大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒及其應用，通過限制性核酸內切酶的作用，將體外PCR擴增出的LuxS基因片段消化并連接到載體pGEX4T-1上，構建出大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒。本發明表達結果鑒定方法直觀明了，具有良好的可操作性和重復性；通過調節誘導物的濃度以及誘導時間，可控制蛋白表達的數量，從而滿足不同實驗的需求，尤其是密度感應機制相關實驗的需求，為不同目的、不同條件的實驗提供更相近的對照組別。
【專利說明】大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物密度感應機制研究領域，尤其涉及一種大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒及其應用。
【背景技術】
[0002]密度感應(quorum sensing, QS)是一種微生物細胞間信息傳遞機制，即細菌通過合成、分泌并感知環境中的信號分子，以調節自身某些基因的表達[1]。信號分子中，自誘導分子-2 (autoinducer-2, A1-2)的產生基因保守存在于微生物中，故而其被認為參與了菌種間的信號傳遞[2，3]。由于在自然狀態下微生物多以不同菌種混合存在的方式生存，并在菌種間存在廣泛的信息交流，所以A1-2這種菌群間的信息調控系統備受重視M。研究其誘導的密度感應機制，有利于理解微生物間生物學行為的調控，并為探索抑制微生物感染提供新的思路。
[0003]然而對于研究A1-2所介導的密度感應系統的實驗來說，只有在體外高效的表達LuxS蛋白，繼而考察不同實驗組別的差異，才能使得實驗結果更可靠更有說服力，現有研究中有通過多肽合成的解決方案，但該方法技術復雜且成本較高，無法廣泛用于對比研究。本課題組在研究工作中探討通過表達質粒的構建獲得LuxS蛋白的體外表達，而要在體外獲得穩定的IuxS表達則需要一個良好的表達體系。載有強啟動子的高拷貝表達載體由于其構建及表達過程便捷、經濟，同時又具有穩定以及可調節等特點，提供了快速有效地在體外構建及表達LuxS的可能。目前未見有關于大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒的報導。
[0004][I] Xavier KB,Bassler BL.Regulation of Uptake and Processing of theQuorum-Sensing Autoin`ducer A1-2 in Escherichia coli [J].J.Bacteriol, 2005,187(1):238 - 248.[2]Kendal I MM, Rasko DA, and Sperandio V.Global Effects of theCell-to-Cell Signaling Molecules Autoinducer-2, Autoinducer-3, and Epinephrinein a IuxS Mutant of Enterohemorrhagic Escherichia coli [J].1nfect.Tmmun.2007，75(10):4875 - 4884.[3]Surette MG, Miller MB, and Bassler BL.Quorum sensing in Escherichiacoli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harvey1: A new family of genesresponsible forautoinducer production [J].Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.1999.96(4):1639-1644.[4]Vendevi lie A, Winzer K.Tang CM, et al.Making ’sense’ ofmetabolism: autoinducer-2, LuxS and pathogenic bacteria[J].Nat Rev Microbiol,2005, 3(5): 383-396。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是，提供一種可以高效便捷的表達LuxS蛋白的大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒及其應用。
[0006]為了解決上述問題，本發明提供了一種大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒，其特征在于，通過限制性核酸內切酶的作用，將體外PCR擴增出的LuxS基因片段消化并連接到載體PGEX4T-1上，構建出大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒。
[0007]本發明亦提供了大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒在密度感應信號系統研究中的應用。
[0008]本發明的優點在于，本發明通過擴增野生型大腸桿菌LuxS基因并利用高拷貝的表達載體構建質粒，繼而轉入大腸桿菌菌株中，在誘導物異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG)的誘導條件下,成功得到了該蛋白的穩定表達。同時表達載體上攜帶的GST標簽也有利于表達蛋白的鑒定,從而可采用商品化的抗GST抗體,利用westernblot等方法鑒定出攜帶有標簽的蛋白表達，表達結果鑒定方法直觀明了，具有良好的可操作性和重復性；通過調節誘導物的濃度以及誘導時間，可控制蛋白表達的數量，從而滿足不同實驗的需求，尤其是密度感應機制相關實驗的需求，為不同目的、不同條件的實驗提供更相近的對照組別。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為高拷貝表達載體pGEX4T-l的結構示意圖。
[0010]圖2為IuxS基因擴增圖，目的基因片段大小為516bp。
[0011]圖3為P-LuxS克隆酶切鑒定圖，1-6表示挑取得6個克隆，其中較大的酶切片段約為5000bp,小片段約為360bp。
[0012]圖4為蛋白表達鑒定圖，左邊附圖為考馬斯亮藍的染色圖，右邊附圖為蛋白印跡雜交圖，重組的LuxS蛋白大小約為45KD，在為誘導的時間點沒有表達或極少的滲漏表達，經誘導后可大量表達。
[0013]圖5為不同濃度IPTG誘導下，菌株MDAI2與M-L之間基因轉錄水平的差異。【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0015]菌株，質粒與主要試劑
菌株:大腸桿菌(Escherichia coli)W3110 (上海市口腔醫學研究所提供)；
IuxS缺陷株MDAI2 (上海市口腔醫學研究所提供)；` 感受態大腸桿菌T0P10 (上海市口腔醫學研究所提供)；
表達載體PGEX4T-1 (上海市口腔醫學研究所提供):載體結構示意圖見附圖1 ;
培養基:2xYT ；
酶:內切酶:Bgl I1、BamH 1、EcoR I ；連接酶:T4 DNA Ligase ；
誘導物:異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside, IPTG)；
主要試劑盒:細菌基因組抽提試劑盒；
質粒抽提試劑盒；
DNA凝膠回收試劑盒；
以上均為北京博大泰克生物基因技術公司產品；
抗體:鼠抗GST單克隆抗體；
帶有綠色熒光基團標記二抗。
[0016]克隆的制備
以大腸桿菌W3110基因組為模板，使用引物LF: GGC AGA TCT ATG CCG TTG TTA GATAGC TTC AC 和 LR: GGC GAA TTC CTA GAT GTG CAG TTC CTG CAA CT 通過 PCR 的方法擴增出IuxS基因片段。將產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。
[0017]回收片段后利用Bgl II和EcoR I兩個限制性內切酶消化基因片段，使用BamH I以及EcoR I消化表達載體pGEX4T-l，37°C條件下反應2小時。繼而進行基因片段與載體的連接反應，16°C反應條件下過夜連接。所得連接產物按照標準方法轉化入感受態的大腸桿菌TOPlO后，涂于氨芐青霉素(50mg/ml)的2xYT平板，37°C恒溫培養過夜。
[0018]挑取轉化平板上中等大小，邊緣整齊的菌落6個，分別培養并按質粒提取試劑盒說明進行質粒的抽提。繼而用BamH I以及EcoR I限制性酶進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。選取鑒定陽性結果送上海博尚生物技術公司進行測序，所得結果與標準序列進行比對，將鑒定結果正確的重組克隆命名為P-LuxS并保存。
[0019]蛋白表達的鑒定 將P-LuxS轉化入經氯化鈣方法制備并凍存的感受態大腸桿菌MDAI2中，涂板培養后挑菌并搖菌過夜。次日，以1:100的比例接入新鮮2xYT培養基，培養至吸光值J約為0.7，取菌液Iml作為對照，向剩余菌液內加入IPTG進行誘導(終濃度為lmmol/L)。分別于誘導后
0.5h、lh、2h取Iml菌液并測J值。將不同時間點所取菌液4°C離心并濃縮至2(M。加入蛋白上樣緩沖液(SDS、Tris、甘油、水、溴酚蘭、巰基乙醇)后，100°C煮lOmin，繼而12000r/min離心lmin，上層液體即含有重組蛋白的樣品。
[0020]3.1考馬斯亮蘭染色鑒定
配制10%SDS-PAGE膠，上樣后恒壓90V電泳至樣品進入分離膠后，提高電壓至120V繼續電泳直至樣品達到分離膠底部。將凝膠置入0.25%考馬斯亮藍R250染色劑內染色30min，最后用脫色液(甲醇:冰醋酸:水為50:10:40)脫色處理后，掃描儀掃描成像。
[0021]3.2蛋白印跡法鑒定
蛋白樣品稀釋100倍后上樣，電泳過程同3.1。所得凝膠經轉膜封閉漂洗等處理后，依次加鼠抗GST單克隆抗體(1:5000稀釋)以及帶有熒光基團標記的抗鼠二抗(1:5000稀釋)覆育。最后于Odyssey成像系統掃描成像。
[0022]實驗結果示例
通過PCR的方法擴增大腸桿菌野生菌株的IuxS基因，并插入表達載體pGEX4T-l中，通過雙酶切鑒定的方法確認了重組克隆的構建成功(參見附圖2、3)。
[0023]經過IPTG的誘導，重組蛋白LuxS得以表達。考馬斯亮藍染色結果顯示了蛋白的表達，同時蛋白印記雜交方法利用了抗載體自帶標簽GST的抗體,進一步驗證了 GST-LuxS融合蛋白的表達。(結果參見附圖4)。
[0024]5.體外誘導濃度示例
體外表達質粒由于需要IPTG的誘導，才可表達所攜帶的蛋白基因，因此當調節誘導劑的濃度時，也可影響到對整個LuxS信號系統的調節。本發明中，也比較了在不同IPTG濃度誘導條件下，菌株MDAI2 (IuxS缺陷株，不表達LuxS)與M-L (缺陷株攜帶有構建完成的LuxS體外表達質粒)之間密度感應調控下游基因fliA基因轉錄水平的差異。實驗結果顯示(參見附圖5)，在未經誘導的情況下M-L菌株的fliA基因是MDAI2的0.86倍；而當IPTG濃度為0.01mmol/L的時候相應的基因表達為1.99倍；0.lmmol/L的時候為1.08倍；lmmol/L 為 1.39 倍。
[0025]通過調節誘導物的濃度以及誘導時間，可控制蛋白表達的數量，說明能滿足不同實驗的需求，尤其是密度感應信號系統相關實驗的需求，為不同目的、不同條件的實驗提供更相近的陽性對照組別。
[0026]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。`
【權利要求】
1.大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒，其特征在于，通過限制性核酸內切酶的作用，將體外PCR擴增出的LuxS基因片段消化并連接到載體PGEX4T-1上，構建出大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒。
2.權利要求1所述的大腸桿菌LuxS蛋白體外表達質粒在密度感應信號系統研究中的 應用。
【文檔編號】C12N15/70GK103805625SQ201210456370
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月14日 優先權日:2012年11月14日
【發明者】黃正蔚, 王倩 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院