平邑甜茶無融合生殖MhSERK1基因植物表達載體構建方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了平邑甜茶無融合生殖MhSERK1基因植物表達載體構建方法與應用，本發明所構建的表達載體pBI121-MhSERK1是由MhSERK1基因插入到PGM-T，經XbaI和SmaI雙酶切后連接到pBI121的XbaI和SmaI位點得到的重組質粒。該植物表達載體用于植物遺傳轉化，MhSERK1在CaMV35S啟動子的啟動下表達，對植物的生殖發育過程產生調控作用，使植物不經過生殖細胞的融合可以正常產生種子，達到無融合生殖的作用。
【專利說明】平邑甜茶無融合生殖MhSERKI基因植物表達載體構建方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，涉及蘋果屬平邑甜茶無融合生殖基因MhSERKl表達載體和構建方法及應用。
【背景技術】
[0002]無融合生殖是發育生物學領域的重要科學問題。與有性生殖獲得的種子相比，無融合生殖后代的遺傳背景與母本一致，不發生性狀分離，在植物育種中，無融合生殖可以固定雜種優勢；對于一些無性繁殖的植物，無融合生殖產生無性種子可以克服無性繁殖的不便，避免長期營養繁殖造成的親本退化；因此，有關植物生殖機理方面的研究一直是生命科學研究領域的熱點之一。
[0003]平邑甜茶(Malushupehensis Rehd.var.pingyiensis Jiang)是薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)湖北海棠(Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.)的一個變種，也是典型的無融合生殖型三倍體植物。主產于山東平邑縣蒙山白云巖和惡峪一帶，小葉呈紅色，似茶葉故稱平邑甜茶。平邑甜茶是蘋果的優良砧木之一，也是我國特有的植物資源，其耐澇性和耐鹽性較強，在生產上具有重要的應用價值，同時平邑甜茶具有高度的無融合生殖能力，與西府海棠、山定子等其它蘋果砧木相比，其實生苗整齊一致，個體差異小，遺傳穩定，因此，平邑甜茶是無融合生殖型矮化砧木育種的重要母本材料。多年來，平邑甜茶的相關研究主要集中在遺傳育種、胚胎發育、抗性等方面的研究，近年來隨著分子生物學的發展，在基因的克隆、功能鑒定以及生理功能等方面開展無融合生殖分子機理和遺傳機理方面的研究，并通過基因工程方法對其生殖機理和功能進一步加以驗證。
[0004]近年來,對植物體細胞胚胎發生相關類受體蛋白激酶(Somatic embryogenesisreceptor-like kinases, SERKs)類基因的研究表明:在植物的生長發育過程中，SERK基因及其家族成員在小孢子發育、體胚發生、激素感應、無融合生殖及抗病抗逆反應中都具有一定的功能。課題組在前期研究過程中在平邑甜茶子房中已分離獲得MhSERKl基因片段，該序列經NCBI數據庫Blast比對，預測為體胚發生類受體蛋白激酶基因(本發明將其命名為MhSERKl)片段，而MhSERKl基因的功能是什么，是否可以使普通植物也具有無融合生殖特性，于是本發明將通過MhSERKl基因植物表達載體構建與遺傳轉化，希望獲得該基因的具體功能，以便能夠通過基因工程手段獲得更好的品種資源。
[0005]對于蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因，目前還未見其載體構建及其基因功能的報道，而本發明經實驗驗證，該基因在植物無融合生殖過程中可以使植物不經過兩性生殖細胞的融合產生可育的種子，可以為深入研究無融合生殖的遺傳機制和分子機
理奠定基礎。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供該蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因的植物表達載體構建方法和應用。所構建的植物表達載體可直接用于農桿菌介導的植物遺傳轉化，創制無融合生殖新種質，用于植物品種遺傳改良。
[0007]技術方案如下:
[0008]平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因，該基因序列為SEQ ID N0.1。
[0009]平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因的植物表達載體，由本發明所述的平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因與中間植物表達載體PBI121構成。
[0010]平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因的植物表達載體pBI 121-MhSERKl的構建方法，包括如下步驟:
[0011]DMhSERKl基因的克隆
[0012]提取平邑甜茶發育時期的子房總RNA，然后反轉錄獲得cDNA第一鏈；設計引物擴增MhSERKl基因:
[0013]上游引物S1: 5 ’ -GGATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3 ’
[0014]下游引物S2:5 ’ -ACTTACCTTGGACCGGATAACT-3 ’
[0015]以反轉錄獲得的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式PCR擴增反應，產物連接到PGM-T載體，轉化T0P10感受態細胞，進行序列測定；
[0016]2)植物表達載體pBI 121-MhSERKl的構建
[0017]設計引物以平邑甜茶子房cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應，在MhSERKl基因的上下游設計一對引物，并分別引入酶切位點XbaI和SmaI序列:
[0018]上游引物MhSERKl-Xba1:5’ -GGTCTAGAATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
[0019]下游引物MhSERKl-Sma1:5’ -ACCCCGGGTTACCTTGGACCGGATAACTC-3’
[0020]PCR產物連接到PGM-T載體得到重組質粒PGM-T-MhSERKl，轉化T0P10感受態細胞；提取陽性質粒PGM-T-MhSERKl和pBI121，并用XbaI和SmaI雙酶切后，連接，轉化，篩選并測序驗證，植物表達載體pBI 121-MhSERKl構建成功。
[0021]3)MhSERKl的植物表達載體用于農桿菌介導的植物遺傳轉化，創制植物新品種。方法如下:
[0022]農桿菌菌株EHA105感受態細胞制備，具體步驟如下:
[0023](I)將凍存的農桿菌EHA105菌液在含有50mg.L—1利福平(Rif)的YEP (pH=7.0)固體培養基上涂板培養，28 °C倒置培養48h。
[0024](2)待培養基上長出菌斑，挑取農桿菌EHA105單菌落接種于含有50mg.T1Rif的YEP (pH=7.0)液體培養基中，28°C，200rpm.mirT1 振蕩培養過夜(16_20h)。
[0025](3)取上述菌液按1:50比例接種于50mL含有50mg.T1Rif的YEP (pH=7.0)液體培養基中，28°C，150rpm.mirT1振蕩培養。
[0026](4)當震蕩培養液體0D600達到0.5左右時，用1.5mL離心管取1.5mL搖好的菌液，冰上冷卻 IOmin, 5000rpm.mirf1 離心 5min。
[0027](5)棄上清液，收集菌體，加入等體積冰預冷的25mM CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置 20min 至 4°C 離心機 5000rpm.mirT1 離心 5min。
[0028](6)棄上清液，每管加入50 μ L預冷的25mM CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置20min后使用。剩余的感受態細胞在液氮中速凍后于_80°C超低溫冰箱中保存。
[0029]凍融法轉化大腸桿菌，具體操作如下:[0030]取質粒DNAlO μ L加入30-100 μ L農桿菌感受態細胞ΕΗΑ105，用槍尖輕輕吹打均勻混合，放于冰盒冰浴5min ;轉入液氮冷凍lmin，將離心管迅速置于37°C水浴5min，再迅速冰浴2min，然后將其加入800 μ L YEP (ρΗ=7.0)液體培養基，28°C，160rpm.mirT1震蕩培養4_6h,離心后剩約100 μ L菌液涂布于含50mg.L-1Rif和50mg.L-1Kan的YEP (pH=7.0)固體培養基(胰蛋白胨lg，酵母浸粉lg，NaCI0.5g，瓊脂粉1.5g，融解于IOOmL無菌水中，經高溫高壓滅菌凝固，下同)中，28 °C倒置培養48h，出現菌斑。
[0031]煙草葉片浸染；
[0032]PCR 鑒定。
[0033]本發明提供平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因在普通植物中的應用。
[0034]本發明的有益效果:
[0035]I)本發明提供的平邑甜茶MhSERKl是一個新的無融合生殖基因，該基因可使普通植物具有無融合生殖特性。
[0036]2)本發明構建的MhSERKl基因植物表達載體首次報道，可直接用于農桿菌介導的遺傳轉化，創制無融合生殖新品種，提高無融合生殖能力，可進行植物品種改良。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1:為MhSERKl瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0038]圖2:pGM-MhSERKl 質粒 XbaI 和 SmaI 雙酶切；
[0039]M:200bp DNAmark·er ;泳道1-4:平邑甜茶；泳泳道5_8:pBI121表達載體
[0040]圖3:pBI121-MhSERKl 表達載體 XbaI 和 SmaI 雙酶切檢測圖:M:lkb DNAmarker ；泳道1-4:平邑甜茶；
[0041]圖4:植物表達載體pBI121-MhSERKl構建方法示意圖；
[0042]圖5:轉基因煙草植株與對照植株比較；
[0043]圖6 =PCR鑒定煙草轉基因植株MhSERKl基因表達；
[0044]M:100bp Marker ;泳道:1清水，2未轉化對照植株，3質粒陽性對照；A:4_10是MhSERKl轉化煙草植株；
【具體實施方式】
[0045]植物表達載體pBI121_MhSERKl的構建
[0046]實施例1:平邑甜茶無融合生殖MhSERKl基因的克隆:
[0047]1、總RNA的提取及反轉錄成cDNA:
[0048](I)總RNA的提取使用TIANGEN生化科技公司的RNApr印pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441)獲得，具體操作見試劑盒說明書。
[0049](2)反轉錄cDNA的合成利用寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScript?RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將 RNA 反轉錄為cDNA，作為PCR模板備用。
[0050]2.利用Primer Primer5.0軟件分析設計引物擴增MhSERKl ;
[0051]上游引物MhSERKl-F:5’ -GGATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
[0052]下游引物MhSERKl-R:5’ -ACTTACCTTGGACCGGATAACT-3’[0053]以提取的平邑甜茶子房cDNA為模板，進行PCR反應。
[0054]反應體系:25 μ L體系，取I μ L cDNA加入Taq DNA聚合酶0.25 μ L，10XPCRBuffer2.5μ L, dNTPs (2.5mmol.L-1) 2.0 μ L，正反向引物各 1 μ L，最后用水補足到25μ L ;反應程序:95°C 5min ；94°C 40s, 60 °C 40s, 72 °C 2min，35 個循環；72°C 延伸 IOmin ；PCR擴增產物經濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶，用AXYGEN凝膠回收試劑盒回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa)將回收產物連接至pGM_T載體，然后轉化大腸桿菌感受態細胞T0P10 (TIANGEN生化科技公司購買)，經PCR篩選，進行序列測定；
[0055]實施例2:植物表達載體pBI 121-MhSERKl的構建
[0056]1主要試劑:質粒提取試劑盒購自TIANGEN生化科技有限公司；T4DNA連接酶、限制性內切酶XbaI和SmaI購自大連寶生物工程有限公司；含質粒pBI121的菌種由沈陽農業大學園藝學院提供。
[0057]2重組植物表達載體pBI 121-MhSERKl的構建
[0058]2.1引物設計:根據目的基因MhSERKl核苷酸序列設計上下游引物，分別引入XbaI(TCTAGA)和SmaI (CCCGGG)酶切位點，引物為:
[0059]上游引物MhSERKl-Xba1:5’ -GGTCTAGAATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
[0060]下游引物MhSERKl-Sma1:5’ -ACCCCGGGTTACCTTGGACCGGATAACTC-3’
[0061]2.2PCR擴增:以實驗例I中的cDNA第一鏈為模板，引物MhSERKl-XbaI和MhSERKl-SmaI 做 PCR 擴增:體系為 25 μ L:取 I μ L cDNA 加入 Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L,10XPCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (2.5mmol.L-1) 2.0 μ L，正反向引物各 I μ L，最后用無菌水補足到 25 μ L ;反應程序:95°C 5min ；94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 2min，35 個循環；72°C 延伸IOmin ；
[0062]2.3電泳:將2.2擴增的PCR產物經1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶，與預期結果相符。
[0063]2.4將2.2中PCR產物電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至PGM-T載體得到重組載體PGM-T-MhSERKl，然后轉化T0P10感受態細胞，提取陽性質粒，XbaI和SmaI雙酶切的MhSERKl片段與XbaI和SmaI雙酶切的pBI121連接，轉化，提取陽性質粒，酶切電泳檢測并測序驗證。
[0064]2.5將2.4含重組載體PGM-T-MhSERKl的陽性菌液進行培養，并采取普通質粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重組質粒PGM-T-MhSERKl ;將實驗室提供的含有植物表達質粒PBI121的菌種擴大培養，用同樣的方法提取質粒PBI121，將提取的PGM-T-MhSERKl質粒和pBI121質粒分別用XbaI和SmaI限制性內切酶雙酶切，酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，并切下PGM-T-MhSERKl質粒的小片段和pBI121質粒的大片段，利用膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶連接小片段和大片段(連接體系為:小片段2.7 μ L，大片段7 μ L，T4DNA連接酶I μ L，10 X Bufferl.5 μ L，ddH20不足至15 μ L)過夜連接，然后利用熱激法轉化大腸桿菌T0P10 ；PCR篩選陽性克隆，再進行測序驗證，得到序列完全正確的重組表達載體pBI 121-MhSERKl及含該重組表達載體的大腸桿菌。
[0065]2.6pBI121-MhSERKl重組質粒轉化農桿菌:從2.6中含pBI121_MhSERKl載體的菌株中提取重組質粒，用冷激法轉化農桿菌EHA105，轉化方法為:①去1(^1^質粒0嫩，加入30-100 μ L農桿菌感受態細胞ΕΗΑ105，充分混勻，冰浴5min，轉入液氮冷凍Imin ;②迅速轉入37°C水浴5min后，加入800 μ LYEP液體培養基(稱取胰蛋白胨lg，酵母浸粉lg，NaCI0.5g,融解于IOOmL無菌水中，經高溫高壓滅菌備用；下同)?’③28°C, 150rpm預培養4_5h，然后涂布于含有Kan (50mg(50mg f1)的YEP平板，28°C培養48h后可出
現菌落；④挑取菌體做PCR鑒定，確定正確后保存于_70°C，即為植物遺傳轉化的工程菌株。
[0066]實施例3:植物表達載體pBI 121-MhSERKl的遺傳轉化
[0067]I)農桿菌菌株EHA105感受態制備及凍融法轉化
[0068]農桿菌菌株EHA105感受態制備，具體步驟為:
[0069](I)將凍存的農桿菌EHA105菌液在含有50mg.L—1利福平(Rif)的YEP (pH=7.0)固體培養基(同上)上涂板培養，28 °C倒置培養48h。
[0070](2)待培養基上長出菌斑，挑取農桿菌EHA105單菌落接種于含有50mg.L4Rif的YEP (pH=7.0)液體培養基中，28°C，200rpm.mirT1 振蕩培養過夜(16_20h)。
[0071](3)用移液槍根據上述菌液的濃度確定確定吸取體積比，一般為1:50的體積比接種于50mL含有50mg.L^1Rif的ΥΕΡ(ρΗ=7.0)液體培養基中，28°C，150rpm.mirT1振蕩培養。
[0072](4)當震蕩培養液體0D600達到0.5時，用1.5mL離心管取1.5mL搖好的菌液，冰上冷卻 IOmin, 5000rpm.mirT1 離心 5min。
[0073](5)棄上清液，收集菌體，加入1.5mL的冰預冷的25mM CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置 20min 至 4°C 離心機 5000rpm.mirT1 離心 5min。
[0074](6)棄上清液，每管加入50 μ L預冷的25mM CaCl2溶液重懸沉淀，冰上放置20min后使用。剩余的感受態細胞在液氮中速凍后于_80°C超低溫冰箱中保存。
[0075]凍融法轉化大腸桿菌，具體操作如下:
[0076]取質粒DNAlO μ L加入30-100 μ L農桿菌感受態細胞EHA105 (實施例3中I)所制備的E HAIO 5感受態細胞)，用槍尖輕輕吹打均勻混合，放于冰盒冰浴5 m i η ;轉入液氮冷凍Imin，將離心管迅速置于37°C水浴5min，再迅速冰浴2min，然后將其加入800 μ LYEP (ρΗ=7.0)液體培養基(同上)，28°C，160rpm.mirT1震蕩培養4_6h，離心后剩約100 μ L菌液涂布于含50mg.L4Rif和50mg.T1Kan的ΥΕΡ(ρΗ=7.0)固體培養基中，28°C倒置培養48h，出現菌斑。挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于普通煙草葉片的遺傳轉化。
[0077]2)普通煙草葉片侵染
[0078]①將繼代15-20d的普通煙草組培苗取出，剪取煙草新萌發的幼嫩葉片，去除葉脈，剪成0.5X0.5cm葉片置于懸浮培養液中侵染備用；
[0079]②將實施例2步驟2.6中制備好的已轉化含有重組質粒的pBI 121-MhSERKl的農桿菌EHA105菌液擴大培養，放入含有IOmLYEP液體培養基(含有50mg.L^Kan+SOmg.T1Rif)的離心管中，28°C，150-200rpm/min搖菌15_20h，按照菌液濃度進行稀釋，加入IOmL的含有50mg_ L-1Kan的YEP液體培養基(同上)中，28°C，150-200rpm振蕩培養4_6h，至菌液濃度OD=0.4-0.6.[0080]③將懸浮液中的葉片放入農桿菌菌液中進行浸染8-10min，用滅菌的濾紙將多余的菌液吸凈，將葉片置于培養基(MS+6-BA1.0mg. '+ΝΑΑΟ.lmg.L—1)上共培養3d ；
[0081]④共培養3d后，將浸染的煙草葉片用懸浮液進行清洗，然后用無菌濾紙吸干多余農桿菌菌液，再置于篩選培養基(MS+6-BA1.0mg.L_1+NAA0.lmg.L^+KanlOOmg.L^+CefSOOmg. 1)上，黑暗條件下進行篩選培養；(MS培養基是常用的公知的培養基)[0082]⑤I個月后，在浸染的葉片上長出愈傷組織，當葉片邊緣出現抗性芽后，再將抗性芽轉移到新的增殖培養基(MS+Kanl00mg.L^+CefSOOmg.L-1)中進行增殖培養，至得到TO代轉化植株。
[0083]實施例4:植物表達載體pBI 121-MhSERKl的遺傳轉化煙草抗性植株的基因功能驗證
[0084]待抗性苗長至5~7片葉時，選用基因組提取試劑盒提取抗性煙草植株葉片的基因組DNA，以基因組DNA為模板，做PCR檢測驗證是否為轉基因煙草，反應體系為25 μ L:體系為上下游引物(MhSERKl-XbaI 和 MhSERKl-SmaI)各 I μ L,ExTaq2.5 μ L, dNTP (2.5mol/L)2 μ L，DNA 模板 I μ L，ddH20 補足至 25 μ L。PCR 反應程序為:95°C 5min，94°C 40s, 58°C 40s,72°C 2min，30個循環；72°C延伸lOmin。PCR結束后，用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測為陽性。
[0085]將該MhSERKl基因轉入普通煙草植物受體系統后，當根系長至5_7條時，進行煉苗3-5天，然后將抗性苗移栽到土中，用塑料薄膜覆蓋以保濕，放入大棚中遮陰培育。
[0086]經過2-3月培育TO代轉化抗性株系后，煙草植株逐漸產生花蕾，在花蕾即將開放前將一部分煙草抗性植株采取去雄處理；未轉化煙草對照植株采取去雄處理；
[0087]經過一段時間生長發育后對處理植株進行觀察發現:采取去雄處理的煙草抗性植株可以正常結種子，而對照未轉化煙草植株經過去雄處理后未能結種子。
[0088]通過上述實驗說明MhSERKl基因是無融合生殖相關基因，驗證了該基因無融合生殖功能，即不通過兩性生殖細胞的結合可以正常產生種子。
[0089]綜上所述，本發明構建了含有無融合生殖相關MhSERKl基因編碼的植物表達載體pBI121-MhSERKl，其中MhSERKl基因為首次報道。所構建的載體可導入植物中，可用于研究植物的無融合生殖分子機理。
[0090]以上所揭露的僅為本發明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利范圍，因此依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬于本發明所涵蓋的范圍。
【權利要求】
1.蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因植物表達載體，其特征在于是由平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因與植物表達載體PBI121構成。
2.根據權利要求1所述的蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因的植物表達載體，其特征在于所述的植物表達載體為XbaI和SmaI雙酶切MhSERKl后插入到表達載體PBI121質粒進行重組反應得到。
3.如權利要求2所述的平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因植物表達載體的構建方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)平邑甜茶無融合生殖MhSERKl基因的克隆 提取平邑甜茶發育時期的子房總RNA，然后反轉錄獲得cDNA第一鏈；設計引物擴增MhSERKl 基因:
上游引物 S1: 5 ’ -GGATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3，
下游引物 S2:5 ’ -ACTTACCTTGGACCGGATAACT-3， 以反轉錄獲得的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式PCR擴增反應，產物連接到PGM-T載體，轉化TOPlO感受態細胞，進行序列測定； 2)植物表達載體pBI121-MhSERKl的構建 設計引物以平邑甜茶子房cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應，在MhSERKl的上下游分別引入酶切位點XbaI和SmaI序列:
上游引物 MhSERKl-Xba·1:5’ -GGTCTAGAATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
下游引物 MhSERKl-Sma1:5’ -ACCCCGGGTTACCTTGGACCGGATAACTC-3’ PCR產物連接到PGM-T載體得到重組質粒PGM-T-MhSERKl，轉化T0P10感受態細胞；提取質粒PGM-T-MhSERKl和pBI121，并用XbaI和SmaI雙酶切后連接，轉化，篩選并測序驗證，植物表達載體pBI 121-MhSERKl構建成功。
4.如權利要求1所述的蘋果屬平邑甜茶無融合生殖相關MhSERKl基因植物表達載體，其特征是在植物無融合生殖發育特性中的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK103849646SQ201310641283
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】張麗杰, 董文軒, 王玉霞, 孫曉梅, 祁慶欽 申請人:沈陽農業大學