發酵生產9-oh-ad的恥垢分枝桿菌、菌劑、制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種生產甾體激素的菌株和制備方法，具體是一種發酵生產9-OH-AD的恥垢分枝桿菌、菌劑、制備方法和應用，恥垢分枝桿菌（Mycobacterium?smegmatis）保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO:M?2013544，本發明的菌株發酵制備9-OH-AD，有效的抑制了9-OH-AD的1,2位脫氫，進而抑制了其降解，提高了收率，重量收率可達到50～55%。
【專利說明】發酵生產9-0H-AD的恥垢分枝桿菌、菌劑、制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生產留體激素的菌株和制備方法，具體是一種發酵生產9-0H-AD的恥垢分枝桿菌、菌劑、制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]近代，有關使用微生物法轉化植物留醇制備留體中間體的研究成果被廣泛報道和研究，相關報道最早可追溯到1937年，Mamoli和Vercellone發表的兩篇專利Ber.70470和Ber.70，2079，在專利中，他們針對使用酵母菌將17-羰基還原為17-P -羥基進行了闡述。此后，peterson和Murray在US Pat.N0.2602769中闡述了黃體酮11位a羥基化。1972年，Kraychy 等在 US Pat.N0.3684657 闡述了用 Mycobacterium SP.NRRL B-3683 降解 17 位脂肪鏈制備4-AD, ADD的方法。1973年，Marsheck等在專利US Pat.N0.3759791中闡述了用
[0003]Mycobacterium SP.NRRL B-3805，以膽甾烷等17位有8個以上碳原子的甾體原料制備4_AD。 [0004]9-0H-AD是制備可的松的重要中間體，迄今為止，有很多文獻報道了 9-0H-17-羰基相關留體特別是9-0H-AD的制備方法，US patent4397947報道了用諾卡氏菌轉化4-AD到9-0H-AD 的方法，EP-A-0027829 報道了用 Corynespora cassicola 菌轉化 4-AD 到 9-0H-AD的方法。1977年Merle G.等在US Pat.N0.40352236中闡述了由植物甾醇制備9-0H-AD的過程。US patent3759791報道了使用分支桿菌，以留醇為底物制備9-0H-AD的方法。1988年，專利GB2197869報道了由Mycobacterium roseum,以留醇為底物制備9-0H-AD的方法，重量收率 28.5%，1986 年，EP0322081B1 中，Sli jkhuls 等闡述了使用菌種 Mycobacteriumspecies CBS482.86將甾醇轉化9-0H-AD的實例，其投料量約1.3%(90%含量)，轉化216小時，HPLC重量收率42.1%。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種發酵植物留醇生產9-0H-AD的恥垢分枝桿菌，菌劑，制備方法和應用，本發明生產9-0H-AD的重量收率高，發酵效率高。
[0006]本發明所使用底物為植物甾醇，菌株為恥垢分枝桿菌NK-XHX-118(MyCObaCteriumsmegmatis NK-XHX-118)，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為:CCTCC NO:M2013544。
[0007]上述恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis) CCTCC NO:M2013544 通過自行米集得到的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis) 0)116誘變培育得到。
[0008]誘變過程如下:
[0009]1、原始菌株為恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)0)116,該菌株能夠降解植物留醇，于堆積植物留醇場地附近的土壤中篩選得到。
[0010]將原始菌株在30°C培養，180rpm培養，培養基:蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.1%，丙酸鈉0.05%，pH值用10%氫氧化鈉溶液調至7.0，121°C滅菌30分鐘。
[0011]當菌體密度生長至5X108個/ml，離心，菌體用pH=5.6，0.lmol/L無菌檸檬酸鈉溶液沖洗，并用檸檬鈉溶液將菌體稀釋到原來的體積，再加入亞硝基胍，亞硝基胍濃度:60ii g/ml，菌懸液于37°C水浴半小時，再次離心，菌體用等量的0.lmol/L, pH=7的磷酸緩沖液沖洗。最后，菌體重新在0.lmol/L,pH=7的磷酸緩沖液中懸浮分散，得誘變后的菌懸液。
[0012]2、菌株篩選
[0013]初篩培養基:葡萄糖1%，磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.4%，七水硫酸鎂0.03%,七水硫酸亞鐵0.005%,瓊脂2%，pH=7.5，培養基121°C滅30min。
[0014]復篩培養基:9-0H-AD0.2%,磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.4%，七水硫酸鎂
0.03%,七水硫酸亞鐵0.005%,瓊脂2%, pH=7.5。培養基121°C滅30min。
[0015]將誘變后的菌懸液進行稀釋涂布，培養基采用初篩培養基，于30°C培養7天。挑取單菌落接種到復篩培養基中，凡是在復篩培養基中不能生長的菌體，用初篩培養基進行進一步的培養純化，得到誘變后的菌株。
[0016]3、菌種搖瓶轉化測試
[0017]液體種子培養基:葡萄糖1%，酵母膏0.6%，磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.4%，七水硫酸鎂0.03%,七水硫酸亞鐵0.005%, pH=7.5，培養基121°C滅30min。
[0018]轉化培養基:磷酸二氫鉀0.08%,三水磷酸氫二鉀0.42%，磷酸氫二銨0.3%，葡萄糖0.5%，P -環糊精(粉末)2%，植物甾醇0.5%，pH=8.0。
[0019]誘變后的菌株于30°C，180rpm培養72小時，接種到轉化培養基中，接種量20%，轉化條件:30°C，220rpm，轉化72小時，取樣送液相檢測，根據液相結果確定目標菌株優劣，得到一株優秀的變異菌株，將之命名為恥垢分枝桿菌NK-XHX-118(Mycobacterium smegmatisNK-XHX-118),即恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis) CCTCC NO:M2013544。
[0020]本發明還提供一種含恥垢分枝桿菌的液體菌劑，所述恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis) CCTCC NO:M2013544 的菌體濃度達到 10 億個/ml 以上。
[0021]本發明的恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis) CCTCC NO:M2013544 的特征為:在不同生長環境下，菌體呈現不同形態，但基本上為桿狀，菌落為灰白色或淡黃色，菌體尺寸一般較其他細菌小，通常長1.5~2.5微米，寬0.3~0.4微米。其16S rRNA基因序列為SEQ ID No:1。其序列為:
[0022]TGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTT TGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATGACCACGCGCTTCATGGTGTGTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAATAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTATAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACA
TGCACAGGACGACTGCAGAGATGTGGTTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT
CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGT
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GATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGT
TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAG
GGAGCCGTCGAA。
[0023]本發明的發酵反應方程式可為:
[0024]
【權利要求】
1.一種發酵生產9-0H-AD的恥垢分枝桿菌，其特征是，所述恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0:M2013544。
2.一種含權利要求1所述恥垢分枝桿菌的液體菌劑，其特征在于，所述液體菌劑中，所述恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的菌體濃度達到10億個/ml以上。
3.一種根據權利要求2所述的恥垢分枝桿菌的液體菌劑的制備方法，其特征是， (1)斜面種子培養:將恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis) CCTCC N0:M2013544接種于斜面種子培養基，28~32°C培養； (2)一級種子培養:把上述斜面種子培養的菌落加入液體種子培養基中培養，溫度為28 ~32。c； (3)二級種子培養:一級種子培養后的菌液接種到液體種子培養基中，接種量為9~11%，溫度為28~32°C，得液體菌劑。
4.根據權利要求3所述的恥垢分枝桿菌的液體菌劑的制備方法，其特征是，所述斜面種子培養基配方為，玉米衆9~llg/L、硫酸銨1.3~1.7g/L、磷酸二氫鉀0.45~0.55g/L、磷酸氫二鉀0.5~0.6g/L、蔗糖0.45~0.55g/L、七水硫酸鎂0.18~0.22g/L、七水硫酸亞鐵0.004~0.006g/L、七水硫酸鋅0.001~0.003g/L、瓊脂18~22g/L，調節pH值為7.1 ~7.2。
5.根據權利要求3所述的恥垢分枝桿菌的液體菌劑的制備方法，其特征是，液體種子培養基配方為，玉米衆9~llg/L、硫酸銨1.3~1.7g/L、磷酸二氫鉀0.45~0.55g/L、磷酸氫二鉀0.5~0.6g/L、蔗糖9~118/1、七水硫酸鎂0.18~0.22g/L、七水硫酸亞鐵0.004~.0.006g/L、七水硫酸鋅0.001~0.003g/L，調節pH值為7.1~7.2。
6.—種如權利要求2所述恥垢分枝桿菌的液體菌劑在發酵生產9-0H-AD中的應用，其特征是，將合格的液體菌劑接種到轉化培養基中，接種量為9~11%，轉化溫度為28~32°C，轉化完全后，離心，離心后的發酵液用氯仿提取，濃縮，冷卻，抽濾，濾餅層用甲醇沖洗，得 9-OH-AD。
7.如權利要求6所述恥垢分枝桿菌的液體菌劑在發酵生產9-0H-AD中的應用，其特征是，所述轉化培養基重量配方為，磷酸二氫鉀0.07~0.09%，三水磷酸氫二鉀0.4~0.5%，磷酸氫二銨0.2~0.4%，葡萄糖0.45~0.55%，^ -環糊精6~7%，植物甾醇1.8~2.2%，質量濃度為20-40%的有機硅消泡劑0.045~0.055%,微量營養物3~5%，pH為7~9，所述微量營養物的成分為七水硫酸鎂0.8~1.2%，七水硫酸鐵0.45~0.55%，七水硫酸鋅.0.08~0.12%，質量濃度為20~40%的硫酸0.05%，其余為水。
8.如權利要求6所述恥垢分枝桿菌的液體菌劑在發酵生產9-0H-AD中的應用，其特征是，發酵培養的轉速為400~600rpm，空氣流量為0.18~0.22Nm3/h,罐壓0.045~.0.055MPa。
【文檔編號】C12P33/00GK103667126SQ201310628652
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】劉喜榮 申請人:湖南新合新生物醫藥有限公司