昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法

昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法
【專利摘要】本發明公開了一種昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法，將家蠶質型多角體病毒（BmCPV）的多角體基因（polyhedrin）以及目的蛋白基因分別構建至pFastBac?Dual載體上的PH和P10啟動子下面，通過重組獲得同時表達多角體和目的蛋白的桿狀病毒。本發明利用桿狀病毒表達系統，同時將質型多角體蛋白基因和目的蛋白基因分別構建到pFastBacTMDual載體的PH與p10啟動子下，并在目的蛋白與信號肽之間引入柔性鏈接肽，通過與病毒骨架重組，獲得重組桿狀病毒。通過該單一病毒感染Sf9或Sf21昆蟲細胞，直接可以在細胞內產生所需要的包裹型蛋白，并且這種重組型的病毒也同樣可以獲得擴增。
【專利說明】昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種對蛋白質進行包裹的方法。
【背景技術】
[0002]昆蟲病毒多角體(polyhedra)是指昆蟲病毒在感染宿主細胞后產生的多面體粒子，其主要用來包裹病毒粒子。它的功能是保護包裹的病毒顆粒免受不良環境的破壞，比如:高溫、干燥、輻射等，以及它對各種蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性條件下極其穩定，而在堿性環境下易溶解并釋放出病毒粒子[I]。依據多角體在細胞內形成的部位可以分為核型多角體或質型多角體。近來國內外的研究發現質型多角體可以包裹異源蛋白，比如:Ijiri等人將蛋白激酶C (protein kinase C)包裹進入了質型多角體中，并發現包裹型的蛋白激酶C相對于沒有經過包裹的蛋白有更強生物學活性和持續的藥物緩釋效果[2];被多角體包裹的表皮生長因子(epidermal growth factor)不僅藥效延長了，而且其能抵抗高強度的射線破壞[3];曹翠平等人利用多角體包埋外源蛋白時發現，經過包埋的EGFP蛋白(綠色熒光蛋白)放置2個月后仍能檢測到綠色熒光，而干燥處理30min后同樣能檢測到蛋白活性[4]。這些研究表明多角體是耐酸、抗輻射、抗干燥并具有包裹異源活性蛋白特性的優良載體。
[0003]目前國外文獻報道 中關于多角體包裹目的蛋白的技術手段多是通過構建兩個重組桿狀病毒，即一個專一表達質型多角體病毒多角體蛋白(包裹蛋白)的桿狀病毒，另一個專一表達目的蛋白的桿狀病毒，通過調節兩種病毒的比例混合感染Sf9昆蟲細胞，再從細胞中分離出多角體。該種方法不適合從昆蟲細胞中收集大量的多角體，由于很多細胞在混合感染的時候只感染了一種 病毒，所以會形成較多空多角體，以至于包裹效率低。國內學者主要通過家蠶Bacmid表達系統， 采用家蠶本身的多角體蛋白包裹目的蛋白，這種方案產生的多角體量大，并且可以通過家蠶本身生產，但采用家蠶本身多角體包裹的目的蛋白并不專一，其中包裹了大量家蠶病毒粒子，不適合現在國際上通過多角體專一包裹目的蛋白的發展趨勢，也不能應用于現代醫藥蛋白或疫苗抗原的包裹需求。
[0004]在細胞內實現多角體對目的蛋白的包裹過程需要一個信號肽蛋白的輔助，目前的技術手段基本上采用在目的蛋白的N端加上一段VP3蛋白N末端42-93個氨基酸或者Hl螺旋作為信號肽，由于這些蛋白結構比較大，可能會影響很多目的蛋白的正確折疊過程，造成目的蛋白失去生物學活性。
[0005]大多數的生物活性蛋白，如:GM_CSF、干擾素、白介素、亞單位疫苗等，目前主要以注射給藥，治療不方便，也難以長期給藥，由其是養殖場。我們尚未見到利用昆蟲生產多角體包裹藥物方面的研究報道。
[0006]上文中涉及的參考文獻如下:
[0007][l]Belloncik, S.and H.Mori, Cypoviruses.The insectviruses, 1998:p.337-369.(Belloncik, S.and H.Mori,質型多角體病毒。昆蟲病毒雜志，1998:p.337-369)。[0008][2]Ijiri, H., et al., Immobilization of protein kinase C into cypoviruspolyhedra.Journal of insect biotechnology and sericology.79(1):p.1-1.(H.;Hamada, N.;Kotani,E.;Mori,H.固定蛋白激酶C到質型多角體上。昆蟲生物技術與蠶學雜志。2010.79(1):p.1-1.)。
[0009][3]Ijiri, H., et al., Structure-based targeting of bioactive proteinsinto cypovirus polyhedra and application to immobilized cytokines for mammaliancell culture.Biomaterials, 2009.30(26):p.4297-4308.(Coulibalyb, Gento Nishimura等。基于結構的定點固定生物活性蛋白至質型多角體上并應用固定的化的細胞因子培養哺乳動物細胞培養。生物材料雜志，2009，30 (26):p.4297-4308.)。
[0010][4]曹翠平，郭愛芹等.利用BmNPV多角體包埋外源蛋白的觀察.蠶業科學，2009.35(004):p.790—795。

【發明內容】

[0011]本發明所要解決的技術問題是提供一種多角體高效專一包裹目的蛋白的方法。
[0012]為了解決上述技術問題，本發明提供一種昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法:將家蠶質型多角體病毒(BmCPV)的多角體基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分別構建至pFastBac Dual載體上的PH和PlO啟動子下面，通過重組獲得同時表達多角體和目的蛋白的桿狀病毒。
[0013]作為本發明的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法的改進:在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信號序列以及6-12個GGS (甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)柔性連接肽。
[0014]作為本發明的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法的進一步改進:該方法通過構建的重組桿狀病毒在昆蟲細胞sf9或甜菜夜蛾上實現目的蛋白的包裝過程。
[0015]作為本發明的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法的進一步改進:由Hl信號肽與柔性連接肽構成的引導基因的序列為SEQ ID N02所述。
[0016]作為本發明的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法的進一步改進:Hl (信號肽)+Flexible peptide (柔性鏈接肽)+eGFP的序列為SEQ ID N04所述。
[0017]本發明還同時提供了利用上述方法制備而得的病毒，所述病毒直接感染sf9或sf21細胞，在細胞內直接產生多角體包裹型的目的蛋白，每個細胞內含10-50個多角體，直徑在1-2 u m，并且病毒液能繼續用于感染細胞或注射甜菜夜蛾。
[0018]作為本發明的病毒的改進:該病毒直接可以注射4-5齡甜菜夜蛾，3-5天后甜菜夜蛾發生液化，每頭幼蟲可以產生1-2億個多角體包裹的目的蛋白，直徑在1-2 Pm。
[0019]作為本發明的病毒的進一步改進:所述的目的蛋白為多角體包裹型，具有生物學功能，并且為單基因編碼的蛋白質。
[0020]本發明的目的之一是提供該重組病毒的制備方法。
[0021]本發明是按下述方案實現的:以綠色熒光蛋白eGFP作為包裝的模式目的蛋白，通過全基因合成技術分別合成質型多角體蛋白polyhedrin基因、引導肽基因(含Hl信號肽+柔性連接肽)、eGFP基因(序列分別為序列表中的SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03)。
[0022]本發明具體為通過甜菜夜蛾昆蟲或者細胞實現昆蟲病毒多角體對其他目的蛋白進行高效包裹，采用該方法可以大幅度提高多角體對目的蛋白的包裹效率，不僅可以在體外培養的昆蟲細胞sf9和sf21內包裹，也可以在甜菜夜蛾體內大量包裹。該技術可以應用于蛋白類藥物或疫苗抗原的包裹【技術領域】。
[0023]由于多角體這種蛋白包裝材料具有很好的抗酸、耐高溫等特點，所以將其用于那些具有用量小、活性高、易失活的蛋白進行包裝可能對提高其穩定性以及口服給藥方面會是一個突破；亞單位疫苗，一般是某種病原的一段肽或蛋白成分，直接通過口服很引起動物粘膜免疫反應，因為口服后很容易被消化系統的酶降解，所以包裹技術為亞單位疫苗直接通過口服引起動物粘膜和全身性免疫反應提供了新的途徑。因此，本研究內容對于拓展蛋白類藥物或亞單位疫苗在臨床上的應用范圍以及為今后開發更多的口服蛋白藥物提供技術支持，具有重要的實際應用價值。
[0024]本發明的發明點具體為:
[0025]1、構建了一種新型桿狀病毒，該病毒具有在昆蟲細胞Sf9內同時表達多角體蛋白與目的蛋白，并且目的蛋白是被多角體完全包裹，該多角體在細胞內大小為1-2 U m,每個細胞內可以產生50-200個該顆粒.(國內外包裝主要采用分別表達多角體蛋白與目的蛋白的兩種桿狀病毒混合感染制備包裹目的蛋白的多角體。我們的發明改進后，將多角體蛋白與目的蛋白同時放在一種桿狀病毒中，簡化了其方法，提高了包裝效率)。
[0026]2、構建了一種新型桿狀病毒，該病毒具有感染甜菜夜蛾昆蟲的能力，能在其體內產生大量的多角體顆粒，并且目的蛋白被多角體包裹。其在細胞內的大小與分布同感染Sf9細胞結果類似。(目前國內外在昆蟲上實現多角體包裹目的蛋白上沒有報道。我們的發明提供的該新型桿狀病毒實現了在甜菜夜蛾昆蟲上多角體對目的蛋白的包裹過程。)
[0027]3、構建了一種新型桿狀病毒，該病毒具有同時表達多角體蛋白與目的蛋白的能力，特點:(1)多角體蛋白基因插入到載體pFastBac Dual質粒，由載體上Polyhedrinpromoter啟動；(2)目的蛋白基因插入到載體pFastBac Dual質粒，由載體上PlO啟動子啟動，并且在包裹目的蛋白的N端加上一段引導肽序列，引導肽由信號肽與柔性鏈接肽組成。
[0028]綜上所述，本發明利用桿狀病毒表達系統，同時將質型多角體蛋白基因和目的蛋白基因分別構建到pFastBacTMDual載體的PH與plO啟動子下，并在目的蛋白與信號肽之間引入柔性鏈接肽，通過與病毒骨架重組，獲得重組桿狀病毒。通過該單一病毒感染Sf9或Sf21昆蟲細胞，直接可以在細胞內產生所需要的包裹型蛋白，并且這種重組型的病毒也同樣可以獲得擴增。相對于國外通過兩種病毒按照比例進行混合感染相比，具有工藝簡單，產生的包裹型蛋白效率更高，另外在產生包裹型蛋白的同時重組病毒粒子也同樣獲得了擴增，更適合通過昆蟲細胞發酵大規模制備多角體包裹型蛋白；其次通過上述方法制備的重組桿狀病毒可以直接皮下注射四齡甜菜夜蛾，通過昆蟲體細胞來生產更多的多角體包裹型蛋白，其效率高、同時成本要大大低于通過昆蟲細胞發酵過程。【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0030]圖1為方案流程圖。
[0031]圖2為細胞內多角體的產生對比圖(200倍數下顯微鏡拍照)；
[0032]左圖為Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒感染，右圖為對照細胞。[0033] 圖3為熒光下觀察多角體內的eGFP的包裹情況圖(200倍數下顯微鏡拍照)；
[0034]Al與A2為細胞內多角體分別在可見光與熒光下拍照的圖片，圖BI與B2為從細胞中分離獲得的多角體分別在可見光與熒光下拍照的圖片。
[0035]圖4為甜菜夜蛾昆蟲感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒后在其體內產生包含eGFP蛋白的多角體顆粒結果。
[0036]Cl為四齡甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后蟲體發生液化結果。
[0037]C2為四齡甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后蟲體組織涂片后可見光下對多角體顆粒鏡檢結果。(100倍數下顯微鏡拍照)；
[0038]C3為四齡甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后蟲體組織涂片后突光下對多角體顆粒鏡檢結果。(100倍數下顯微鏡拍照)；
【具體實施方式】
[0039]實施例方法、
[0040]1、材料:
[0041]草地貪夜蛾細胞(sf9)、pFastBac Dual質粒、DHlOBac均購自美國Invitrogen公司；
[0042]DH5 a菌株購自TaKaRa公司；
[0043]家香質型多角體病毒(Bombyxmori cypovirus,BmCPV)的多角體(polyhedrin)基因(gb IM19112.11、如序列表中的NOl所述)、由Hl信號肽與柔性連接肽構成的引導基因(如序列表中的N02所述，本發明所特設)、eGFP基因(gb | KC710230.11、如序列表中的N03所述)均由上海生物工程公司人工合成；
[0044]備注說明:在序列表的N02中，l_90bp為Hl定位信號肽，91_126bp為柔性連接肽(帶下劃線)。
[0045]高保真Tag酶、各種限制性內切酶、dNTP、酶連試劑盒、DNA膠回收試劑盒等均購自TaKaRa 公司；
[0046]Sf-900II SFM無血清培養基、Cellfectin II Reagent轉染試劑均購自Invitrogen 公司；
[0047]2、引物設計與PCR擴增:
[0048]根據人工合成的polyhedrin基因設計一對引物，
[0049]上游引物P1:5，一CGCGGATCCATGGCAGACGTAGCAGGAAC—3’，帶有 BamH I 酶切位點；
[0050]下游引物P2:5’ 一CCCAAGCTTTCACTGACGGTTACTCAGAG— 3’，帶有 Hind III 酶切位點。
[0051]依據人工合成的帶有Hl+柔性連接肽+eGFP的序列設計一對引物:
[0052]上游引物P3:5 ’ — TCCCCCGGGATGGCAGACGTAGCAGGAAC— 3 ’，帶有 Smal I 酶切位占.[0053]下游引物P4:5 ’ 一 CGGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA— 3 ’，帶有 Kpn I 酶切位點。
[0054]上述引物均由上海生物工程公司合成。
[0055]PCR 反應體系為:dNTPs (2mM) 2.0 U L,弓丨物(IOuM)各 0.5 ii L，IOXrTaqbuffer2.5 ii L，模板 DNA (20ng/ul) 1.0u L, Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0.2 y L，雙蒸水補至25 u Lo
[0056]PCR 反應條件為:94°C 5min，(預變性);94°C 30s’，55°C 30s’，72°C lmin’，共 35個循環；72°C IOmin。
[0057]PCR擴增產物通過凝膠回收試劑盒回收PCR產物，于_20°C保存備用。
[0058]3、重組轉移載體的構建與鑒定:
[0059]將凝膠回收的polyhedrin基因和pFastBac Dual質粒經過Bam HI和Hind III雙酶切后分別回收，polyhedrin基因定向克隆于FastBac Dual的PH啟動子下游，構建的重組轉移載體pFastBacDual/polyhedrin,轉化至DH5 a , PCR和酶切鑒定。[0060]將上述pFastBac Dual/polyhedrin質粒和帶定位信號肽的eGFP基因的PCR產物經Smal I和Kpn I雙酶切后分別回收，并將引導基因與eGFP基因定向克隆至pFastBac Dual/polyhedrin的PlO啟動子下游，構建獲得重組轉移載體pFastBac Dual/polyhedrin-eGFP,最后轉化DH5 a，送上海生物工程公司測序鑒定。
[0061]4、重組Bacmid質粒的構建與鑒定:
[0062]將pFastBac Dual/polyhedrin-eGFP 和對照質粒 pFastBac dual 分別轉化
E.coli DHlOBac 感受態細胞，菌液涂于含有 X-Gal (40 iig/ml)、IPTG (24 y g/ml)、卡那霉素(50118/1111)、慶大霉素(100118/1111)和四環素(30iig/ml)的培養基平板上，經藍白斑篩選，分別挑取白色菌落、提取質粒，送上海生工測序鑒定，鑒證正確后命名為重組質粒Bacmid-polyhedrin—eGFPo
[0063]5重組Bacmid轉染sf9細胞及其表達分析:
[0064]根據Cellfectin轉染試劑說明書，將重組質粒Bacmid-polyhedrin-eGFP(21^)、0611€6(^111轉染試劑(21^)與100 ill不含抗生素無血清昆蟲細胞培養基(Gibcosf-900II SFM)混勻，室溫下孵育45min，轉染處于對數生長期的sf9細胞，置28°C培養5h后吸去轉染混合物，加入含抗性(青霉素0.008g/100ml，鏈霉素終濃度0.01g/100ml)和血清的昆蟲細胞培養基中繼續培養72h以上，出現病變(即細胞內充滿顆粒，細胞附著力減弱，開始脫壁上浮并個別細胞解體成顆粒狀物散落細胞培養液中)后，并觀察細胞內多角體的產生以及熒光下觀察多角體內的eGFP的包裹情況并計數，并收集細胞上清為Pl代病毒液。以此為毒種，再去感染sf9細胞以擴增病毒,收獲病毒液為P2代病毒。
[0065]結果如下:
[0066]I)、細胞內多角體的產生如圖2所示；該方法獲得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒在細胞內產生大量的多角體顆粒，圖2中，左圖為Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒感染，通過計數，每個細胞內可以產生10-50個多角體，右圖為對照細胞，細胞內沒有發現多角體顆粒。(20倍數下顯微鏡拍照)。【對照細胞為正常細胞，細胞內不產生多角體顆粒。】
[0067]2)、熒光下觀察多角體內的eGFP的包裹情況如圖3所示；該方法獲得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒在細胞內產生大量的多角體顆粒，并且包裹了 eGFP目的蛋白，圖Al與A2為細胞內多角體分別在可見光與熒光下拍照圖片，圖BI與B2為從細胞中分離獲得的多角體分別在可見光與熒光下拍照的圖片。圖片證明了該方法可以在細胞產生大量的多角體并且可以高效率的包裹目的蛋白eGFP (20倍數下顯微鏡拍照)。
[0068]6、重組桿狀病毒在甜菜夜蛾幼蟲中的表達分析
[0069]將甜菜夜蛾幼蟲蟲卵在27°C孵化成幼蟲，分裝于24孔板內，以人工飼料喂養至四齡時，每頭幼蟲注射P2病毒1-3 ii 1,3-4天后收集死亡和液化的幼蟲，經過研磨和過濾，直接涂片進行顯微鏡拍照觀察并對多角體進行計數。
[0070] 備注說明:
[0071 ] 1、人工飼料是指從武漢病毒研究所購買，用于喂養昆蟲的飼料。
[0072]2、液化是指昆蟲發生病變的一種現象，整個蟲體水腫并且柔軟，用針刺表皮后會流出大量液體。
[0073]結果如下:
[0074]該方法獲得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒可以在昆蟲甜菜夜蛾上產生大量的多角體顆粒，并且包裹了 eGFP目的蛋白。圖Cl為注射病毒后蟲體液化結果:蟲體帶綠色；圖C2與C3為液化蟲體經過直接涂片后在可見光與熒光下觀察結果；結果說明通過該方法獲得病毒可以直接注射甜菜夜蛾來獲得包裹型多角體，并且可以在幼蟲上產生大量的包裹了 eGFP目的蛋白的多角體，經過計數每頭幼蟲可以產生約1-2億個多角體顆粒。(40倍數下顯微鏡拍照)。
[0075]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:將家蠶質型多角體病毒(BmCPV)的多角體基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分別構建至pFastBac Dual載體上的PH和PlO啟動子下面，通過重組獲得同時表達多角體和目的蛋白的桿狀病毒。
2.根據權利要求1所述的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信號序列以及6-12個GGS(甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)柔性連接肽。
3.根據權利要求2所述的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:所述方法通過構建的重組桿狀病毒在昆蟲細胞sf9或甜菜夜蛾上實現目的蛋白的包裝過程。
4.根據權利要求1、2或3所述的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法，其特征是: 由Hl信號肽與柔性連接肽構成的引導基因的序列為SEQ ID N02所述。
5.根據權利要求4所述的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法，其特征是: Hl (信號肽)+Flexible peptide (柔性鏈接肽)+eGFP的序列為SEQ ID N04所述。
6.根據權利要求4所述的昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:重組質粒為 Bacmid-polyhedrin-eGFP。
7.利用如權利要求1~6任一所述方法制備而得的病毒，其特征是:所述病毒直接感染sf9或sf21細胞，在細胞內直接產生多角體包裹型的目的蛋白，每個細胞內含10-50個多角體，直徑在1-2 U m，并且病毒液能繼續用于感染細胞或注射甜菜夜蛾。
8.根據權利要求7所述的病毒，其特征是:該病毒直接可以注射4-5齡甜菜夜蛾，3-5天后甜菜夜蛾發生液化，每頭幼蟲可以產生1-2億個多角體包裹的目的蛋白，直徑在1-2 u m0
9.根據權利要求8所述的病毒，其特征是:所述的目的蛋白為多角體包裹型，具有生物學功能，并且為單基因編碼的蛋白質。
【文檔編號】C12R1/93GK103614417SQ201310595964
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】袁林, 郭建軍, 楊一兵, 魏國汶 申請人:江西省科學院微生物研究所