一種提高水稻磷吸收率的方法
【專利摘要】本發明公開一種提高水稻磷吸收率的方法。本發明利用PCR技術克隆OsSUT2基因的全長cDNA，構建由玉米Ubi啟動子驅動的植物表達載體，通過農桿菌介導法獲得過表達OsSUT2基因水稻。轉基因純合水稻在低磷生長條件下植株磷吸收量顯著提高，株高、分蘗數、葉片數及穗數顯著增加，穗實粒數、結實率也有增加趨勢。本發明挖掘了OsSUT2基因的新用途。
【專利說明】一種提高水稻磷吸收率的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物基因工程，具體為一個水稻蔗糖轉運基因0sSUT2在提高水稻磷吸收方面的應用。
【背景技術】
[0002]磷是植物生長發育最重要的元素之一。由于土壤中的磷大部分以植物難以吸收利用的無效態磷方式存在，世界上30-40%的耕地的有效磷不能滿足植物正常生長發育的需要。作物缺磷現象普遍存在。另外由于土壤的理化特性，磷肥當季的利用率也只有10%~25%，過量施用的磷肥帶來了資源浪費、環境污染等問題。因此培育高效利用磷肥的作物品種是解決上述一系列問題的根本。
[0003]植物對磷的吸收和利用是一個復雜的過程，在長期的與土壤互作過程中，植物進化了一系列適應機制，如通過增加根的數量和表面積，增加對土壤中磷的吸收，利用菌根形成共生關系獲取憐兀素，以及改變憐代謝相關基因的表達提聞憐的循環利用等機制。
[0004]蔗糖是植物生長發育和能量代謝的底物，近年研究發現:蔗糖是重要的信號物質，激發和參與了很多植物的代謝途徑，增加蔗糖能夠提高植物對逆境脅迫適應性。
[0005]蔗糖轉運蛋白是一類高疏水性蛋白，負責植物體內蔗糖的轉運和分配，它定位于植物細胞膜上，含有12個跨膜結構域，N-末端和C-末端均位于細胞質的一面，中間面向胞質的部分有一個大的環，將蛋白分為各含6個跨膜結構域的兩部分，N末端可能對底物的親和性起決定作用。
[0006]植物蔗糖轉運蛋白的主要功能是介導植物體內蔗糖的跨膜轉運，與蔗糖在韌皮部的裝卸、庫組織的蔗糖貯藏與供給、非生物與生物脅迫的響應、植物-微生物間的相互作用等有重要關系。近年來發現，蔗糖轉運蛋白與蔗糖信號的傳導密切相關，有可能參與植物對磷缺乏的適應性反應。本發明擴展了蔗糖轉運蛋白的功能。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種提高水稻磷吸收率的方法，構建了 pl300Ubi0sSUT2表達載體，在水稻中過量表達0sSUT2基因，轉基因水稻在低磷脅迫環境中表現出對低磷的生理適應性，提高了磷的吸收效率和利用效率，研究結果對培育磷高效利用水稻具有重要意義。
[0008]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種提高水稻磷吸收率的方法，通過在水稻中過量表達編碼蔗糖轉運蛋白基因0sSUT2實現。
[0009]所述過量表達0sSUT2基因，基因編號為AB091672，基因的cDNA全長1505bp，編碼501個氨基酸，基因序列如SQE ID NO:1所示。
[0010]所述過量表達是利用PCR方法同源克隆出水稻0sSUT2基因，采用F-primer:SQEID NO:2和R-primer:SQE ID NO:3擴增出0sSUT2基因cDNA ;構建過量表達植物載體P1300Ubi0sSUT2 ;借助農桿菌介導法獲得轉OsSUT2基因水稻；通過自交分離篩選獲得過量表達OsSUT2基因的純合株系。
[0011]所述植物表達載體P1300Ubi0sSUT2是將中間載體pUbi0sSUT2酶切回收并與P1300連接獲得的；將連接在T-easy測序載體上的水稻蔗糖轉運蛋白0sSUT2 cDNA經EcoRI酶切重組到質粒pBluescriptIIKS,得到中間載體pBlue0sSUT2,然后用BamHI/Kpnl雙酶切中間載體，將pBlue0sSUT2中的0sSUT2正向連接到終止子T_nos的前面，得到中間載體pUbi0sSUT2 ;將pUbi0sSUT2酶切回收Ubi0sSUT2片段連接在質粒P1300上，獲得轉化載體P1300Ubi0sSUT2，將轉化載體P1300Ubi0sSUT2導入農桿菌菌株LBA4404，獲得P1300Ub i 0sSUT2/LBA4404 工程菌。
[0012]轉化包括以下步驟:
1)胚性愈傷的誘導；
2)胚性愈傷的遺傳轉化；
3)抗性愈傷的篩選；
4)抗性植株的分化、生根培養。
[0013]一種提高水稻磷吸收率的方法，其具體步驟包括以下:
1)以0SSUT2基因片段作為應用基因，設計引物，擴增出編碼區，以強啟動子Ubi作為驅動，構建單子葉植物表達載體；
2)通過農桿菌介導的遺傳·轉化方法，得到過量表達轉基因水稻。
[0014]所述水稻品種為明恢86，通過農桿菌P1300Ubi0sSUT2/LBA4404轉化，獲得過量表達0sSUT2基因水稻植株。所述遺傳轉化方法具體包括以下步驟:
1)種子消毒和愈傷誘導
2)農桿菌pl300Ubi0sSUT2/LBA4404 制備
3)侵染及共培養
4)抗性愈傷篩選
5)抗性愈傷分化、幼苗生根。
[0015]轉基因小苗移栽、檢測、篩選出過量表達的轉基因植株，通過自交重組，獲得轉基因純合株系。轉基因高代純合水稻在低磷脅迫環境中，總根長、根尖數和根表面積、根冠比顯著提高，植株總磷含量明顯提高。
[0016]本發明構建了 P1300Ubi0sSUT2過量表達載體，在水稻中過量表達0sSUT2基因，轉基因水稻在低磷脅迫環境中表現出對低磷的生理適應性，提高了磷的吸收效率和利用效率，研究結果可用于培育磷高效利用水稻品種，減少水稻生產過程中磷肥施用，降低土壤、水體及環境的污染具有可預期的應用價值，在理論上擴展了 0sSUT2基因的功能。
[0017]本發明的有益效果如下:
1.本發明提供了一種水稻蔗糖轉運蛋白基因的新應用方法。本發明通過遺傳轉化技術，獲得過量表達蔗糖轉運蛋白基因0sSUT2水稻；在低磷脅迫環境中，轉基因水稻的生物量增加43.74%，根冠比提高了 18.56%，單株磷含量比非轉基因水稻提高了 24.24%。
[0018]2.本發明通過在水稻中過量表達蔗糖轉運蛋白基因0sSUT2，改變了水稻根構型，根總長度增加了 20.20%、根總表面積增加了 21.92%、總根數增加了 21.79%，水稻磷吸收能力提高。本發明對于減少水稻生產過程中磷肥施用，降低土壤、水體及環境的污染具有可預期的應用價值。[0019]3.本發明通過轉基因調控水稻體內碳分布方式，達到改良作物養分利用目的，為通過分子操作改良作物品種提供了新的思路。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1.pl300Ubi0sSUT2 載體示意圖。
[0021]圖2.低磷脅迫下轉基因水稻的苗期植株表型。其中A為轉基因水稻，B為非轉基因水稻；與非轉基因水稻相比轉基因水稻根系較多、葉片較寬、葉色濃綠。
[0022]圖3.低磷脅迫下轉基因水稻結實期植株表型。其中A為轉基因水稻，B為非轉基因水稻；與非轉基因水稻相比轉基因水稻分蘗數較多、穗數較多。
[0023]圖4.低磷脅迫下轉基因水稻單株葉片數。其中D86表示對照；DM4表示轉基因水稻。*表示差異顯著；與非轉基因水稻相比轉基因水稻在整個生長期植株的葉片數都顯著多于對照。
[0024]圖5.低磷脅迫下轉基因水稻單株分蘗數。其中D86表示對照；DM4表示轉基因水稻。*表示差異顯著；與非轉基因水稻相比轉基因水稻在抽穗期時分蘗數顯著多于對照。
[0025]圖6.低磷脅迫下轉基因水稻不同生長期的根冠比。其中D86表示對照；DM4表示轉基因水稻。*表示差異顯著；與非轉基因水稻相比轉基因水稻苗期和分蘗期根冠比顯著高于對照，但成熟期顯著低于對照。
[0026]圖7.低磷脅迫下轉基因水稻單株總粒數。其中D86表示對照；DM4表示轉基因水稻。*表示差異顯著；與非轉基因水稻相比轉基因水稻總粒數顯著多于對照
圖8.低磷脅迫下轉基因水稻收獲期不同部位及全株的磷含量。其中D86表示對照；DM4表示轉基因水稻。*表示差異顯著；與非轉基因水稻相比轉基因水稻的穗、葉、根以及整株的全磷含量顯著高于對照。
【具體實施方式】
[0027]實施一水稻蔗糖轉運蛋白0sSUT2全長cDNA克隆
1.水稻蔗糖轉運蛋白0sSUT2的克隆
根據(Aoki N, Hirose T,等 The sucrose transporter gene family inrice.Plant Cell Physiol.2003 Mar;44(3):223-32.)文中所登記的基因號，通過 NCBI 查得 0sSUT2 基因(GenBank:AB091672.1)全長 CDS,設計擴增引物 F primer:5，-ATGCCGCGGCGGCCTAGCGGCGGCG-3，和 R primer:5，-TTATCGGTGACCTCTCCTCCTTGAT-3，。擴增出 0sSUT2 編碼區，擴增條件為:(1) 94°C 5min ；(2) 94°C 3min,55°C 3min,72°C 3min,反應35個循環；(3) 72°C延伸IOmin回收片段,連接在T_easy測序載體上,測序。
[0028]2.過量表達載體構建
將連接在T-easy測序載體上的水稻蔗糖轉運蛋白0sSUT2cDNA經&0RI酶切重組到質粒pBluescriptIIKSm,得到中間載體pBlue0sSUT2,然后備BmMl/Kpn\雙酶切中間載體PUSCK，將0sSUT2片段正向連接到終止子T-nos的前面，得到中間載體pUbi0sSUT2。將pUbi0sSUT2酶切回收Ubi0sSUT2片段連接在質粒P1300上，獲得轉化載體P1300Ubi0sSUT2。載體見附圖1。[0029]實施二轉0sSUT2過量表達水稻材料獲得
采用農桿菌介導法獲得轉0sSUT2基因水稻，具體步驟如下:
1.胚性愈傷組織誘導與繼代
取水稻授粉后20d的未成熟穗，剝殼后用75%乙醇浸泡lmin，再轉入25%的次氯酸鈉溶液中振蕩滅菌25min，于超凈工作臺中無菌水沖洗4次，將消毒后種子的幼胚挑出并接種于誘導培養基中，每皿約30粒，于28°C暗培養7d,切除胚根，繼續培養7天d，待愈傷組織長大后進行繼代培養。從第三代開始可以選擇適當的胚性愈傷組織用于農桿菌轉化。
[0030]2.愈傷組織的預培養
選取自然分散、顏色鮮黃、直徑約為3mm的顆粒狀愈傷，轉接到預培養培養基中，置于27°C暗培養4d。
[0031]3.農桿菌培養及菌液制備
從低溫(_85°C)凍存管中刮取少量菌液接種于附加50mg.1/1卡那霉素和50mg.~1利福平的YEB固體培養基上，于28°C暗培養72h進行菌株活化；取活化平板上的單菌落轉接劃菌，28°C培養2h后，用添加有100 μ Μ.1乙酰丁香酮的AAM液體培養基將菌洗脫，用含有100 μ Μ.1乙酰丁香酮的AAM液體培養基定容到20ml左右，劇烈搖動Imin后，調整菌液濃度至0D600nm=2.0，靜直lh，備用。
[0032]4.農桿菌感染與共培養
將預培養2d的愈傷組織轉移到無 菌三角瓶中，加入上述農桿菌菌液，略微搖動后靜置30min，倒去農桿菌，將感染 過的愈傷組織置于無菌濾紙上晾干60min后接種于共培養基上，25°C暗培養3d。
[0033]5.去除農桿菌
挑取共培養后的愈傷組織于無菌三角瓶中，用無菌水沖洗4次，每次搖動數次，直至水中不見絲狀菌體。最后一次用含IOOmg.L—1羧卞青霉素的無菌水浸泡60min，然后倒掉液體，將去菌后的愈傷組織置于無菌濾紙上晾干。
[0034]6.抗性愈傷組織篩選
將愈傷組織轉移至含有30mg.L—1潮霉素的選擇培養基中培養，每兩周轉接I次，3周后抗性愈傷組織長出。
[0035]7.轉化植株再生
將抗性愈傷組織轉移至分化培養基上，2周后愈傷組織開始轉綠，3周后即可長出幼芽，隨后根也長出。將幼苗移至生根培養基上，每培養瓶I個克隆。待幼苗生根長成后，移出培養瓶，洗凈根上的培養基后，移至溫室盆栽。
[0036]實施例三.轉基因水稻耐低磷實驗
1.轉基因水稻低磷培養
以轉基因T4代純合水稻為材料，以非轉基因對照明恢86為對照。取飽滿的水稻種子，室溫浸種，2d后種子置于30°C培養箱催芽2d，待種子萌發后，小苗移入含1/2MS培養基中培養5d。將約5cm高的小苗移入以石英砂為基質含有不同磷濃度的液體培養基的無土栽培箱中培養，培養箱置于防雨，四周通風，陽光充足的塑料大棚中。石英砂預先用稀鹽酸浸泡5d，然后用去離子水沖淋數遍，洗凈鹽酸，測定pH值。培養期間苗期I周補一次營養液，分蘗期之后3天加一次營養液，每2周置換一次新的營養液，置換新的營養之前用去離子水沖洗石英砂，生長期間視蒸騰情況補去離子水，補水時保證每一個培養箱中補水體積相同。水稻無土栽培營養液參照國際水稻所研發的配方(IRRI discussion paper series NO22 “Screening rice for salinity tolerance”)，配方中憐含量設為2個憐處理:低憐配方磷量降低為lmgL—\是配方中的1/10，其余元素含量不變；常磷配方則完全按照配方配置。見表1.表1.國際水稻所水稻營養液配方
【權利要求】
1.一種提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:通過在水稻中過量表達編碼蔗糖轉運蛋白基因0SSUT2實現。
2.根據權利要求1所述的一種提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:所述過量表達OsSUT2基因，基因編號為AB091672，基因的cDNA全長1505bp，編碼501個氨基酸，基因序列如 SQE ID NO:1 所示。
3.根據權利要求1所述的一種提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:所述過量表達是利用PCR方法同源克隆出水稻OsSUT2基因，采用F-primer:SQE ID NO:2和R-primer:SQE ID NO:3擴增出OsSUT2基因cDNA ;構建過量表達植物載體pl300Ubi0sSUT2 ;借助農桿菌介導法獲得轉OsSUT2基因水稻；通過自交分離篩選獲得過量表達OsSUT2基因的純合株系O
4.根據權利要求3所述的一種提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:所述植物表達載體pl300Ubi0sSUT2是將中間載體pUbiOsSUT2酶切回收并與pl300連接獲得的；將連接在T-easy測序載體上的水稻蔗糖轉運蛋白OsSUT2 cDNA經EcoRI酶切重組到質粒pBluescriptIIKS,得到中間載體pBlue0sSUT2,然后用BamHI/Kpnl雙酶切中間載體，將pBlue0sSUT2中的0sSUT2正向連接到終止子T-nos的前面，得到中間載體PUbi0sSUT2 ;將pUbi0sSUT2酶切回收Ubi0sSUT2片段連接在質粒P1300上，獲得轉化載體P1300Ubi0sSUT2。
5.根據權利要求4所述的一種提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:轉化包括以下步驟: 1)胚性愈傷的誘導； 2)胚性愈傷的遺傳轉化；· 3)抗性愈傷的篩選； 4)抗性植株的分化、生根培養。
【文檔編號】C12N15/29GK103710356SQ201310696522
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】蘇軍, 張武君, 宋亞娜, 付艷萍, 顏靜宛, 胡太蛟, 李剛, 林智敏 申請人:福建省農業科學院生物技術研究所