常意外的發現，將雞IL-18的信號肽去掉后，其在細胞中的表達效率或表達量要遠遠高出雞白介素10全長基因的表達效率或表達量。
[0012]鑒于CHO-chlL-lOM細胞系中雞去信號肽的白介素10編碼基因的表達量或表達效率遠遠高于CHO-chlL-lOF中雞白介素10全部編碼基因的表達量或表達效率，本發明將細胞系CHO-chlL-lOM提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為=CGMCCN0.7659 ;分類命名為:中國倉鼠卵巢細胞系。保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2013年5月29日:保藏地址:中國北京朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；
[0013]本發明所構建的細胞系CHO-chlL-lOM能夠高效、穩定的表達重組雞白介素10蛋白，在制備重組雞白介素10蛋白以及雞白介素10單克隆抗體等方面有廣泛的應用前景。
[0014]本發明涉及到術語
[0015]術語“多核苷酸”或“基因”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述 類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J.Bio1.Chem.260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。
[0016]術語“報告基因”是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選得到轉化體。
[0017]術語“宿主細胞”意指包含本發明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。
[0018]術語“轉化”:將異源性DNA序列引入到宿主細胞或有機體的方法。
[0019]術語“表達”:內源性基因或轉基因在細胞中的轉錄和/或翻譯。
[0020]術語“編碼序列”:轉錄成RNA的核酸序列。[0021]術語“真核表達載體”:一種或多種用于實現真核生物轉化的DNA載體，包含真核細胞轉錄和翻譯所需的調控元件，如啟動子、多聚A加尾信號等；此外，還可以有選擇標記基因、目的基因以及真核細胞能夠識別的復制位點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1G418加壓篩選12d抗性集落的形成(F1，100X)。
[0023]圖2轉染24h后共聚焦顯微鏡掃描圖。
[0024]圖3chIL_10基因在CHO-Kl細胞中穩定表達(100X)的結果。
[0025]圖4 穩定表達 chlL-lOCHO 細胞株的 RT-PCR 鑒定；1: CHO-chlL-lOF ;2: CH0-N1 ；3:CHO ；4:水；5:CH0-chIL-10M ；M:DNA 分子質量標準。
[0026]圖5穩定表達chILlO融合蛋白的CHO細胞株Western blot分析；1:CH0-N1 ;2:CHO ；3:CH0-chIL-10F ;4:CH0-chIL_10M ；5:pET-chIL-10 ；M:DNA 分子質量標準；A:兔抗chIL-10血清;B:鼠源抗GFP標簽單抗；C:鼠抗chIL-10血清。
[0027]圖6 穩定表達 chIL-10 的 CHO 細胞株 IFA 鑒定(100X) ;A: CHO-chlL-lOF ；B:CHO-chlL-lOM ;C:CH0-N1 ;D:CH0。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0029]I實驗材料
`[0030]1.1實驗材料
[0031]真核表達質粒載體pEGFP-Nl和CH0-K1細胞由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物組保存；無特定病原體(SPF)雞、清潔級雄性新西蘭兔、BALB/c小鼠由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證編號為SCXK (黑)2011-007。
[0032]1.2主要試劑
[0033]Ex Taq, EcoR 1、Xho 1、Pst I和感受態大腸桿菌DH5 α購自寶生物工程大連有限公司；Lipofectamine?2000轉染試劑購自Invitrogen公司；預染蛋白Marker購自富酶泰斯生物技術(深圳)有限公司；胎牛血清、RPMI 1640、DMEM/F12培養基購自HyClone公司；質粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購自Omega公司；G418硫酸鹽購自Amresco公司；DyLight 594標記的羊抗兔IgG購自EarthOx公司，DyLight 594標記的羊抗鼠IgG購自Jackson公司，IRDye?700DX標記的山羊抗兔IgG和IRDye?700DX標記的山羊抗鼠IgG (1:5000)購自Rockland公司，抗GFP標簽單抗購自Rockland公司；雞淋巴細胞分離液購自BD公司；脂多糖(LPS)和刀豆素A (ConA)購自Invitrogen公司，其它試劑均為國產分析純。
[0034]實施例1穩定表達雞白介素10蛋白細胞系的構建
[0035]1、實驗方法[0036]1.1雞外周血淋巴細胞的分離、培養及總RNA的提取
[0037]無菌翅靜脈采集一只成年SPF雞枸櫞酸鈉抗凝血10mL，按產品說明書用雞淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞。用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養基調整細胞密度到IXlO6 / mL，加入到6孔細胞板培養，并向其中加入終濃度分別為10ug/mL、20ug/mL的LPS和終濃度分別為10ug/mL、25ug/mL、30ug/mL的ConA作為刺激劑，于37°C，5%C02培養箱中培養，每隔4h晃動一次,于不同時間收集細胞。用Trizol Reagents總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，具體方法按說明書進行。 [0038]1.2chIL-10原核表達載體的構建、表達和抗血清的制備
[0039]根據GenBank登錄的chIL_10基因(NM_001004414.2)，設計原核表達引物擴增編碼chIL-10成熟蛋白的基因；
[0040]上游引物序列為:
[0041]proChlLlO-F:5/ ~CGGAATTCTTGGAGCCCACCTGCCTG~3' (EcoR I) (SEQ ID N0.1),
[0042]下游引物序列為:
[0043]proChlLlO-R:5 ' -CCCTCGAGTCACTTCCTCCTCCTCATCAGC-3 ' (Xho I) (SEQ IDN0.2)。
[0044]PCR 反應程序:95°C 5min ；94°C 30s,68.3°C 30s、72°C 30s, 32 個循環；72°C IOmin0以限制性內切酶EcoR I和Xho I對擴增并純化后的目的基因及pET-30a(+)進行雙酶切，酶切產物經膠回收試劑盒純化后用T4DNA Ligase連接，轉化感受態DH5a細胞。用PCR法、限制性內切酶分析及核酸序列測定，鑒定轉化后所得的原核重組表達質粒，命名為pET-chIL-10。將 pET-chIL-10 轉化 Ε.coli BL21 (DE3)，0.lmmol/L IPTG 誘導表達。收集菌體，在冰浴中超聲波破碎，分別收集沉淀和上清，SDS-PAGE分析目的蛋白表達形式。大量誘導表達重組菌，切下目的蛋白所在膠條，研磨，用適量PBS重懸，分別免疫新西蘭兔和BALB/c小鼠，制備兔抗血清和鼠抗血清。
[0045]1.3chIL-10基因真核表達質粒的構建
[0046]根據NM_001004414.2的基因序列，設計2對真核表達引物，分別擴增chIL_10全長(稱為euchIL-10F)和去信號肽(稱為euchIL-ΙΟΜ)序列。
[0047]euchIL-10F的引物序列為:
[0048]euChIL10F-U:5 ' ~CTCGAGACCATGCAGACCTGCTGCCAAG~3 ' (Xho I)(其中 ACC 為Kozak 序列)(SEQ ID N0.3)；
[0049]euChIL10F-L:5/ ~AACTGCAGCTTCCTCCTCCTCATCA~3' (Pst I)(去掉終止密碼子)(SEQ ID N0.4)。
[0050]euchIL-ΙΟΜ的引物序列為:
[0051]euchIL-10M-U:5/ ~CTCGAGGCCATGTTGGAGCCCACCT~3' (XhoI) (SEQ ID N0.5)；
[0052]euchIL-10M-L:5/ ~AACTGCAGCTTCCTCCTCCTCATC~3' (PstI) (SEQ ID N0.6)。
[0053]以Xho I和Pst I對擴增并純化后的目的基因及含有報告基因eGFP的真核表達載體pEGFP-Nl進行雙酶切，酶切產物經膠回收試劑盒純化后用T4DNA Ligase連接，轉化DH5a感受態細胞。用PCR法、限制性內切酶分析及核酸序列測定，鑒定轉化后所得的陽性克隆。用去內毒素小量質粒提取試劑盒從鑒定正確的克隆菌中提取質粒。所得到的真核重組表達質粒分別命名為Nl-chlL-lOF和Nl-chIL-10M。[0054]1.4建立穩定表達chIL-10基因的CHO-Kl細胞系
[0055]將CHO-Kl細胞傳代于96孔細胞板中，待細胞達80%時，加入含有不同濃度(100-1200mg/L)G418和10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，連續培養約2周，確定G418最小細胞致死量。參考試劑盒說明書，利用Lipofectamine?2000轉染CHO-Kl細胞，載體pEGFP-Nl同樣轉染作為陰性對照。24h后用含終濃度800mg/L G418的DMEM/F12完全培養液進行抗性篩選。以有限稀釋法對轉染陽性細胞連續單克隆化；同時建立表達空載體pEGFP-Nl的對照組細胞株(CHO-Nl)。常規胰酶消化，連續傳代培養細胞。
[0056]2實驗結果
[0057]圖1為G418加壓篩選12d抗性集落的形成結果(F1，100X );圖2為轉染24h后共聚焦顯微鏡掃描圖。從圖3的結果可見，CHO-chlL-lOM和CHO-chlL-lOF細胞經過連續2次單克隆純化，傳代培養至第26代，在FITC濾光通道下，CHO-chlL-lOM仍能夠觀察到報告基因eGFP蛋白激發的強綠色熒光，而CHO-chlL-lOF熒光較弱(圖3)，表明2種重組真核表達質粒都能在CH0-K1細胞中進行表達，但報告基因的表達強度或效率存在非常顯著差異，CH0-chIL-1OM的表達效率及表達穩定性要顯著優于CHO-chlL-lOF的表達效率及表達穩定性。實驗結果說明，將雞IL-18的信號肽去掉后，其在細胞中的表達效率或表達量要遠遠高出雞白介素10全長基因的表達效率或表達量。
[0058]實施例2穩定表達雞白介素10蛋白的細胞系的鑒定
[0059]1.實驗方法
[0060]1.1RT-PCR 檢測
[0061]用Trizol Reagents提取試劑盒提取實施例1所構建的CH0-chIL-10F和CH0-chIL-1OM細胞總RNA，具體方法按試劑盒說明書進行。取逆轉錄產物cDNA，經PCR擴增鑒定 chIL-10 基因，反應程序為:95°C 5min ；94°C 30s,64°C 30s,72 °C 40s, 30 個循環；72°C IOmin。
`[0062]1.2IFA 檢測
[0063]將克隆純化后的CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M細胞株以IX IO4個/孔接種于96孔板，以CH0-N1細胞為陰性對照，CH0-K1細胞作為空白對照，分別以制備的chIL-10兔抗血清和鼠抗血清為一抗(I:50),以DyLight 594標記羊抗兔IgG和DyLight 594標記羊抗鼠IgG為二抗(1:200)，進行IFA檢測。
[0064]1.3ffestern blot 檢測
[0065]將CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M細胞用PBS洗滌后收集，用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白。經SDS-PAGE分離后，轉印至PVDF膜，分別以制備的兔抗血清(1:50)、鼠抗血清(1:50)、抗GFP標簽單抗(1:1000)為一抗，以IRDyeTM700DX標記的山羊抗兔IgG和IRDye?700DX標記的山羊抗小鼠IgG(l:5000)為二抗，進行Western blot檢測。利用Odyssey近紅外雙色激光成像系統掃描。同時以空載體轉染的CH0-N1細胞為陰性對照，以CH0-K1細胞作為空白對照。
[0066]2實驗結果
[0067]2.1RT-PCR 鑒定結果
[0068]分別對CH0-chIL-10F、CHO-chlL-lOM、CH0-N1 和 CHO 細胞提取總 RNA。分別用兩對引物 euChIL10F-U/euChIL10F-L 和 euchlL-lOM-U/euchlL-lOM-L 進行 RT-PCR 擴增，結果從CHO-chlL-lOF和CHO-chlL-lOM分別擴增出533bp和473bp的條帶，與全長和去信號肽的chIL-10基因理論大小相一致，而CHO-Nl和CHO均沒有相應的擴增產物，說明目的基因已在細胞中獲得穩定表達(圖4);表達結果表明，去信號肽(稱為euchIL-ΙΟΜ)的chIL-10在體外的表達量大約比chIL-10全長(稱為euchIL-10F)的表達量高出了 4_6倍。
[0069]2.2Western blot 檢測結果
[0070]Western blot檢測結果顯示(圖5),利用GFP特異性單抗和鼠多抗血清分別能在CH0-chIL-10F和CHO-chlL-lOM的蛋白裂解產物中分別檢測到46ku和44ku大小的條帶，符合eGFP基因與chIL-10基因的融合蛋白理論值，但利用兔抗血清沒有檢測到條帶。表明全長和去信號肽的chIL-10基因均在細胞中得到正確表達，但重組蛋白的免疫原性存在兔體和鼠體的種屬差異。
[0071]2.3IFA檢測結果
[0072]IFA檢測結果表明，鼠抗chIL-10血清與CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M均呈現特異性紅色熒光，而兔抗chIL-10血清不與任何細胞株反應(圖6)。
【權利要求】
1.穩定表達雞白介素10蛋白的細胞系CHO-chlL-lOM，其特征在于，其微生物保藏編號為:CGMCC N0.7659。
2.—種構建權利要求1所述細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟:將去信號肽的雞白介素10編碼基因定向克隆于含有新霉素抗性基因的真核表達載體中，獲得重組質粒；將獲得的重組質粒轉染中國倉鼠卵巢細胞系CHO-Kl細胞，經G418加壓篩選、純化、獲得穩定表達chIL-10蛋白的細胞系CH0-chIL-10M。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于:所述的真核表達載體是pEGFP-Nl。
4.權利要求1所述的細胞系在制備重組雞白介素10蛋白中的用途。
5.權 利要求1所述的細胞系在制備雞白介素10單克隆抗體中的用途。
【文檔編號】C12N5/10GK103614340SQ201310572460
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】韓凌霞, 廉傳江, 文輝強, 司昌德, 林歡, 陳洪巖 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所, 哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司