以紅曲菌絲體為原料提取輔酶q10的工藝及生產方法
【專利摘要】本發明涉及以紅曲菌絲體為原料提取輔酶q10的工藝及生產方法，紅曲菌絲體是指用其他不同紅曲霉菌株經固態，或液態發酵方法制備的，提取了紅曲紅色素后的紅曲菌絲體。本發明采用大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵后，產生的紅曲發酵產物，經用60～70％乙醇提取紅曲紅色素后，剩余的紅曲霉菌絲體具有重要的人體細胞也存在的，具有重要保健功能的輔酶Q10成分，該成分通過采用超聲破碎法提取后，輔酶q10的產量可以達到50～100mg/kg，具有重要的工業開發價值。
【專利說明】以紅曲菌絲體為原料提取輔酶q10的工藝及生產方法
[0001]【技術領域】本發明涉及采用紅曲菌絲體為原料提取輔酶qlO的工藝及生產方法。
[0002]【背景技術】
[0003]紅曲在中國已有一千多年的生產、應用歷史，它是生產紅曲酒、紅曲米、功能性紅曲和天然色素的主要菌種。近年來，隨著人們對合成食品添加劑和化學藥物對人體毒副作用的認識，世界各國掀起了食用綠色食品和使用天然藥物的熱潮，紅曲作為藥食兼用的天然制品，引起了極大的關注。自1979年，日本學者遠藤章從紅曲霉(monaseusruber)中發現洛伐他汀生理活性物質后，引起全世界科學家的關注，1980~1990年代紅曲功能性研究達到高峰，紅曲的降血脂、降膽固醇、降血壓、降血糖、抗菌性等功能相繼被發現。美國默克公司開發成功第一個用于臨床的洛伐他汀調血脂藥物，于1987年上市，目前他汀類藥物己成為高血脂、冠心病人的首選藥物，降脂藥已成為世界第二大治療藥物。紅曲目前的生產工藝主要是為提取紅曲紅色素而設計，一般均是選擇優質大米為原料，采用現代生物技術分離出優質的紅曲霉菌，再經液體深層發酵，產生紅曲發酵產物，這些產物經過脫水，壓干等工藝，用60~70 %乙醇提取紅色素，通常這些提取工藝提純紅色素后連紅曲中降血脂成分洛伐他汀也一起提走，剩下的渣留下來的洛伐他汀極少或幾乎沒有，這一生產過程中會產生大量的紅曲菌絲廢渣，這些廢渣一般視為無用廢棄物丟棄掉，這不僅造成了環境的污染，更是對資源的極大浪費。我們在對東莞天益生物科技公司生產的兩批紅曲霉廢渣的檢測中發 現，其廢渣雖然沒有找到能特異性對抗抑制HMC-CoA還原酶活性的洛伐他汀，但紅曲霉廢渣中的還有脂肪酸和多糖類成分，采用這些廢渣進行降血脂和預防骨質疏松的動物實驗，意外發現這些廢渣的提取物也有很好的降血脂作用和預防骨質疏松的作用，我們分別申請了國家發明專利《紅曲渣產品在制備降血脂保健食品方面的應用》，(專利號ZL201010003099.2，授權證書號第1144784)，《紅曲菌絲體提取物在制備預防骨質疏松保健食品及藥品的應用》(專利號ZL201110269850.8，授權證書號第1092336)，已經獲得國家知識產權局的授權。對這些紅曲菌絲體的有效成分的進一步研究，我們發現這些提取了紅曲紅色素之后的菌絲體還含有重要成分輔酶qlO，這在目前所有的研究文獻中均沒有見報道。
[0004]輔酶QlO是一種脂溶性抗氧化劑，是人類生命不可缺少的重要元素之一，能激活人體細胞和細胞能量的營養，具有提高人體免疫力、增強抗氧化、延緩衰老和增強人體活力等功能，醫學上廣泛用于心血管系統疾病，國內外廣泛將其用于營養保健品及食品添加劑。輔酶QlO最早于1957年在美國被發現，1978年英國愛丁堡大學彼得?麥克博士因在研究輔酶QlO與細胞能源關系方面的貢獻獲得諾貝爾獎。二十世紀八十年代初期日本實現了從煙葉中提取茄呢醇為原料合成生產輔酶Q10，至使輔酶QlO成本大幅度下降，這對于輔酶QlO的應用、普及和推廣起到了重要的推動作用。半化學合成法技術上比較成熟，已實現了工業化，產品成本低，價格適中。但是使用半化學合成法生產的產品雖然在價格上有優勢，但在使用上比用生物提取法生產的產品有較大的差距。原因在于生物提取法生產的是天然的、有機的產品，易于被人體吸收轉化，而化學合成法生產的是人工化學合成的有機產品，生物活性極差，不易被人體吸收，難以充分發揮輔酶QlO的藥理作用。關于輔酶QlO化學合成方法一直是國內外研究的熱點，近半個世紀來，發達國家已實現了微生物發酵法生產輔酶Q10，近幾年微生物發酵提取法得到了長足的發展，這種全新的生物工程方法，既綜合了生物提取工藝和化學合成工藝兩種方法的優點，又克服了它們的缺點，因此是最令人矚目的有希望實現工業化的方法。
[0005]目前，輔酶QlO的制備方法主要有3種:提取分離法、化學合成法、生物合成法。提取分離法提取分離法主要從動物肝臟、心肌等和植物含油種籽或嫩芽、嫩葉中提取。據文獻報道.經醇堿皂化法從豬心渣和牛心肌渣中提取輔酶QlO測定含量分別為75mg/kg和73.3mg/kg，通過皂化法提取羅非魚肝臟輔酶QlO的含量為34mg/kg。用10% KOH-甲醇醇堿皂化法提取堿蓬輔酶QlO含量為63mg/kg。用大豆油提取輔酶QlO可以達到90mg/kg。提取法是現代生物工程中較為傳統的生產方法，它的生產成本較高，原料也不易得到，從廢棄材料再利用提取輔酶Q以降低制備成本是目前十分熱門的研究課題。輔酶QlO的化學合成法可分為全化學合成法和半化學合成法2種。全化學合成法是指不以來自煙草等的茄尼醇為原料，完全通過化學方法獲得輔酶QlO側鏈的合成方法。該方法原料價廉易得，產物區域選擇性和立體選擇性高，但是側鏈的構建需要多次耦合，總收率低，難以實現工業化。半化學合成法主要有側鏈直接引入法和側鏈延長法，該方法均需要以天然茄尼醇為關鍵原料合成輔酶Q10，由于精品及純品茄尼醇的價格十分昂貴，造成化學合成輔酶QlO成本高昂，同時具有合成步驟多、副產品多、手性物質分離困難等缺點，因此，化學合成法在工業生產中受到一定限制。生物合成法是利用微生物細胞、植物細胞或動物細胞的生命活動而獲得人們所需物質的技術過程。目前，輔酶QlO的生物合成方法包括利用植物細胞培養和微生物細胞發酵兩種方式。植物細胞培養主要是以煙草組織為材料，通過愈傷誘導、懸浮培養，產生生長速度快、輔酶QlO含量高的煙草懸浮培養細胞。有試驗結果表明，在適合的培養條件下NC89煙草細胞產量和輔酶QlO含量分別為16.653g/L和14.780mg/L。國內從事輔酶QlO植物細胞培養的單位只有少數幾家，也都處于初步研究階段，還沒有進入中試和工業化生產，1977年，日本首次實現了微生物發酵法工業化生產輔酶Q10，應用于產輔酶QlO的主要菌種有光合細菌、土壤桿菌、紅假胞菌、裂殖酵母等。該方法具有原料廉價豐富.產物分離過程相對簡單，不存在手性問題等優點，近年來國內已有部分企業采用該方法生產，并申請了相關專利，例如安徽省豐原藥業集團采用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaeiens)高密度發酵生產輔酶Q10，但是微生物發酵法在開發新的菌株以提高發酵效率、改進后期提純等方面還需要不斷發展。從每種生產方法的特點來看，生物合成法必然是未來發展的主要趨勢，也是當前輔酶QlO生產方法的研究熱`點。
[0006]我們的研究發現，紅曲菌絲體經過我們采用超聲破碎法提取以后，輔酶QlO的含量可以達到50~100mg/kg，與前面提到的豬心渣和牛心肌渣等原料提取方法相比，有十分有利的優勢，是一個很有工業開發價值的新發明。
【發明內容】
[0007]發現采用大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵后，產生的紅曲發酵產物，經用60~70%乙醇提取紅曲紅色素后，剩余的紅曲霉菌絲體具有重要的人體細胞也存在的，具有重要保健功能的輔酶QlO成分，該成分通過采用超聲破碎法提取后，產量可以達到50~100mg/kg，具有重要的工業開發價值。
[0008]本發明提到的可用于提取輔酶QlO的紅曲菌絲體原料可以通過下述方法:方法1:取大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵7到10天后，產生的紅曲霉發酵的液體產物，通過壓榨機把水分壓去，然后，60~70 %乙醇提取紅色素，提取完紅色素的渣，烤干，粉碎為細粉，即可。
[0009]方法2:取大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵7到10天后，產生的紅曲霉發酵的液體產物，通過壓榨機把水分壓去，然后，60~70 %乙醇提取紅色素，提取完紅色素的渣，烤干，按每公斤加入I %的醋酸0.1~0.5升，在25°C室溫下維持24小時以上，按總重量5~8倍加水提取，提取兩次，每次I小時，回收兩次提取液。濃縮為干膏，粉碎為細粉，室溫保存即可。[0010]方法3:取大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵7到10天后，產生的紅曲霉發酵的液體產物，通過壓榨機把水分壓去，然后，60~70 %乙醇提取紅色素，提取完紅色素的渣，烤干，按每公斤加入I %的碳酸氫鈉0.1~0.5升，在25°C室溫下維持24小時以上，按總重量5~8倍加水提取，提取兩次，每次I小時，回收兩次提取液，濃縮為干膏，粉碎為細粉，室溫保存即可。
[0011]方法4:取大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵7到10天后，產生的紅曲霉發酵的液體產物，通過壓榨機把水分壓去，然后，60~70 %乙醇提取紅色素，提取完紅色素的渣，烤干，按總重量5~8倍加水提取，提取兩次，每次I小時，回收兩次提取液。濃縮為干膏，粉碎為細粉，室溫保存即可。
[0012]本發明提到的紅曲菌絲體，也包括用其他不同紅曲霉菌株經固態，或液態發酵方法制備的紅曲菌絲體。
[0013]超聲破碎法從紅曲菌絲體提取輔酶qlO的工藝:稱取上述方法獲得的紅曲菌絲體適量，加入丙酮，冰浴中超聲破碎，6000r/min離心15min (4°C )。取上清液，35°C旋轉蒸發濃縮，再加入50ml石油醚溶解；用超純水60ml洗滌至中性，取石油醚層，加入5g無水硫酸鈉，干燥至液體澄清。過濾，濾液旋轉蒸發儀(37°C )濃縮至干，揮發完全，加入無水乙醇IOml溶解，放-20°C冰箱冷凍析出膽固醇等雜質，過濾，回收乙醇，即得。用HPLC檢測本法提取的輔酶qlO的含量，檢測條件:檢測波長為275nm、進樣量為10 μ 1、柱溫30°C、流動相為甲醇:乙醇(1:1)、流速為lml/min，與標準品比較，用本方法每克紅曲菌絲體提取的輔酶qlO為 80 ~100 μ g,即 80 ~100mg/kg。
[0014]紅曲菌絲體提取輔酶qlO還可采用超臨界CO2萃取工藝進行提取，當萃取溫度300C，萃取壓力22MPa，萃取1.5h，CO2流量4L/h時，紅曲菌絲體提取輔酶qlO提取率也可達到較高的率。
[0015]本發明按上述方法提取的紅曲菌絲體提取物，可作為餅干添加劑加入餅干的生產配方中，生產出含有紅曲菌絲體輔酶qlO的餅干食品或保健食品，供有患有高血脂，骨質疏松疾病的患者作為健康食品應用。在餅干產品的添加量在5~30%范圍，以10~20%為佳。
[0016]本發明按上述方法提取的紅曲菌絲體的輔酶qlO，可作為飲料添加劑加入飲料的配方中，生產出含有紅曲提取物的飲料，供有患有高血脂，骨質疏松疾病的患者作為健康食品應用。在餅干產品的添加量在5~30%范圍，以10~20%為佳。
[0017]【具體實施方式】:
實施例一:[0018]取采用大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵后，產生的紅曲發酵產物，經用60~70%乙醇提取紅曲紅色素后，剩余的紅曲霉菌絲體作為提取輔酶qlO的原料，準確稱取5g菌絲體，加入丙酮，冰浴中超聲破碎，6000r/min離心15min(4°C )。取上清液，35°C旋轉蒸發濃縮，再加入50ml石油醚溶解；用超純水60ml洗漆至中性,取石油醚層,加入5g無水硫酸鈉，干燥至液體澄清。過濾，濾液旋轉蒸發儀(37°C)濃縮至干，揮發完全，加入無水乙醇1Oml溶解，放-20 V冰箱冷凍析出膽固醇等雜質，過濾，回收乙醇，即得。該產品通過HPLC檢測輔酶QlO含量，檢測條件:檢測波長為275nm、進樣量為1Ou1、柱溫30°C、流動相為甲醇:乙醇(1:1)、流速為lml/min。HPLC測定輔酶QlO結果經多次重復，每克紅曲菌絲體可以提取輔酶 Q1080 ~100 μ g,即 80 ~100mg/kg。
實施例二:
[0019]超聲波處理不同振幅對輔酶QlO提取得率的影響:取采用大米等原料用紅曲霉經液體深層發酵后，產生的紅曲發酵產物，經用60~70%乙醇提取紅曲紅色素后，剩余的紅曲霉菌絲體作為提取輔酶qlO的原料，準確稱取5g菌絲體，設為5組，分別探討超聲波細胞破碎的處理條件，超聲波細胞破碎處理條件為:每次輻射時間10s，間歇時間為15s，超聲波工作總時間為lOmin，紅曲菌絲體的量為5g，處理菌液體積為30mL條件下，振幅分別為最大功率的20、40、60、80、100% ;探討最佳的超聲波細胞破碎的不同振幅。后續處理同實施例一，結果見表1:
[0020]表1:超聲振幅對紅曲菌絲體提取液輔酶Ql0的影響
【權利要求】
1. 紅曲菌絲體作為原料提取輔酶qlO的應用。
2.—種以紅曲菌絲體為原料的提取輔酶qlO的工藝和生產方法，其特征是該方法包括以紅曲菌絲體為原料，通過超聲破碎法進行提取。
3.如權利要求2所述的一種以紅曲菌絲體為原料的提取輔酶qlO的工藝和生產方法，其特征是超聲破碎法的提取是以紅曲菌絲體為原料，加入丙酮，超聲破碎，離心，取上清液，35°C旋轉蒸發濃縮，加入石油醚提取；用超純水洗滌至中性，取石油醚層，加入無水硫酸鈉，干燥至液體澄清，過濾，濾液旋轉蒸發儀濃縮至干，加入無水乙醇溶解，放-20°C冰箱冷凍析出膽固醇等雜質，過濾，回收乙醇，即得。
4.如權利要求一所述的紅曲菌絲體作為原料提取輔酶qlO的應用，其特征是紅曲菌絲體提取的輔酶qlO可作為餅干添加劑加入餅干的生產配方中，生產出含有紅曲菌絲體輔酶QlO的餅干食品或保健食品，供有患有高血脂，骨質疏松疾病的患者作為健康食品應用。
5.如權利要求一所述的紅曲菌絲體作為原料提取輔酶qlO的應用，其特征是紅曲菌絲體提取的輔酶qlO可作為飲料添加劑加入飲料的配方中，生產出含有紅曲提取物的飲料，供有患有高血脂，骨質疏松疾病的患者作為健康食品應用。
【文檔編號】A23L1/29GK103613494SQ201310577271
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】吳鐵, 呂思敏, 丁喜生, 崔燎, 孫金影 申請人:廣東醫學院