一種氯化鈉-氨水、丙酮協同純化激肽釋放酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種氯化鈉-氨水、丙酮協同純化激肽釋放酶的方法。本發明的技術方案是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜等傳統蛋白純化技術，制備激肽釋放酶。本發明具有生產周期短，操作簡單，對化學和熱穩定性好、成本低廉的特點，非常適用于規模化大生產。
【專利說明】—種氯化鈉-氨水、丙酮協同純化激肽釋放酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地說是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜等傳統蛋白純化技術，制備激肽釋放酶。
【背景技術】
[0002]激肽釋放酶(kallikein)是從豬胰臟中分離純化制得的天然酶類藥物，臨床上又稱血管舒緩素，具有舒展毛細血管和小動脈的作用，在臨床上常用來治療高血脂，防治脂肪肝、動脈粥樣硬化、高血壓、心絞痛等多種疾病，它的開發具有重要的醫學和社會價值。在我國，激肽釋放酶生產還存在很大的發展空間。 [0003]現代生物醫藥產業研究中，專家多采用離子交換層析、樹脂吸附層析等各種高端色譜分離技術提純得到各種酶類和蛋白。而選擇離子交換樹脂的主要依據是被分離物的性質和分離目的，包括被分離物和主要雜質的解離特性、分子量、濃度、穩定性、所處介質的性質以及分離的具體條件和要求。其中最重要的一條是根據分離要求和分離環境保證分離目的物與主要雜質對樹脂的吸附力有足夠的差異。被分離物中雜質越多，這種差異性顯然會越不明顯。在實際大生產中，原料中都含有雜質，如果在采用這些高端色譜技術之前，不對原料或者粗制品進行預處理，勢必會因為原料中的雜質含量過多而減短離子交換介質的壽命，降低樹脂吸附效率，且洗脫中會存在拖尾現象，延長生產周期，影響產品收率及比活。如李立桓等利用Amberlite-CG50從胰酶中分離純化激肽釋放酶,通過色譜分離技術得到的激肽釋放酶比活、純度更高。
[0004]激肽釋放酶是以的豬胰臟為原料，因此，必須對原料進行預處理、提純得到粗制的激肽釋放酶，然后再采用離子交換層析技術進行精制生產。
[0005]本發明是靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂、脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜等傳統蛋白純化技術，從豬胰臟中制備激肽釋放酶，該技術不僅操作簡單、生產成本低廉，而且避免了激肽釋放酶降解失活，提高產品比活。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是純化從合格的豬胰臟中提取激肽釋放酶。
[0007]本發明的技術方案是:以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜等傳統蛋白純化技術，制備激肽釋放酶。本發明具有生產周期短，操作簡單、成本低廉的特點，非常適用于規模化大生產。包括如下步驟:
[0008](I)醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液；
[0009](2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀，沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得激肽釋放酶粗品；
[0010](3)氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜:將粗品用45-55倍量的2-10°C氯化鈉溶液溶解，用氨水調PH至7.5-8.5，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液冷至0-5°C，，加入2_10°C丙酮使溶液濃度達40%，攪勻，靜置10-14小時，離心，得上清液；將上清液中補加2-10°C丙酮至溶液濃度達60%，靜置4-8小時，離心，收集沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得激肽釋放酶；
【具體實施方式】
[0011]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0012]實施例1
[0013]所述的以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜等現代蛋白純化技術，制備激肽釋放酶，包括如下步驟:
[0014]1、醋酸提取:將豬胰臟IOkg制成丙酮粉后，加入30倍量的醋酸溶液，攪拌提取，離心，得上清液30L。
[0015]2、丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得激肽釋放酶粗品96g。
[0016]3、氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜:將粗品用50倍量的8°C氯化鈉溶液溶解,用氨水調PH至8.0，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液冷至2V，加入5°C丙酮使溶液濃度達40 %，攪勻，靜置12小時，離心，得上清液；將上清液中補加5°C丙酮至溶液濃度達60%，靜置4小時，離心，收集沉淀。沉淀用 丙酮、乙醚洗滌，干燥，得激肽釋放酶64g。
[0017]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【權利要求】
1.一種氯化鈉-氨水、丙酮協同純化激肽釋放酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液； (2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀，沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得激肽釋放酶粗品； (3)氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜:將粗品用氯化鈉溶液溶解，用氨水調PH，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液中加入丙酮，攪勻，靜置，離心，得上清液；將上清液中補加丙酮，靜置，離心，收集沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得激肽釋放酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，激肽釋放酶粗品與氯化鈉溶液的比例為IKg:45~55L，氯化鈉溶液的溫度為:2~10°C，氯化鈉溶液的濃度為:0.1 %~0.3%。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，用氨水調節溶液的PH值為:7.5 ~ 8.50
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，濾液的溫度應冷至0~5°C。
5.根據權利要求1所 述的方法，其特征在于:步驟(3)中，第一次加入丙酮的量為至溶液濃度達到40% ;補加丙酮的量為至溶液濃度達到60% ;丙酮的溫度為:2~10°C。
【文檔編號】C12N9/64GK103667223SQ201310647981
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】劉乃山, 李靜潔, 劉君, 張曉涵 申請人:青島康原藥業有限公司