鑒定、合成、優化和表征蛋白調節劑的化合物和方法

鑒定、合成、優化和表征蛋白調節劑的化合物和方法
【專利摘要】本發明涉及鑒定、合成、優化和識別為蛋白質抑制劑或活化劑的化合物，所述蛋白質為天然存在的內源性蛋白質及某些內源性蛋白質的變體形式，并涉及鑒定所述變體的新方法。通過命中鑒定的改進、先導優化、生物識別和毒性化合物的快速排除，使藥物發現和生產方法簡化，從而，所述方法加速了作為潛在治療有效藥物的化合物的鑒定和研發。由于效率的相應增加，該實施導致藥物發現過程中的總成本降低。
【專利說明】鑒定、合成、優化和表征蛋白調節劑的化合物和方法
[0001]本申請是申請日為2006年11月24日、申請號為200680051498.8、發明名稱為“鑒定、合成、優化和表征蛋白調節劑的化合物和方法”的發明專利申請的分案申請。
[0002]相關申請的交叉引用
[0003]本申請是2006年8月29日提交的PCT國際申請PCT/US06/33890的部分繼續申請，PCT/US06/33890是2005年5月23日提交的PCT國際申請PCT/US2005/18412的部分繼續申請，其要求2005年11月23日提交的U.S.Ser.N0.60/739，477、2005年11月23日提交的 U.S.Ser.N0.60/739，476,2005 年 12 月 2 日提交的 U.S.Ser.N0.60/741，767,2005 年 12月 16 曰提交的 U.S.Ser.N0.60/751，030、2006 年 3 月 13 曰提交的 U.S.Ser.N0.60/783，106、2006 年 3 月 23 日提交的 U.S.Ser.N0.60/785, 904、2006 年 3 月 23 日提交的 U.S.Ser.N0.60/785，817 和 2006 年 4 月 4 日提交的 U.S.Ser.N0.60/789，379 的優先權。 【技術領域】
[0004]本發明涉及鑒定、合成、優化和表征為蛋白質抑制劑或活化劑的化合物，所述蛋白質為天然存在的內源性蛋白質及某些內源性蛋白質的變體形式，并涉及鑒定所述變體的新方法。通過命中鑒定的改進、先導優化、生物識別和毒性化合物的快速排除使藥物發現和生產方法簡化，所述方法加速了作為潛在治療有效藥物的化合物的鑒定和研發。由于效率的相應增加，該實施導致藥物發現過程中的總成本降低。
[0005]發明背景
[0006]針對存在人細胞中的選擇性蛋白質靶的現代新藥物的發現/生產方法的重要組成包括:
[0007]1.鑒定抑制或活化所選靶蛋白質的〃命中〃化合物。(基于這些目的，定義命中為在給定的測試中得分為正的化合物并可具有一些研究者希望的效果和藥學性質。然而，在現代藥學研究中，實際上命中只有在實質性進一步修飾后才能成為最終的臨床候選)；
[0008]2.選擇先導化合物，在其基礎上進一步研究和改進最初的命中化合物；
[0009]3.通過一系列設計主要用于改善先導化合物對靶蛋白質的抑制或活化性質的化學修飾，優化先導化合物(其化學結構與原始命中化合物相關或一致)，但所述的化學修飾還可以改善生物利用度、血漿半衰期、或降低毒性；
[0010]4.表征指定先導化合物的生物活性譜(包括優化的先導)以確定與其它非靶蛋白質相比，其對所選的靶蛋白質的相對特異性和選擇性，一些非靶蛋白質與靶蛋白質本身密切相關(例如蛋白質家族的其它成員)；
[0011]5.設計臨床前體外和體內動物研究以評價劑量范圍、致癌性、吸收、分配、代謝、排泄、藥代動力學、口服生物利用度(如果需要的話)、藥效學、毒性和相關參數；
[0012]6.在健康志愿者和患有疾病的患者中進行的臨床測試，對其而言有效的治療性處置被認為是有益的。
[0013]本發明涉及實質改進上述步驟1-4的新方法。所述方法也可以用于產生和優化化合物，所述化合物比用目前采用的標準且簡單的方法鑒定、優化或表征的典型實驗藥物有效得多且毒性低得多。
[0014]作為努力研發先進新藥學技術的一部分，研發了本文描述的方法，通過發明可預測、可信賴的方法學，將所述藥學技術將“藥物發現”過程變成一個被更精確地描述為“藥物生產”過程，所述方法學為本領域技術人員提供必需的工具以產生靶向人類疾病中重要的特異性蛋白質的新藥物，同時減少與藥物發現/研發方法有關的時間和高額成本。
[0015]患者中耐藥性的進行性發展為使用許多類型藥物長期治療的標志，尤其是在癌癥和感染性疾病的治療領域中。已經鑒定了介導某些類型的耐藥性現象的分子機制，而在其它情況中，獲得的以及重新形成的耐受性的機制目前仍然未知。
[0016]最初認為在癌癥療法領域中相關的誘導的(獲得的)耐藥性的一種機制包括稱作P-糖蛋白(P-gp)的蛋白質表達增加。P-gp位于細胞膜中并且起藥物流出泵的作用。該蛋白質能夠從細胞中泵出毒性化學活性劑，包括許多類型的抗癌藥。因此，P-糖蛋白的增量調節通常產生對多種藥物的耐藥性。P-糖蛋白在腫瘤細胞中增量調節可以代表一種防御機制，該機制在哺乳動物細胞中發展以便防止受到毒性化學活性劑損害。目前已經鑒定了具有與P-gP類似的功能的其它相關耐藥性蛋白質，包括多藥物-抗性-相關蛋白家族成員，諸如MRPl和ABCG2。在任何情況下，在研發對指定靶蛋白具有特異性且毒性較低的化合物時，P-糖蛋白和相關ATP-結合彈夾(ABC)轉運蛋白在臨床顯著性耐藥性中的重要性已經下降。
[0017]另一種可能的獲得性耐藥的分子機制在于可選的信號途徑導致持續的細胞存活和代謝，即使原始藥物仍然對其靶標有效。此外，藥物胞內代謝的改變也可以導致治療功效喪失。此外，可以發生基因表達和基因擴增結果的改變，從而導致指定靶蛋白的表達增加或減少，并且通常需要增加藥物劑量以便維持相同作用(Adcock和Lane，2003)。
[0018]突變誘導的耐藥性通常為感染性疾病領域中出現的情況。例如，已經研發了幾種抑制在人免疫缺陷(HIV)病毒基因組中編碼的病毒逆轉錄酶或病毒蛋白酶的藥物。在文獻中充分確立了使用例如逆轉錄酶抑制劑反復治療HIV-感染的AIDS患者最終產生了對藥物的敏感性減低的病毒突變體形式。已經在編碼逆轉錄酶的基因中出現的突變賦予所述酶的突變體形式受藥物的影響降低。
[0019]考慮到錯誤被引入HIV基因組的比例，在HIV治療過程中耐藥性的出現并不令人意外。已知HIV逆轉錄酶特別具有錯誤趨向性，其中正向突變率約為3.4xl0_5種突變/堿基對/復制循環(Mansky等，J.Virol.69:5087-94 (1995))。然而，在哺乳動物細胞中編碼的內源性基因的類似突變率低一個數量級以上。
[0020]新的證據表明耐藥性還可能因涉及編碼藥物靶標的基因的突變結果產生(Gorre等，Science, 2001 ;PCT/US02/18729)。在這種情況中，使患者接觸具體的治療物質，諸如靶向特異性所關注的蛋白質(Ρ0Ι或"靶"蛋白)的指定癌癥藥物后，隱含在編碼為治療物質靶標的蛋白質的基因中出現的突變的一組細胞的過度生長。目前還不了解該細胞群的過度生長是否因已經隱含產生藥物抗性的POI的突變的患者的小百分比的預先存在的細胞所致，或這類突變是否在動物或人接觸能夠活化或抑制所述`POI的治療劑過程中或之后重新產生。任一,清況中，這類突變結果均可以產生突變的蛋白(下文定義為theramutein)，它受所述治療物質的影響程度較低或可能完全不受影響。
[0021]慢性髓細胞性白血病(CML)的特征在于在該病穩定或慢性期過程中保持分化能力的骨髓先祖(progenitor)過度增殖。多線證據已經確立了作為某些形式的CML中的致病性癌基因的Abl酪氨酸激酶的失調。這種失調通常與稱作費城染色體(Ph)的染色體易位相關，導致由與Abe I son酪氨酸激酶融合的BCR基因產物組成的融合蛋白表達，由此形成具有酪氨酸激酶活性的p210to_Ab1。相關的融合蛋白稱作pl90to_Ab1，其由BCR基因中的不同斷點產生并且已經證實出現在具有費城染色體陽性(Ph+)的急性成淋巴細胞性白血病(ALL)的患者中(Melo，1994 ；Ravandi等，1999)。轉化看起來因多信號途徑，包括那些涉及RAS、MYC和JUN的途徑活化所致。甲磺酸伊馬替尼(“ST1-571”或“GleevecK'M)為靶向Abi的激酶結構域的ATP結合位點的2-苯氨基嘧啶(Druker等，NEJM2001，p.1038)。隨后還通過其它方法已經發現了血小板衍生的生長因子(TOGF) β受體的抑制劑和Kit酪氨酸激酶，其中后者涉及胃腸道間質瘤的發生(參見下文)。 [0022]直到近期為止，尚未觀察到在使用指定內源性細胞蛋白的特異性抑制劑治療的過程中，其相應的內源性基因中的突變可以導致蛋白質不同的表達，所述蛋白質變體的細胞功能耐受所述抑制劑。Charles Sawyers和同事所做的工作(Gorre等，Science293:876-80(2001) ；PCT/US02/18729)首次證實了使用能夠抑制p210Bra_Abl酪氨酸激酶的藥物(即ST1-571)治療患者后，在編碼產生p210to_Abl癌的含有Abelson酪氨酸激酶結構域的靶蛋白的基因中隱含突變的所述患者中可能出現具有臨床意義的細胞群。各種這類突變產生p210M1的突變體形式，它們對Gleevec治療的反應性低于產生最初癌癥的形式。值得注意的是，出現的突變對突變蛋白賦予了對蛋白激酶抑制劑藥物作用的相對抗性，同時維持了一定程度的突變蛋白激酶的原始底物特異性。在Gorre等的工作前，本領域技術人員一般認為可以在接觸抑制Abelson蛋白激酶的化合物，諸如ST1-571的患者中觀察到的抗性類型可能因上述藥物抗性的其它機制中的一種或多種或由某些其它尚不了解的機制導致，但在任何情況下，所述的抗性均可以涉及不同于藥物靶標POI的靶標(蛋白質或其它)。
[0023]因此，治療臨床相關的還為現存療法靶標的蛋白質突變體形式可能極為有用。這類突變蛋白(如下文定義的theramuteins)正在被公認和理解為復發性癌癥中的重要靶標，并且還在其它疾病中變得具有重要性。存在對治療劑的需求，這類治療劑對可能在一般有效藥物療法之前、過程中或之后產生的細胞蛋白的這類藥物抗性變體形式具有活性。本發明的一個關鍵目的在于提供一種普遍的方法，本領域技術人員可以利用所述方法從高通量篩選(HTS)系統中鑒定命中、產生和優化先導化合物以及表征所述化合物的生物活性譜，而不需要依賴于較老的方法，例如無細胞的放射性配體結合測試等。本發明的另一個關鍵目的在于提供可以用作用于克服在內源性出現的蛋白質中的突變-誘導的耐藥性的潛在治療劑的化合物。
[0024]發明概述
[0025]本文描述的方法涉及基于細胞應答的藥物發現和生產系統的產生，所述系統利用所定義、預先確定的細胞特征的調節(稱為表型反應)作為工具來測量指定化合物(化學試劑、調節劑)活化或抑制所選靶蛋白質的能力。通過重復應用該方法，可以利用本文描述的方法來鑒定蛋白質調節劑(如本文所定義的)，在所述調節劑上進行先導優化，并生物表征所述調節劑的靶蛋白質特異性和選擇性。
[0026]可以對任何靶蛋白質和任何真核細胞類型使用本文描述的發明，然而條件是，首先鑒定并根據本文教導利用本發明稱為表型反應的一個基本兀素。所述方法的一個實施方案給本領域技術人員提供鑒別所選靶蛋白質的抑制劑或活性劑的能力。另一個實施方案允許本領域技術人員進行快速先導優化研究以得到潛在的臨床候選化合物。另一個實施方案給本領域技術人員提供設計具有對指定靶蛋白質具有需要程度特異性以及對所述蛋白質相對于不同但密切相關靶蛋白質家族成員具有選擇性的化合物的能力，所述靶蛋白質家族成員可能與某些祀一起存在。
[0027]化合物(包括已經批準的藥物)治療功效的改進是藥學研究中一個重要的重復出現的問題。一個通常采用的方法是從已知的化學結構開始，然后對所述結構進行其他化學修飾以改進其效力、特異性(針對靶蛋白質)、或與患者治療功效相關的其它參數。在一些情況下，起始結構可以是已知藥物。在其它情況下可以簡單地是使用無細胞或基于原代細胞篩選試驗鑒定的最初篩選命中。在其它情況下，所述化合物可以是基于篩選命中或其它模型結構的以最低限度定義的最初化學結構，且通常稱為“骨架”。就本發明目的而言，骨架定義為相對于代表性化合物除去一個或多個側鏈或環取代的化學結構，所述代表性化合物在其他方面其具有相同的骨架。例如，表4中第三個化合物可認為是骨架。
[0028]本發明一個重要的貢獻是表型反應的使用，以及確定第一化合物相對于第二化合物的細胞特異性以便確定第一化合物相對于第二化合物是否展現出改進的細胞特異性。本文描述的發明中首次報導的所述方法代表對現有技術的一個根本進步。現有技術依賴于無細胞測試系統，其利用純化或重組產生的蛋白質來測試化合物活性，并比較指定化合物對靶蛋白質與對其他蛋白質的作用，所述的其他蛋白質與靶蛋白質通常(密切或不密切)相關。可以在文獻中發現許多這類現有技術方法的實例，包括Hanke等人，1996，Warmuth 等人，US2003/0162222A1, Knight and Shokat, 2005，和其中的參考文獻。在鑒定和優化指定骨架的細胞特異性和治療功效方面，所述較老類型的無細胞方法與本發明相比，效率要低得多或完全無效。本發明的實質改進來自至少三個關鍵元素。
[0029]第一，表型反應的概念，當與測量指定化合物(例如通過確定其CSG來測定)的細胞特異性一起使用時，提供允許鑒定可能以改進的、功能上更有效的方式與靶蛋白質相互作用的化合物的系統。
[0030]第二，本發明提供鑒定化合物的方法，所述化合物還能與其他不同于靶蛋白質的細胞組分相互作用(其包括但不限于信號傳導途徑的上游或下游組分，所述信號傳導途徑涉及靶蛋白質例如單或多亞基蛋白質、蛋白質復合物、蛋白質/核酸復合物等)，其在特異性信號傳導途徑中起作用或在其中靶蛋白質在細胞內起作用的細胞傳導途徑的外圍，以促進關注的疾病狀態，例如所選的人類癌癥形式。由于在更高級有序的生物體(例如人)細胞中存在的信號傳導級聯的復雜性，目前狀態的現有技術不能完全了解關于其中指定靶蛋白質在細胞內起作用的所有機理。
[0031]第三，本發明排除了與其他非靶蛋白質交叉反應的化合物，所述非靶蛋白質不參與為其中靶蛋白質起作用的疾病狀態的基礎的信號傳導途徑。本發明排除所述化合物(其將會對患者產生不利的副作用)的能力來自使用表型反應的化合物的細胞特異性的直接比較測試，其根本上排除了對照細胞的作用。如果與參照化合物相比指定測試化合物的作用導致降低的細胞特異性，那么可以立即排除該化合物。測試化合物對靶蛋白質的效果是否更低，或測試化合物是否與其他不參與靶蛋白質的信號傳導途徑的非靶蛋白質相互作用(所述信號傳導途徑調節與靶蛋白質相關的表型反應)，或測試化合物是否只是細胞毒性的，這些都是不相關的且只是出于學術興趣。關鍵的一點是測試化合物治療有效性更低且不用作進一步考慮。這為本領域技術研究人員節約了評價各種化學結構的時間和精力。對于讀者來說重要的是，識別可能針對無細胞測試系統中的靶非常有效力并高度有效的化合物可能顯示相對低的CSG測定并因此可能被很快排除，從而節省了時間和先前的資源。
[0032]本發明前述的關鍵優點沒有在現有技術中發現，且提供了本發明相對現有技術本質上的改進。將這些優點應用于所有潛在治療靶蛋白質，但對難處理、高度抗藥性的靶蛋白質(已知為theramuteins)而言是尤其重要的(W02005/115992)。
[0033]作為使用本發明的結果，大大簡化和提高了改進和優化指定化合物(相對于其他效率較低的化合物)的問題。本領域技術人員簡單地從第一化合物開始，無論它是否為批準的藥物、篩選命中、或為已知抑制或活化關注蛋白質的基本骨架，并使用第一化合物作為參考目的的起始點。然后，使用現在本領域中標準的基本藥物化學合成方法合成其他化合物，所述其他化合物為第一化合物的類似物、同系物、異構體等(本文也稱為“起始化合物”或“參考化合物”)。在本文的其他部分參考了部分這些化學合成方法，且讀者還可以參考Burbaum等人，1995和Goodnow等人，2003作為所述方法的一般參考。一旦合成了其他化合物，本領域技術人員開始使用本發明的方法而不是通常指由無細胞測試獲得的結果(通過測試新化合物對靶蛋白質和一批其他非靶蛋白質以嘗試使所述化合物與其他蛋白質的交叉反應最小化)的現有技術方法。相反，通過使用本發明，本領域技術人員可以通過直接參考由使用基于本發明表型反應的細胞測試系統測定每個待測化合物的CGS獲得的結果來指導起始化合物化學結構的改進。最重要地，整體排除了持續依賴于無細胞、純化蛋白質測試的結果，包括上述在Hanke等人(1996)和Knight and Shokat (2005)中參考的“kinasepanel”，且來自實施本方法的化合物優于由較老方法獲得的化合物，如本文鑒定的化合物的活性所示，其對高度抗藥性的theramutein p210Bcr_Abl T315I是有效的(如表4所示)。不限制本領域技術人員在無細胞系統中獨立測試所得的任何化合物用以獨立確認(如果需要的話)，但這對于實施本發明是決不需要的。
[0034]在本發明之前，尚未證實基于細胞應答的藥物發現系統能鑒定和對所選的靶蛋白質的抑制劑或活性劑進行排序，而不用先參考無細胞、純化蛋白配體結合測試或酶測試(當靶蛋白質是酶時)以確立正在研究的化合物確實與靶蛋白質結合。
`[0035]這些結果首次證實，使用基于細胞應答的測試系統作為主要工具從在高通量篩選(HTS)中評分為正的化合物中鑒定指定靶蛋白質的抑制劑或活性劑。這些結果還證實一旦鑒定命中或先導化合物能活化或抑制指定靶蛋白質(通過任何方法，包括本文公開的實施例或通過經典的無細胞HTS方法)，所述化合物也可以是化學優化的(即，可以對所述化合物進行先導優化)完全采用基于表型反應的細胞測試系統而不用隨后依賴于無細胞純化蛋白質測試系統以獨立驗證/確認在先導優化過程中合成的各個連續化合物的抑制或活化能力。僅這個實施方案給本領域技術人員節省了大量的時間、精力和大量的實驗室資源，這些通常在采用經典的無細胞純化蛋白質測試、放射性配體結合測試等產生和獨立確認抑制或活化性質是需要花費的。
[0036]本文證實的方法使用涉及慢性骨髓性白血病(CML)的發展和進行中的引起癌癥的蛋白質的特異性突變形式。所述蛋白稱為Abelson蛋白激酶，以其引起癌癥的形式為某些酪氨酸激酶抑制劑例如甲磺酸伊馬替尼(imatinib)的一個已知的靶。然而，如下面詳細討論的，所述靶蛋白質可以在患者中以對伊馬替尼的抑制作用有抗性的突變形式產生。Abelson激酶的所述形式稱為theramutein。在本發明的一個實施方案中，鑒定了能抑制或活化指定theramutein的合適先導化合物。在本發明的另一個實施方案中，優化先導化合物。所述方法對鑒定命中、所述命中的先導優化(無論最初是如何鑒定了所述命中)、和涉及非theramutein內源性革巴蛋白質的化合物的生物識別是有效的。使用由隱含賦予高度抗藥性的T315I突變的Abelson激酶的突變形式組成的theramutein證實了所述方法的一般用途。
[0037]本發明進一步涉及為蛋白質的變體形式的抑制劑或活化劑的活性劑。本發明還涉及為內源性蛋白質的某些變體形式的抑制劑或活化劑的活性劑。特別關注的是由已經突變的基因編碼的內源性蛋白質變體的抑制劑和活化劑，所述的變體通常在接觸已知為相應未突變內源性蛋白質的抑制劑或活化劑的化學活性劑后產生或至少在已經產生后首先得到鑒定。這類蛋白質變體(突變蛋白)在本文中稱作"theramuteins",它們可以自發在生物體內出現(并且在某些情況中預先存在突變)或所述的突變體可以作為使用當能夠抑制所述theramutein的未突變形式(本文稱作“prototheramutein”)的指定化學活性劑治療生物體時產生的選擇壓力的結果產生。可以理解在某些情況中,prototheramutein可以為POI的“野生型〃形式(例如因失調產生疾病的蛋白質)。在其它情況中,prototheramutein為引起疾病的“野生型”蛋白質的變體，它已經突變且由此促使作為所述在先突變結果的患病狀態發生。Prototheramutein的后一種類型的一個實例為Ρ210Β%ΑΒ?癌蛋白，并且在315位上隱含蘇氨酸⑴到異亮氨酸⑴突變的這種蛋白質的突變體形式稱作Ρ210ΒΜ_Τ3151，并且為theramutein的一個實例。本文所用的命名“P210~ “與術語“p210Ba:-Abl”、“野生型Bcr-Abl蛋白質”等為同義詞。
[0038]Theramuteins為一類罕有的內源性蛋白質,它們隱含了賦予所述蛋白質對藥物的抗性的突變，已知所述的藥物以治療有效方式抑制或活化它們的未突變對應體。目前已知編碼少數幾種這類蛋白質的內源性基因在某些情況下表現出這類突變。在一個實施方案中，本發明涉及抑制Abelson酪氨酸激酶蛋白質的某些耐藥性突變體(theramuteins)的組合物，所述的Abelson酪氨酸激酶蛋白質在文獻中最初稱作P210-Bcr_Abl,它涉及慢性髓細胞性白血病的發生。`
[0039]本發明的方法特別涉及鑒定蛋白質的特異性抑制劑或特異性活化劑的方法。術語“特異性”在上下文中術語“抑制劑”或“活化劑”中的應用(參見下文中的定義)指的是所述的抑制劑或活化劑結合蛋白質并且抑制或活化蛋白質的細胞功能，但不結合和活化或抑制細胞中的各種其它蛋白質或非-蛋白質靶標。本領域技術人員充分了解，在醫學文獻中討論蛋白質抑制劑或活化劑的作用時，在特異性抑制劑或特異性活化劑的概念和靶蛋白“特異性”的相關概念方面存在一定程度的可變性。因此，就本發明的目的而言，物質為指定theramutein的特異性抑制劑或特異性活化劑,條件是所述物質能夠以指定濃度抑制或活化所述蛋白質，使得相應的表型反應(phenoresponse)以適當方式得到調節,而在相同指定濃度下對相應對照細胞的表型反應(如果有的話)不具有可感覺到的作用，所述的相應對照細胞基本上不表達蛋白質。
[0040]在某些實施方案中，物質可以為兩個密切相關的蛋白質如prototheramutein和其相應的theramutein之一的調節劑。在其它實施方案中，除為prototheramutein和theramutein的調節劑外,物質還可以調節具有相似功能的蛋白質的活性。如上所述，除抑制p210Btt Abl酪氨酸激酶外，甲磺酸伊馬替尼還能夠抑制在某些胃腸道間質瘤中超表達的c-kit癌基因產物(也為酪氨酸激酶)以及在某些慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)中表達的TOGFii受體(也為酪氨酸激酶)。這類化合物有時稱作“適度特異性”抑制劑。
[0041]本發明還提供了可以用于鑒定活化或抑制theramutein的物質的一般方法,所述的物質將theramute iη活化或抑制到相同程度、并且優選到甚至大于能夠抑制該蛋白質的相應"野生型"形式的已知藥物物質的程度(然而，本領域技術人員充分了解這類蛋白質的所述〃野生型〃形式已經在產生所述蛋白質參與的相應疾病的過程中突變)。
[0042]在一個優選的實施方案中，本發明提供了具有通式I的Ρ210β?_αβη3151theramutein的抑制劑:
[0043]
【權利要求】
1.鑒定與第一化合物相比具有改進細胞特異性的化合物的方法，所述第一化合物為蛋白質的抑制劑并調節相應的表型反應，包括: a)測量用所述第一化合物處理過的測試細胞的表型反應的調節； b)測量用所述第一化合物處理過的對照細胞的表型反應的調節； c)測量用受試化合物處理過的測試細胞的表型反應的調節； d)測量用受試化合物處理過的對照細胞的表型反應的調節； e)確定第一化合物的細胞特異性缺口和受試化合物的細胞特異性缺口； 和f)如果所述受試化合物的細胞特異性缺口大于所述第一化合物的細胞特異性缺口，則鑒定所述受試化合物具有改進的細胞特異性。
2.權利要求1的方法，其中細胞特異性缺口由所述對照細胞的IC5tl除以所述測試細胞的IC5tl來確定。
3.鑒定與第一化合物相比具有改進的細胞特異性的化合物的方法，所述第一化合物為蛋白質的活化劑并調節相應的表型反應，包括: a)測量用所述第一化合物處理過的測試細胞的表型反應的調節； b)測量用所述第一化合物處理過的對照細胞的表型反應的調節； c)測量用受試化合物處理`過的測試細胞的表型反應的調節； d)測量用受試化合物處理過的對照細胞的表型反應的調節； e)確定第一化合物的細胞特異性缺口和受試化合物的細胞特異性缺口； 和f)如果所述受試化合物的細胞特異性缺口大于所述第一化合物的細胞特異性缺口，則鑒定所述受試化合物具有改進的細胞特異性。
4.權利要求3的方法，其中所述細胞特異性缺口由所述測試細胞的IC5tl除以所述對照細胞的IC5tl來確定。
5.改進第一化合物優化的方法，所述第一化合物為蛋白質的抑制劑并調節相應的表型反應,包括: a)測量所述第一化合物對測試細胞的表型反應的ICto； b)測量所述第一化合物對對照細胞的表型反應的ICto； c)測量具有與所述第一化合物相同骨架的受試化合物對所述測試細胞的表型反應的IC50; d)測量所述受試化合物對所述對照細胞的表型反應的ICto； 和e)如果所述測試化合物的細胞特異性缺口大于所述第一化合物的細胞特異性缺口，則鑒定所述受試化合物為所述第一化合物的改進。
6.權利要求5的方法，其中所述蛋白質是P210?1或pl90Bra_Ab1，其在相應的氨基酸位點包含相應蘇氨酸到異亮氨酸的突變。
7.改進第一化合物優化的方法，所述第一化合物為蛋白質的活化劑并調節相應的表型反應,包括: a)測量所述第一化合物對測試細胞的表型反應的ICto； b)測量所述第一化合物對對照細胞的表型反應的ICto； c)測量具有與所述第一化合物相同骨架的受試化合物對所述測試細胞的表型反應的IC50;d)測量所述受試化合物對所述對照細胞的表型反應的ICto ； 和e)如果所述測試化合物的細胞特異性缺口大于所述第一化合物的細胞特異性缺口，則鑒定受試化合物為第一化合物的改進。
8.權利要求5-7中任一項的方法，其包括選擇步驟(e)的優化化合物并重復步驟(a) - (d)。
9.權利要求5-7中任一項的方法,其中所述蛋白質為theramutein。
10.權利要求5-7中任一項的方法，其中所述受試化合物的IC5tl高于所述第一化合物。
11.權利要求5-7中任一項的方法，其中所述的受試化合物的IC5tl低于所述第一化合物。
12.確定一種物質是否是蛋白質的特異性抑制劑的方法，所述蛋白質能引起可檢測的表型反應，其包括: a)溫育測試細胞，所述測試細胞表達所述蛋白質并能用所述物質引起與該細胞中所述蛋白質的存在和功能活性相關的表型反應； b)溫育對照細胞，所述對照細胞在更低水平表達或不表達所述蛋白質并能以更低程度引起或完全不引起與細胞中所述蛋白質的存在和功能活性相關的可檢測的表型反應； c)比較用所述物質處理過的所述測試細胞的表型反應與用所述物質處理過的所述對照細胞的表型反應； 和d)如果所述物質能調節所述測試細胞表型反應的程度大于所述對照細胞，則確定所述物質是所述蛋白質的特異性抑制劑。
13.確定一種物質是否是蛋白質的特異性活化劑的方法，所述蛋白質能引起可檢測的表型反應，其包括: a)溫育測試細胞，所述測試細胞表達所述蛋白質并能用所述物質引起與該細胞中所述蛋白質的存在和功能活性相關的表型反應； b)溫育對照細胞，所述對照細胞在更低水平表達或不表達所述蛋白并能以更低程度引起或完全不引起與該細胞中所述蛋白質的存在和功能活性相關的可檢測的表型反應； c)比較用所述物質處理過的所述測試細胞的表型反應與用所述物質處理過的所述對照細胞的表型反應； 和d)如果所述物質能調節所述測試細胞表型反應的程度大于所述對照細胞，則確定所述物質是所述蛋白質的特異性活化劑。
【文檔編號】C12Q1/37GK103789389SQ201310695946
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2006年11月24日 優先權日:2005年11月23日
【發明者】杰勒德·M·豪斯 申請人:杰勒德·M·豪斯