一種催化碳-氟和碳-氯鍵形成的鹵化酶的制作方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程【技術領域】，涉及通過基因重組技術獲得具有催化C-F鍵和C-Cl鍵形成的鹵化酶。以來源于巴西諾卡菌的鹵化酶基因為原始基因，根據鹵化酶基因在大腸桿菌體內表達的密碼子偏好，進行優化，合成以大腸桿菌為表達宿主的優化鹵化酶基因序列；將優化鹵化酶基因序列重組到克隆載體pUC57simple，經NdeI和HindⅢ雙酶切之后，連接到具有同樣內切酶位點的表達載體pET28a(+)片段上，獲得表達載體pWHU2401；將表達載體pWHU2401轉化大腸桿菌感受態細胞，獲得能夠異源表達鹵化酶的工程菌，放大發酵，純化，從而獲得鹵化酶。本發明的鹵化酶能夠特異性合成5’-FDA，催化活性跟已知的鹵化酶FlA活性相當。在加入L-氨基酸氧化酶時，該鹵化酶也能催化形成5’-ClDA。
【專利說明】一種催化碳-氟和碳-氯鍵形成的鹵化酶
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及通過基因重組技術獲得具有催化C-F鍵和C-Cl鍵形成的鹵化酶。
【背景技術】
[0003]劍七酶是一大類能催化鹵素離子飽括匕⑶^^門形成穩定碳齒鍵的酶’從催化的機制來分可以分為血紅素依賴、黃素依賴、酮戊二酸依賴、釩依賴以及SAM依賴的鹵化酶(C.T.Walsh, Chemistry & Biology, 2008, 15，99-109)，其中又以能催化形成 C-F鍵的鹵化酶尤為重要。
[0004]有機氟化合物被廣泛應用于藥物，醫學檢測，農藥以及材料，在藥用化合物中引入氟原子往往能提高藥物的活性及穩定性。據統計，大約有20 %-30 %的商品藥含有氟原子(T.Furuya, et al., Nature, 2011,473, 470-477)，因此，有機含氟化合物越來越被人們所重視。然而，自然界中存在的含氟有機物數量少之又少，只在非洲大陸的少數植物和鏈霉舊Streptomyces caiiJeja體內發現少量的高毒含氟化合物。究其原因,是因為在自然界中，CaF2等含氟無機物溶解性很差，絕大多數是以沉淀的形式存在，因此，氟元素不能被生命體很好的利用。當前，僅僅依靠所發現的極少量的天然含氟有機化合物，是遠遠不能滿足生產和生活的需求的。盡管過去幾十年，人們已經開發出一些化學合成有機含氟化合物的方法，但由于氟原子的特殊化學性質，使得這些方法往往要在苛刻、高毒的化學環境中才能完成有機化合物的氟化，而且選擇性也不盡人意。
[0005]與化學合成相比，酶催化合成的具有催化條件溫和，選擇性高，綠色環保等優點。目前，酶催化技術已經被廣泛應用于化學品，醫藥中間體的生產。其發展潛力巨大。目前，已知催化氟離子形成C-F鍵的鹵化酶(fluorinase，E.C.2.5.1.63)僅有一例:2002年，O’ Hagan等人報道了從鏈霉菌5: cattIeya分離的鹵化酶FlA能催化F_和SAM形成5’-FDA (O’Hagan, et al., Nature, 2001, 416，279)。通過進一步對 FlA 純化和晶體解析，該研究表明，連接N端和C端的環形區域(loop)為F_和SAM提供反應所必須的空間區域。FlA第158位的絲氨酸殘基對F_的結合和去溶劑化起到了關鍵的作用，使得F_能夠選擇性親核進攻SAM的5’位，形成5’ -FDA。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題在于提供一種催化碳-氟和碳-氯鍵形成的鹵化酶。
[0007]為達到上述目的，本發明采用以下技術手段:
首先，以來源于巴西諾卡菌的鹵化酶基因為原始基因，根據鹵化酶基因在大腸桿菌體內表達的密碼子偏好,進行優化,合成以大腸桿菌為表達宿主的優化鹵化酶基因序列；
其次，將優化鹵化酶基因序列重組到克隆載體PUC57 simple，經和歷‘/?(1 III雙酶切之后，連接到具有同樣內切酶位點的表達載體pET28a(+)片段上，獲得表達載體pffHU2401 ；
最后，將表達載體PWHU2401轉化大腸桿菌感受態細胞，獲得能夠異源表達鹵化酶的工程菌，放大發酵，純化，從而獲得鹵化酶。
[0008]本發明還對獲得的鹵化酶的性能進行了測定，包括最適pH，米氏常數尤，轉化常數 和對除F—以外的其他鹵素離子的活性。測定結果顯示，我們獲得的鹵化酶能夠特異性
合成5’-氟5’-脫氧腺嘌呤核苷(5’-FDA)，催化活性跟已知的鹵化酶FlA活性相當。在加入L-氨基酸氧化酶時，該鹵化酶也能催化形成5’ -氯-5’ -脫氧腺嘌呤核苷(5’ -C1DA)。
[0009]本發明中，我們利用基因工程的方法，克隆了來源于巴西諾卡菌的新穎鹵化酶基因/70況，通過蛋白表達我們獲得了高活性的鹵化酶，體外活性測試證實了其能催化氟離子和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)形成5’ -FDA (圖2)。此外，在氨基氧化酶的存在下，我們發現，NobA還可以催化氯離子和和SAM形成5’ -ClDA (圖5)。這一發明報道了有史以來的第二例催化碳-氟鍵形成的鹵化酶，填補了國內關于這類酶研究的空白。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是純化的鹵化酶NobA聚丙烯酰胺SDS-PAGE電泳圖。其中I代表蛋白標準分子量，2代表鹵化酶。
[0011]圖2是鹵化酶對NaF和SAM催化活性的HPLC及質譜檢測圖。(_) NaF代表不加NaF的對照實驗；(-)SAM代表不加SAM的對照實驗；(-)NobA代表不加鹵化酶的對照實驗；NobAreaction代表實驗組，5’ -FDA代表5’ -FDA的HPLC峰。活性測試表明，在SAM和NaF的存在下NobA可以催化形成5’ -FDA。
[0012]圖3是鹵化酶NobA的最適pH優化圖。
[0013]圖4是鹵化酶NobA對NaF`和SAM的動力學常數測定圖。其中A代表NaF的動力學常數圖，B代表SAM的動力學常數圖。
[0014]圖5是鹵化酶NobA催化NaCl形成5’ -ClDA的HPLC及質譜圖。
[0015]圖6是二價金屬離子對鹵化酶NobA活性的相對影響圖。
【具體實施方式】
[0016]以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。
[0017]本發明以來源于巴西諾卡菌iNocardia brasiliensis ,保藏于ATCC,保藏編號700358)的鹵化酶基因為原始基因，根據核苷酸在大腸桿菌體內表達的密碼子偏好，進行優化，合成了以大腸桿菌為表達宿主的優化鹵化酶基因。選擇合適的酶切位點，構建重組質粒，再將重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞。并挑選單菌落培養，放大發酵，純化，獲得的鹵化酶性能進行了測定，包括催化最適PH，動力學常數，對Cl—離子的活性等。
[0018]本發明使用的菌株和質粒為:包含來源于巴西諾卡菌的鹵化酶/70況基因的質粒/70況/pUC57 simple,大腸桿菌 BL21 (DE3)，質粒 pET28a (+)購自 TaKaRa，大腸桿菌 DH5 σ 購自 Invitrogen, BL21 (DE3)購自 Novagen。
[0019]本發明使用的酶和試劑為:限制性內切酶GWeI和歷/7dIII)，T4連接酶購自TakaRa公司，所有化學試劑購自Thermo Fisher公司，Santa Cruz公司、上海生物工程股份有限公司、國藥集團化學試劑有限公司。[0020]本實施例中酶的相關檢測項目的測定方法:
I)酶濃度測定方法(Bradford法):
取28 μ L BSA蛋白質標準液(5 mg/ml),用I X PBS稀釋至700 μ L，終濃度為200μ g/ml0
[0021]
【權利要求】
1.一種鹵化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。
2.一種鹵化酶,氨基酸序列如SEQ ID No 3所示。
3.權利要求2所述的鹵化酶在催化F—和SAM形成5’-FDA上的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，反應體系pH為6.5。
5.權利要求2所述的鹵化酶和氨基氧化酶在催化氯離子和SAM形成5’-ClDA上的應用。
6.權利要求2所述鹵化酶的制備方法，其特征在于:首先，以來源于巴西諾卡菌的鹵化酶基因為原始基因，根據鹵化酶基因在大腸桿菌體內表達的密碼子偏好,進行優化,合成以大腸桿菌為表達宿主的優化鹵化酶基因序列；其次，將優化鹵化酶基因序列重組到克隆載體PUC57 simple,經I和歷‘/?(1111雙酶切之后，連接到具有同樣內切酶位點的表達載體pET28a(+)片段上，獲得表達載體PWHU2401 ；最后，將表達載體PWHU2401轉化大腸桿菌感受態細胞，獲得能夠異源表達鹵化酶的工程菌，放大發酵，純化，從而獲得鹵化酶。
【文檔編號】C12N9/10GK103695384SQ201310710496
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】瞿旭東, 王婭婭, 鄧子新 申請人:武漢大學