一種雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的配方的制作方法
【專利摘要】一種雙試劑法測定尿酸試劑盒的配方；將抗壞血酸氧化酶、辣根過氧化物酶及其輔助顯色底物配制在pH6.5～7.0的磷酸鹽緩沖液中為試劑1，將尿酸酶及過氧化物酶顯色底物配制在pH8.0～9.6硼酸-硼砂緩沖液中為試劑2；應用時調節試劑1和試劑2的比例使最終反應體系pH為7.2～7.5以保障顯色產物穩定性，據此混合比例再調節試劑1和試劑2中各種酶及其它有效成分的初始濃度，使各種有效成分在最終反應體系的濃度同時達到要求。這種試劑盒配方使得所用尿酸酶、抗壞血酸氧化酶和過氧化物酶的穩定性都提高而降低成本或延長試劑盒的貨架壽命，并保障分析性能。
【專利說明】一種雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的配方
【技術領域】
[0001]本發明涉及酶法分析測定尿酸含量雙試劑法試劑盒的配方，及其在體液尿酸含量測定中的應用方式。[0002]發明的技術背景
[0003]測定尿酸可用于實驗診斷痛風和腎臟疾病。測定血清尿酸主要用尿酸酶偶聯過氧化物酶反應測定顯色產物吸收。此方法需用尿酸酶催化尿酸完全氧化成尿囊素、過氧化氫和二氧化碳；過氧化物酶催化過氧化氫氧化生色底物形成顯色產物；測定顯色產物吸收，推定過氧化氫量以確定尿酸量。4-氨基安替比林是過氧化物酶偶聯測定常用的生色底物；常用尿酸酶來自真菌或細菌；過氧化物酶常來自辣根。此法需定量測定過氧化氫；樣品中抗壞血酸等還原劑對測定造成負干擾；用抗壞血酸氧化酶先清除樣品中抗壞血酸并測定吸收，再加入尿酸酶反應測定吸收；以兩步吸收之差校正體積因素后定量尿酸，可基本消除抗壞血酸的干擾。應用此類方法的試劑盒需用兩種試劑溶液，一種試劑為1，其含緩沖液、過氧化物酶的輔助生色底物及除了尿酸酶以外的其余酶，包括過氧化物酶和抗壞血酸氧化酶；另一種試劑為2，含尿酸酶、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽和緩沖液；故此類試劑盒配制方法稱雙試劑法。配制時，試劑I和試劑2的pH允許在一定范圍內變化以盡可能保障所用酶的穩定性，但試劑I和試劑2在最終反應體系的混合體積比例取決于各自的pH，以使得最終反應pH處于7.2~7.5之間而獲得穩定的顯色產物，而試劑I和試劑2中的各種酶的濃度則需要據上述混合比例調整以使得最終反應體系中各種酶的活性保持一致；最終反應體系中加入樣品體積占總體積的I~3%。
[0004]尿酸酶的最穩定pH偏堿性且催化活性的最適pH也偏堿，但辣根過氧化物酶等最穩定PH接近7.0且催化活性的最適pH在中性，抗壞血酸氧化酶最穩定pH接近6.5而催化活性的最適pH接近中性。雙試劑法測定尿酸含量時，當兩種試劑混合后的pH在7.2~7.5之間時顯色產物最穩定且吸收測量靈敏度最高。此類雙試劑法測定尿酸含量試劑盒所需的酶是其成本的決定因素；這些所需酶中，尿酸酶的比活性最低而其用量需要足以將尿酸完全氧化，但現有商品化尿酸酶室溫下的最大比活性低于商品化辣根過氧化物酶最大比活性的10%，更低于商品化抗壞血酸氧化酶最大比活性的2%，故此類試劑盒的主要成本在于尿酸酶。雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的經典配方中，試劑I和試劑2的緩沖液都為相同pH ;這樣最終混合反應體系的pH就取決于所用試劑I和2的pH。鑒于尿酸酶在堿性條件下穩定性更好且活性更高，常選用PH8.0~8.3作為試劑I和試劑2的共同pH，但這種最終PH下反應顯色產物不穩定，使得測定精度受到操作重復性的嚴重影響，即使用于自動分析，在線樣品的數量也影響測量結果。如改用顯色產物最穩定的中性PH，為了保障雙試劑法試劑盒的貨架壽命，生產時試劑2中尿酸酶必須用盡可能高的初始濃度，這造成試劑盒的配制成本較高。
[0005]如將雙試劑法測定尿酸的試劑盒中，試劑I配制成中性或略偏酸溶液以保證辣根過氧化物酶、抗壞血酸氧化酶的穩定性；將試劑2配制成堿性即其pH>8.0以提高尿酸酶的穩定性，從而可降低試劑2中尿酸酶初始濃度，使得試劑盒所消耗的酶量降低或者顯著延長試劑盒的貨架壽命；通過調整試劑I和試劑2的比例，仍能使最終反應混合物的pH在
.7.2~7.5之間，以保障檢測可靠性和靈敏度。經過探索，發現用pH約6.5的磷酸鹽緩沖液配制試劑1，用pH約9.2的硼砂緩沖液配制試劑2，最后反應混合物中試劑I和試劑2的體積比例約為3.2:1~4.7:1，試劑2就能用盡可能低的初始尿酸酶濃度獲得相同的試劑盒貨架壽命，同時使得最終反應混合物的PH達到使得顯色產物穩定性最好和檢測靈敏度最高的要求。
[0006]
【發明內容】
概述
[0007]本發明所要解決的技術問題是提供一種雙試劑法測定血清尿酸試劑盒的新配方，克服迄今為止采用的尿酸測定雙試劑法試劑盒要么尿酸酶用量大，要么貨架壽命短的缺點。本發明的配方能明顯提高尿酸酶在試劑2中的穩定性，降低其初始濃度而降低成本，而試劑盒中其他酶的穩定性也有提高，總體可達到較長的貨架壽命而成本更低。所制得的試劑盒可用于測定血清尿酸水平。
[0008]本發明所述的雙試劑法測定尿酸的試劑盒優選兩種試劑的配方如下。試劑1:辣根過氧化物酶1.5U / ml，4-氨基安替比林0.25mM，抗壞血酸氧化酶0.67U / ml，防腐劑苯甲酸鈉3.5mM，50mM磷酸鹽緩沖液pH為6.5~7.0。試劑2:尿酸酶2.0U / ml, N-乙基N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(Toos) 2.33mM，防腐劑苯甲酸鈉3.5mM, 50mM四硼酸鈉緩沖液pH為8.0~9.6。
[0009]本發明的尿酸試劑盒適合用如下的儲備液及其配比進行制備。試劑I配制:.1146U / ml辣根過氧化物酶儲備液取0.37mL，15mM4-氨基安替吡啉儲備液取4.67mL，.200U / ml抗壞血酸氧化酶取0.94mL，0.35mol / L苯甲酸鈉儲備液取2.8mL，用50mM磷酸鹽緩沖液即PBS (6.5~7.0)定容至280mL。試劑2配制:60U / ml尿酸酶儲備液取2.34mL，.70mM TOOS取2.33mL，0.35mol / L苯甲酸鈉儲備液取0.7mL，用50mM硼砂緩沖液(pH8.5~.9.2)定容至70mL。校準的尿酸標準液(297 μ M)定值溯源至國家標準物質一冰凍人血清中尿酸成份分析標準物質GBW09157。混合反應后，測定顯色產物吸收的檢測波長546nm，反應溫度20~37°C。手工操作的代表性過程及測定時劑代表性用量為:樣品管加入樣品.20 μ L，空白管加入生理鹽水20 μ L，校準管加入配套標準品20 μ L ;分別加入相同體積的試劑I共800yL ;分別混勻，在37°C保溫5分鐘后用總容量為1.4mL的比色皿測定吸收，再各管加入試劑2共200μ L，混勻，在37°C保溫2到10分鐘，再測定吸收，以空白管校準調零。如用全自動或半自動生化分析儀，則按設定的最后反應體積以相同比例縮減。采用本領域公知的方法計算樣品中的尿酸濃度。本發明所設計的雙試劑法試劑盒，可采用本領域公認的無菌操作方法制備成液體劑型，于4°C左右避光保存。
[0010]在本發明所述試劑2中,pH在8.0~9.6條件下,原核和多數真核尿酸酶穩定性最佳。大部分原核和少部分真核尿酸酶穩定性都存在明顯的PH效應，包括球形節桿菌尿酸酶即AG尿酸酶和重組表達的苛求芽孢桿菌尿酸酶即BF尿酸酶；此兩種尿酸酶在pH9.2的硼砂緩沖液中儲存穩定性明顯優于PH7.4，因此試劑盒配方選擇pH9.2的硼砂緩沖液配制試劑2。辣根過氧化物酶和抗壞血酸氧化酶穩定性也存在pH效應，比較兩種酶在pH6.0,6.5、.7.0,7.4PBS保存穩定性，辣根過氧化物酶最適pH接近7.0，抗壞血酸氧化酶最適pH6.5 ;試劑盒配方中試劑I選擇PH6.5的PBS配制試劑I。試劑盒中各種酶都保存在對應較好pH的緩沖液中，與市售尿酸試劑盒相比，尿酸酶穩定性提高，貨架壽命更長。測定血清尿酸時，試劑I和試劑2按一定體積比混合，使得最終溶液pH值為7.2~7.5，尿酸酶偶聯過氧化物酶充分反應后顯色最穩定且顯色最深。市售尿酸試劑盒多用中性緩沖液，不是尿酸酶保存的最佳PH值，須加大尿酸酶初始濃度才能達到要求的保質期。雙試劑法使用時，最后反應體系尿酸酶最低用量為0.2U / ml時即可滿足臨床尿酸水平檢測要求；本發明采用的新配方中，新鮮試劑I和2混合后尿酸酶濃度為0.4U / ml，能滿足測量范圍和靈敏度的要求，還可以降低成本。
[0011]說明書【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1:在介質pH7.4和pH9.2條件下，本發明的試劑盒配方中擬用旭化成AG尿酸酶的穩定性。I為本發明所用的AG尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為9.2)4°C穩定性，2為AG尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為7.4) 4°C穩定性，3為AG尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為9.2) 37°C穩定性，4為AG尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為7.4) 37°C穩定性。測定方法:1.4mL比色皿中加入一定量pH9.2硼酸-硼砂緩沖液，測定75 μ M尿酸在(25±0.5) V 293nm的吸收變化初速度，每分鐘氧化Iymol尿酸的酶量為一個酶活力國際單位，尿酸的毫摩爾消光系數為 11.5 (mM) ^1.CnT1。
[0013]圖2:在介質pH7.4和pH9.2條件下，本發明的試劑盒配方中擬用重組表達的BF尿酸酶的穩定性。I為BF尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為9.2) 4°C穩定性，2為BF尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為7.4) 4°C穩定性，3為BF尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為9.2) 37°C穩定性，4為BF尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為7.4) 37°C穩定性。測定方法:用pH9.2硼酸-硼砂緩沖液測定75 μ M尿酸在(25±0.5) V 293nm的吸收變化初速度。
[0014]圖3:在介質pH7.4和pH9.2條件下，本發明的試劑盒配方中擬用產朊假絲酵母尿酸酶的穩定性。I為產朊假絲酵母尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為8.8)4°C穩定性(體系開始的尿酸酶活力為5.4U / ml)，2為產朊假絲酵母尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為7.4) 4°C穩定性，3為產朊假絲酵母尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為8.8) 37°C穩定性，4為產朊假絲酵母尿酸酶的硼酸緩沖液制劑(pH為7.4) 37°C穩定性。測定方法:用pH9.2硼酸-硼砂緩沖液測定75 ymol / L尿酸在(25±0.5) V 293nm的吸收變化初速度。
[0015]圖4:在介質pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.4條件下，本發明的試劑盒配方中擬采用的抗壞血酸氧化酶的穩定性。I為本發明所用的抗壞血酸氧化酶的PBS緩沖液制劑(pH為
6.0) 37°C穩定性，2為抗壞血酸氧化酶的PBS緩沖液制劑(pH為6.5) 37°C穩定性，3為抗壞血酸氧化酶的PBS緩沖液制劑(pH為7.0) 37°C穩定性，4為抗壞血酸氧化酶的PBS緩沖液制劑(PH為7.4) 37°C穩定性。測定方法:通過在245nm處校準吸光度來校正新鮮配制的抗壞血酸溶液的濃度。對照組和空白組取1.0mL用(pH5.6,8.0mM)磷酸鈉緩沖液(含0.5mM的EDTA)配制的0.5mM抗壞血酸新鮮溶液，對照組取0.1OmL用含0.05% (w / v)牛血清白蛋白的(8.0mM,pH5.6)磷酸鈉緩沖液配制的樣品溶液，混合，在25°C下恒溫5.0分鐘。反應
5.0分鐘后加入3.0mL的200mM HCl終止反應，將最終混合物在245nm處讀取吸光度。添加相同的0.1mL酶液到空白組,混合后在245nm處讀取吸光度。每分鐘氧化I μ mol抗壞血酸的酶量為一個酶活力國際單位，抗壞血酸的毫摩爾消光系數為10.ΟΟιιΜ1.cnT1。
[0016]圖5:在介質pH6.0、pH6.5和pH7.0條件下,本發明的試劑盒配方中擬用抗壞血酸氧化酶在PBS緩沖液制劑4°C穩定性。測定方法參見圖4。
[0017]圖6:在介質pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.4，本發明的試劑盒配方中擬用辣根過氧化物酶的穩定性。I為本發明所用的辣根過氧化物酶的PBS緩沖液制劑(pH為6.0)37°C穩定性，2為辣根過氧化物酶的PBS緩沖液制劑(pH為6.5) 37°C穩定性，3為辣根過氧化物酶的PBS緩沖液制劑(pH為7.0) 37°C穩定性，4為辣根過氧化物酶的PBS緩沖液制劑(pH為
7.4)37°C穩定性。測定方法:取147mM的過氧化氫50μ L，0.396mol / L的焦性沒食子酸100 μ L，加入10 μ L的樣品和(ρΗ6.0, 50mM)磷酸鈉緩沖液至1.0mL,混合。在25°C，420nm處以5秒的間隔讀取3分鐘反應的吸光度。初速度是在420nm處每20秒吸光度以線性增加的最大速率，辣根過氧化物酶毫摩爾消光系數為3.δπιΤ1.cm—1。
[0018]圖7:在介質pH6.0、pH6.5和pH7.0條件下,本發明的試劑盒配方中擬用辣根過氧化物酶在PBS緩沖液制劑4°C穩定性的情況。測定方法參見圖6。
[0019]圖8:用本發明的配方雙試劑法制備尿酸試劑盒測定血清尿酸中的反應混合物在546nm處的標準曲線。
[0020]圖9:雙試劑法市售試劑盒測定尿酸含量(C1)和雙試劑法本發明所制備劑盒測定尿酸含量(C2)的方法學比較。選取臨床病人血清標本80例，每份標本重復測定3次，取均值。以市售雙試劑法測定尿酸含量試劑盒測得血清尿酸濃度(95~850 μ M)為橫坐標，雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的新配方測得血清尿酸濃度(100~942 μ Μ)為縱坐標作圖，直線方程C1=L 05C2+3.25 (R2X).995，s〈0.013)，雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的新配方與市售雙試劑法測定尿酸含量試劑盒兩種方法有相關關系。
[0021]圖10:雙試劑法市售試劑盒測定尿酸含量(C1)和雙試劑法本發明所制備劑盒測定尿酸含量(C2)進行Bland Altman分析。直線方程(C1-C2) =-0.027 (CjC2) /
2-0.009 (R2)0.258，p〈0.01)。此差異可能提示新配方所用BF尿酸酶對黃嘌呤干擾抗性強、顯色產物穩定性好，手工測定時第二步顯色時間偏差使得結果偏高。
【具體實施方式】
[0022]1.【具體實施方式】實例部分所用主要化學試劑來源、所用特殊器械和方法
[0023]1.1主要試劑和材料:尿酸購自Alfa Aesar公司，DEAE-纖維素購自Whatman公司，聚乙二醇(PEG) -6000、焦性 沒食子酸和膽紅素均購自上海化學試劑廠，辣根過氧化物酶購自北京鼎國生物技術責任有限公司，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(TOOS)購自北京易萊西諾科技有限公司，4-氨基安替比林、苯甲酸鈉和抗壞血酸均購自重慶化學試劑廠，鄰苯三酚購自上海化學試劑總廠，來自黃瓜的抗壞血酸氧化酶購自合肥蘭旭生物技術有限公司，AG尿酸酶購自日本旭化成有限公司，市售雙試劑法測定尿酸含量試劑盒購自北京中生北控生物科技有限公司(China ;n0.000028080，http: / / www.zhongsheng.com.cn / cn / cpis / pop.asp?InfoID=ll)和四川邁克生物技術有限公司(China ；http: / / www.makerbi0.com / products / list.asp?cat = 2)。其它試劑為國產分析純。
[0024]下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0025]實施例1:參見圖1至圖7，據雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的新配方制備方法及其應用過程。
[0026]最后配方:試劑1:辣根過氧化物酶1.5U / ml,4-氨基安替比林0.25mM,抗壞血酸氧化酶0.67U / ml，苯甲酸鈉3.5mM，50mM磷酸鹽緩沖液pH為6.5~7.0，。試劑2:尿酸酶2.0U / ml, N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(Toos) 2.33mM，苯甲酸鈉3.5mM, 50mM硼酸-硼砂緩沖液pH為8.0~9.2。
[0027]制備方法:試劑1:1146U / ml辣根過氧化物酶儲備液取0.37mL, 15mM4-氨基安替吡啉儲備液取4.67mL，200U / ml抗壞血酸氧化酶取0.94mL，0.35mol / L苯甲酸鈉儲備液取2.8mL，用50mM PBS (6.5~7.0)定容至280mL。試劑2:60U / ml尿酸酶儲備液取
2.34mL, 70mM TOOS取2.33mL，0.35mol / L苯甲酸鈉儲備液取0.7mL，用50mM硼砂緩沖液(pH8.0~9.2)定容至70mL。尿酸標準液(297 μ Μ)使用中生北控配套標準液。所有試劑配制在嚴格無菌環境進行。
[0028]手工操作的代表性過程及測定時試劑代表性用量為:樣品管加入樣品20yL，空白管加入生理鹽水20 μ L，校準管加入配套標準品20 μ L ;分別加入相同體積的試劑I共800 μ L ;分別混勻，在37°C保溫5分鐘后用總容量為1.4mL的比色皿測定吸收，再各管加入試劑2共200μ L，混勻，在37°C保溫2到10分鐘，再測定吸收，以空白管校準調零。
[0029]全自動或半自動生化分析儀上的應用:按設定的最后反應體積以相同比例，據手工操作的模式進行成比例縮減。
[0030]采用本領域公知的方法計算樣品中的尿酸濃度。
【權利要求】
1.一種雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的配方，其特征在于:(1)用尿酸酶和偶聯過氧化物酶反應測定顯色產物吸收確定尿酸量，用抗壞血酸氧化酶消除樣品中抗壞血酸即維生素C的干擾；(2)將抗壞血酸氧化酶、過氧化物酶及輔助顯色物質，加防腐劑和其它輔助成分配制在PH6.5~7.0的磷酸鹽緩沖液中為試劑I ;(3)將尿酸酶和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽配制在pH8.0~9.6硼酸-硼砂緩沖液中，加防腐劑為試劑2 ； (4)應用時，試劑I和試劑2混合的比例以最終反應體系pH在7.2~7.5之間為原則進行設置；試劑I和試劑2的pH不同時，其所含各種酶的初始濃度相應改變，使最終反應體系各種酶濃度變化小于10%即保持一致；試劑I和試劑2的pH在所述范圍內變化時，二者在最終反應體系的混合比例如下表:
2.據權利要求1所述一種雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的配方，此雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的制備特征在于:(1)所需要的緩沖液都先滅菌，所用容器先滅菌并干燥；(2)所需酶、顯色底物、防腐劑作為主要有效成分，都配制成5倍以上高濃度儲備液；酶溶液用0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌；(3)試劑I的緩沖液pH為6.5時，其所含主要有效成分濃度如下:辣根過氧化物酶>1.5U / ml，4-氨基安替比林0.25mM，抗壞血酸氧化酶>0.67U / ml，苯甲酸鈉3.5mM ;上述有效成分用50mM且pH為6.5的磷酸鹽緩沖液即PBS配制成各自的儲備液，再按儲備液的濃度和所需最終濃度確定比例混合；(4)試劑2的緩沖液pH為9.2時，其所含主要有效成分濃度如下:用在pH8.0~9.2間攝氏4度時失活半衰期長于6個月的尿酸酶時其濃度>2.0U / ml，2.33mM的N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽以下簡稱為Toos，苯甲酸鈉3.5mM ;上述有效成分用50mM且pH為9.2的50mM硼酸-硼砂緩沖液配制成各自的儲備液，再按儲備液的濃度和所需最終濃度確定比例混合；(5)當試劑I和試劑2的pH在權利要求1所述范圍內變化時，二者在最終反應體系的混合比例變化后，調整試劑I和試劑2中酶初始濃度使得最終反應體系各種酶的活性與試劑I的pH為6.5而試劑2的pH為9.2時相比，相差小于10%即保持一致。
3.據權利要求1所述一種雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的配方，其應用特征在于:(1)當設置試劑I的pH為6.5且試劑2的pH為9.2時，先取0.800mL試劑I和20 μ L樣品混合，攝氏20~37V反應5分鐘；測定546nm吸收作為起點吸收；加入0.200mL試劑2在相同溫度再反應5..20分鐘，測定546nm吸收；扣除起點吸收為來自尿酸的顯色產物吸收；用標準品測定546nm吸收對樣品中尿酸濃度的響應作為標準曲線；通過標準曲線計算每個血清樣品的尿酸濃度；(2)試劑I和試劑2的pH不同于上述數值時，按權利要求1第(4)所述的比例混合試劑I和試劑2 ;用于自動分析儀時，樣品、試劑I和試劑2的體積減少但維持相同的比例；(3)該雙試劑法測定尿酸含量的試劑盒在4°C避光保存。
4.據權利要求1所述一種雙試劑法測定尿酸含量試劑盒的新配方，試劑I和試劑2所用緩沖液的PH不同且以保障其所含成本最高工具酶的穩定性最好為原則進行設置，應用時以最終反應混合物的pH達到7.2~7.5設置兩種試劑混合的比例，故所用工具酶最佳穩定性所需PH決定試劑I和試劑2中所含各種酶的初始濃度。
【文檔編號】C12Q1/28GK103571916SQ201310591044
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】廖飛, 楊曉蘭, 胡小蕾, 黃亞, 陳遠翔, 李元麗 申請人:重慶醫科大學