改善植物抗旱性：upl3的制作方法

改善植物抗旱性：upl3的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種增強植物抗旱性的新方法。所述方法包括破壞所述植物中一個或多個基因的表達。與沒有被處理以破壞所述基因的表達的植物相比，該植物顯示改善的抗旱性。還提供可以通過根據本發明的方法獲得的植物和植物產品。
【專利說明】改善植物抗旱性：UPL3

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種增強植物抗旱性的新方法。所述方法包括破壞所述植物中一個或 多個基因或功能性蛋白質的表達。與沒有被處理以破壞所述一個或多個基因或功能性蛋白 質表達的植物相比，所述植物顯示改善的抗旱性。還描述了可以通過根據本發明的方法獲 得的植物和植物產品。

【背景技術】
[0002] 非生物脅迫，例如干旱、鹽度、極端溫度、化學毒性和氧化脅迫都是農業的威脅，并 且其是全世界作物損失的主要原因（Wang等，（2003) Planta218 (1)1-14)。
[0003] 本領域中，一些報道可用于處理非生物脅迫的生物化學、分子和遺傳學背景（Wang 等，（2003)Planta218(l)l-14 或 Kilian 等（2007)Plant J50(2)347-363)。用于處理非生 物脅迫的植物改良通常是基于保護和保持細胞組分的功能和結構的基因操作。然而，由于 對非生物脅迫條件的遺傳復雜反應，這樣的植物似乎更難控制和工程化。Wang(Wang等， (2003) Planta218 (1) 1-14)，特別地提及工程化的策略之一依靠使用一個或幾個基因，所述 基因參與信號傳導和調控途徑、或編碼引起功能和結構性保護物例如滲透物和抗氧劑的合 成的途徑中存在的酶、或編碼賦予耐逆性的蛋白質。
[0004] 盡管已經報道了在提供非生物脅迫抗性植物方面的改善，但是以其為基礎的遺 傳復雜機制的性質提供了進一步改善該領域的持續的需要。例如，據報道由于發育和生 理失衡，基因轉化的抗旱植物通常可能顯示更慢的生長和減少的生物量（Serrano等， (1999) J Exp Bot 50:1023 - 1036)，因此，與沒有轉化的植物相比具有顯著的適合度代 價（Kasuga 等，（1999)Nature Biot. Vol. 17 ;Danby and Gehring(2005)Trends in Biot. Vol. 23No. 11)。
[0005] 為了在脅迫條件下獲得植物生長，提出了一些生物技術方法。例如，W003/020015 中公開了對鹽脅迫的抗性增強的植物。該文件公開了利用9-順式-環氧類胡蘿卜素加雙 氧酶核苷酸和多肽而抗鹽脅迫的轉基因植物。
[0006] 在例如 US2009/0144850、US2007/0266453 和 W02002/083911 中公開了 抗旱性 增強的植物。US2009/0144850描述了由于DR02核酸的表達改變而顯示耐旱表型的植 物。US2007/0266453描述了由于DR03核酸的表達改變而顯示耐旱表型的植物，并且 W02002/083911描述了由于在保衛細胞中表達的ABC轉運體的活性降低而具有對干旱脅迫 的抗性增強的植物。另一個實例是Kasuga和合著者（1999)的工作，其描述了在正常生長 條件下，轉基因植物中編碼DREB1A的cDNA的過表達活化許多脅迫抗性基因的表達，導致對 干旱、鹽負荷和嚴寒的抗性改善。然而，DREB1A的表達也引起在正常生長條件下嚴重的生 長遲緩（Kasuga(1999)Nat Biotechnoll7(3) 287-291)。仍然需要用于增強對非生物脅迫 (尤其是如干旱的非生物脅迫）的抗性的新的、可替代的和/或另外的方法。
[0007] 本發明的一個目的是提供增強植物抗旱性的新方法。如果在低的水可利用性/干 旱的條件下生長，與沒有接受根據本發明的方法的植物相比，這樣的植物例如有可能生產 更多生物量和/或更多作物和其衍生的植物產品。


【發明內容】

[0008] 本發明提供一種用于生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述 方法包括破壞植物中UPL蛋白質的表達的步驟，和可選擇地再生所述植物，所述UPL蛋白質 包括包含至少一個根據PF00632的Pfam HECT結構域和至少一個根據模型SSF48371的超 家族ARM重復的氨基酸序列。
[0009] 在另一個方面，本發明提供了一種生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物 的方法，所述方法包括破壞植物、植物細胞或植物原生質體中功能性UPL3蛋白質表達的步 驟，和可選擇地再生所述植物，其中所述功能性UPL3蛋白質包括包含與SEQ IDN0:2的氨基 酸序列至少30%同一性的氨基酸序列。
[0010] 所述功能性UPL3蛋白質可以包括包含至少一個根據PF00632的Pfam HECT結構 域和至少一個根據模型SSF48371的超家族ARM重復的氨基酸序列。
[0011] 所述功能性UPL3蛋白質可以是如下蛋白質：當在具有破壞的內源性UPL3基因的 擬南芥T-DNA插入系中表達時，其得到與其中所述功能性UPL4蛋白質未表達、具有被破壞 的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
[0012] 本發明進一步涉及一種生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所 述方法包括破壞植物、植物細胞或植物原生質體中功能性UPL3蛋白質表達的步驟，和可選 擇選地再生所述植物，其中所述功能性UPL3蛋白質包括具有至少一個根據PF00632的Pfam HECT結構域和至少一個根據模型SSF48371的超家族ARM重復的氨基酸序列。
[0013] 本發明還涉及一種生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方 法包括破壞功能性UPL3蛋白質表達的步驟，和可選擇地再生所述植物，其中所述功能性 UPL3蛋白質由包含與SEQ ID NO: 1的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列的核酸序 列編碼。
[0014] 所述功能性UPL3蛋白質可以是如下蛋白質：當在具有破壞的內源性UPL3基因的 擬南芥T-DNA插入系中表達時，其得到與其中所述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞 的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
[0015] 破壞功能性UPL3蛋白質的表達的步驟可以包括使編碼所述功能性UPL3蛋白質的 核酸序列突變。使所述核酸序列突變可以包括插入、缺失和/或取代至少一個核苷酸。破 壞表達的步驟可以包括基因沉默。破壞表達的步驟可以包括破壞所述植物中兩種或更多種 功能性UPL3蛋白質的表達。
[0016] 所述方法可以進一步包括由具有改善的抗旱性的植物生產植物或植物產品的步 驟。
[0017] 本發明還涉及與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少30%同一性的氨基酸序列或 與SEQ ID NO: 1的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列在植物抗旱性篩選中的用途。
[0018] 本發明涉及具有SEQ ID N0:2的UPL3氨基酸序列或SEQ ID NO: 1的UPL3核酸序 列在擬南芥植物抗旱性篩選中的用途。
[0019] 本發明還涉及SEQ ID N0:1的UPL3核酸序列的至少一部分或SEQ ID N0:2的UPL3 氨基酸序列的至少一部分作為培育抗旱性擬南芥植物的標記物的用途。
[0020] 本發明進一步提供如本文定義的功能性UPL3蛋白質用于調節、優選地提高植物 抗旱性的用途。
[0021] 在另一個方面，本發明提供其中功能性UPL3蛋白質的表達受損的植物、植物細胞 或植物產品用于在干旱脅迫條件下生長的用途，其中所述功能性UPL3蛋白質為如下蛋白 質：當在具有被破壞的內源性UPL3基因的擬南芥T-DNA插入系中表達時，其得到與其中所 述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系 的抗旱性相比抗旱性受損的植物，其中所述干旱脅迫條件引起其中所述功能性UPL3蛋白 質的表達未受損的對照植物、植物細胞或植物產品比其中功能性UPL3蛋白質的表達被破 壞的植物、植物細胞或植物產品更早地顯示干旱脅迫癥狀，例如枯萎癥狀。
[0022] 本發明還教導其中功能性UPL3蛋白質的表達受損的番爺（Solanum lycopersicum)、陸地棉（Gossypium hirsutum)、大豆（Glycine max)、小麥屬植物 (Triticum spp.)、大麥(Hordeum vulgare.)、燕麥(Avena sativa)、高梁(Sorghum bicolor)、黑麥（Secale cereale)或甘藍型油菜（Brassica napus)植物、植物細胞或植物 廣品，其中所述功能性UPL3蛋白質為如下蛋白質：當在具有被破壞的內源性UPL3基因的擬 南芥T-DNA插入系中表達時，其產生與其中所述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞的 內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。所述植物、 植物細胞或植物產品可包括被破壞的內源性UPL3基因。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1顯示在實施例1和2中說明的典型的實驗的結果。
[0024] 圖2顯示與對照（野生型）植物的干旱敏感性表型相比，UPL3敲除（擬南芥 At4g38600插入突變體）的抗旱表型。
[0025] 圖3顯示At4g38600插入突變體（UPL3)的干旱存活率。擬南芥At4g38600插入 突變體比野生型（Col-Ο)植物或補充At4g38600(SEQ ID N0:1 ;陽性對照）和來自擬南芥 (SEQ ID N0:3)、番茄（SEQ ID N0:5和7)或水稻（SEQ ID N0:9)的同系物的編碼序列（CDS) 的At4g38600插入突變體抗旱存活顯著地更好（p < 0. 05)。該圖證實UPL3基因中的插入 突變產生抗旱表型。而且，其也表明來自單子葉植物和雙子葉植物物種的該基因同系物起 恢復正常干旱-敏感性表型的作用。因此，這些同系物在它們各自作物物種中，在耐旱方面 執行相同的功能。當插入擬南芥的UPL3插入突變體中時，觀察到單子葉植物和雙子葉植 物UPL3基因都可以恢復干旱敏感性，表明UPL3基因編碼的蛋白質的活性降低在整個植物 界中產生耐旱表型。因此，預測UPL3(基于同源性檢索和特征結構域[HECT]和犰狳重復序 列）將能夠鑒定植物物種中的植物UPL3同系物。然后，人們可以使用眾所周知的方法降低 這些植物同系物的蛋白質活性（例如，誘變、TDNA或轉座子插入、RNAi等），以得到抗旱植 物。灰色條具有比黑色條顯著更低的值（P < 〇. 05)。
[0026] 圖4顯示番茄UPL3-突變體的干旱表型。對于干旱實驗，使用含有純合型、雜合型 和野生型等位基因的分離的M2種群。在干旱處理開始之后21天拍攝的相片顯示野生型番 茄植物（右）和攜帶Slg98247中V158E突變的植物（左）。與野生型等位基因相比，攜帶 Slg98247中V158E突變的植物的耐旱表型和干旱處理的存活率顯著地更好（p < 0. 1)，表 明蛋白質的這一改變引起番茄出現耐旱表型。
[0027] 定義
[0028] 在下述說明和實施例中，使用大量術語。為了提供對說明書和權利要求書（包括 給出的這類術語的范圍）的清楚一致的理解，提供下述定義。除非本文另有定義，否則使用 的所有技術術語和科技術語具有與如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的 含義。將所有出版物、專利申請、專利及其它參考文獻的全部內容通過引用合并于此。
[0029] 實施用于本發明方法中的常規技術的方法將對普通技術人員是顯而易見的。本 領域技術人員熟知分子生物學、生物化學、計算化學、細胞培養、重組DNA、生物信息學、基因 組學、序列和相關領域中常規技術的實踐，并且在例如下述文獻參考中討論：Sambr 〇〇k等， Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 ;Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, 1987 及定期更新；和 the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego。
[0030] 在該文件及其權利要求書中，動詞"包括"及其變化形式以非限定含義使用，意味 著包括該術語后的項目，但是不排除沒有明確提及的項目。其涵蓋動詞"基本上由...組 成"以及〃由...組成〃。
[0031] 除非上下文另有清楚的規定，如本文使用的單數形式"一個"、"一種"和"所述"包 括復數指示。例如，如上述使用的用于分離"一個"DNA分子的方法包括分離多個分子（例 如，數十個、數百個、數千個、數萬個、數十萬個、數百萬個、或更多分子）。
[0032] 對齊（Aligning)和比對（alignment):術語"對齊"和"比對"指根據相同或相似 核苷酸的短或長的延伸的存在，比較兩個或更多個核苷酸序列。本領域已知一些核苷酸序 列比對的方法，如下進一步解釋。
[0033] "基因表達"指可操作地連接到合適的調節區（尤其是啟動子）的DNA區域轉錄成 RNA的過程，該RNA有生物活性，即能夠翻譯成生物活性蛋白質或肽（或活性肽片段）。"異 位表達"指在其中通常基因不表達的組織中的表達。"蛋白質表達"在本文中與術語基因表 達可互換地使用。其指可操作地連接到合適的調節區（尤其是啟動子）的DNA區轉錄成 mRNA，然后翻譯成蛋白質或肽（或活性肽片段）的過程。
[0034] 與UPL3蛋白質（或變體，例如直系同系物或突變體、及片段）有關的"功能性"指 基因和/或編碼蛋白質改良（定量和/或定性）抗旱性的能力，例如通過改良植物中基因 的表達水平（例如通過過表達或沉默）。例如，可以通過各種方法檢測從植物物種X獲得的 UPL3蛋白質的功能性。優選地，如果蛋白質是功能性的，則植物物種X中編碼該蛋白質的基 因的沉默，例如使用基因沉默載體，將導致抗旱性改善，如通過本文的詳細闡述檢測。而且， 用功能性UPL3蛋白質（或UPL4基因）互補UPL3敲除將能夠修復或賦予該特性，在此情形 中將恢復干旱敏感性。本領域技術人員在檢測功能性方面沒有任何困難。
[0035] 術語"基因"指包含區域（轉錄區）的DNA序列，其被轉錄為可操作地連接至合適 的調控區（例如啟動子）的細胞中RNA分子（例如mRNA)。因此，基因可以包括幾個可操作 地連接的序列，例如啟動子、5'前導序列（包含例如參與翻譯起始的序列）、（蛋白質）編 碼區（cDNA或基因組DNA)和3'非翻譯序列（包含例如轉錄終止序列位點）。
[0036] 術語"cDNA"指互補DNA。互補DNA是通過將RNA逆轉錄成互補DNA序列制備的。 因此，cDNA序列對應于從基因表達的RNA序列。由于當從基因組表達時mRNA序列可能受到 剪切，即在細胞質中翻譯成蛋白質之前，內含子被從mRNA剪切掉且外顯子連接在一起，應 當理解cDNA的表達指編碼cDNA的mRNA的表達。因此，cDNA序列可能與其對應的基因組 DNA序列不相同，因為cDNA可能僅編碼蛋白質的完全開放讀碼框（由連接的外顯子構成）， 而基因組DNA編碼，并且外顯子中散布內含子序列。因此，遺傳修飾編碼cDNA的基因可能 不僅涉及修飾對應于cDNA的序列，而且也可能涉及使基因組DNA的內含子序列和/或該基 因的其它基因調控序列的突變，只要其造成基因表達的破壞。
[0037] "同一性"是對核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的測量。通常，比對序列，以便 獲得最高位匹配。"同一性"本身具有領域公知的含義，并且可以使用公開的技術計算。 參見，例如 "COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988 ;BI0C0MPUTING:INF0RMATICS and GENOME PROJECTS，Smith, D.W.編 著，Academic Press，New York，1993 ;C0MPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，第 1 部分， Griffin，A.M.和 Griffin, H.G.編輯，Humana Press，New Jersey，1994;SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G·，Academic Press，1987;和 SEQUENCE ANALYSIS PRIMER ;Gribskov，M.和 Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991)。雖然 有多種測量兩個多核苷酸或多肽序列之間的同一性的方法，但是普通技術人員所熟知該 術語"同一性"（Carillo，H.和 Lipton，D·，SIAM J，Applied Math(1988)48:1073)。通 常用于確定兩個序列之間的同一性或相似性的方法包括，但不限于在⑶IDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop 編輯，Academic Press，San Diego, 1994,以及 Carillo，H.和 Lipton，D.，SIAM J，Applied Math(1988)48:1073中公開的方法。計算機程序編碼了測定 同一性和相似性的方法。優選的測定兩個序列之間的同一性和相似性的計算機程序方法包 括，但不限于 GCS 程序包（Devereux，J.等，Nucleic Acids Research(1984) 12(1):387), BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol. (1990)215:403)。優選在核苷酸 或氨基酸序列的全長上確定同一性百分比。
[0038] 作為示例，具有與編碼某個序列的多肽的參考核苷酸序列至少例如95%"同一性" 的核苷酸序列多核苷酸，表示該多核苷酸序列除了可以相對于每1〇〇個參考多肽序列的核 苷酸包括至多5點突變之外，該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同。因此，將在參考核 苷酸序列的全長上計算核苷酸序列與參考核苷酸序列的同一性百分比。換句話說，為了獲 得與參考核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多5% 的核苷酸可以缺失和/或被另外的核苷酸取代，和/或參考序列中總核苷酸的至多5%的數 目核苷酸可以插入到參考序列中。參考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5'或 3'末端位置上，或者這兩種末端位置之間的任何位置上，單個散布在參考序列的核苷酸之 間或參考序列的一個或多個鄰接組內。
[0039] 類似地，具有與SEQ ID N0 :2的參考核苷酸序列至少例如95% "同一性"的氨基 酸序列的多肽，表示該多肽序列除了可以相對于SEQ ID N0 :2的參考氨基酸的每100個氨 基酸包括至多5個氨基酸改變之外，該多肽的氨基酸序列與參考序列相同。因此，將在參考 氨基酸序列的全長上計算氨基酸序列與參考氨基酸序列的同一性百分比。換句話說，為了 獲得與參考氨基酸序列具有至少95 %同一性的氨基酸序列的多肽，參考序列中至多5 %的 氣基酸殘基可以缺失和/或被另外的氣基酸殘基取代，和/或參考序列中總氣基酸殘基的 至多5 %的數目的氨基酸可以插入到參考序列中。參考序列的這些改變可發生在參考核苷 酸序列的氨基或羧基末端位置上，或者這兩種末端位置之間的任何位置上，單個散布在參 考序列的殘基之間或參考序列的一個或多個鄰接組內。
[0040] 根據本發明的核酸可以包括嘧啶和嘌呤堿基，分別優選胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿 嘧啶、及腺嘌呤和鳥嘌呤的任何聚合物或低聚物（參見其全部內容為所有目的通過引 用合并于此的 Albert L.Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800(Worth Pub. 1982))。本發明涵蓋任何脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸組分、及其任何化學變 體，例如這些堿基的甲基化、羥甲基化或糖基化形式等。所述聚合物或低聚物組成上可以是 異質的或同質的，并且可以從天然存在來源分離，或人工或合成生成。另外，核苷酸可以是 DNA或RNA、或其混合物，并且可以以單鏈或雙鏈形式永久或短時存在，包括同源雙鏈體、異 源雙鏈體和雜交體。
[0041] 如本文使用的術語"可操作地連接的"指功能上相關的多核苷酸元件的連接。當 核酸置于與另一個核酸序列功能相關時，其是"可操作地連接的"。例如，如果其影響編碼序 列的轉錄，則啟動子或更確切地轉錄調節序列與編碼序列可操作地連接。可操作地連接可 以指連接的DNA序列是鄰接的。
[0042] "植物"指完整植物或可從植物獲得的植物的一部分，例如細胞、組織或器官（例如 花粉、種子、配子、根、葉、花、花蕾、花粉囊、果實等），以及這些的任何衍生物及通過自交或 雜交衍生自這類植物的后代。"植物細胞"包括分離物中或組織、器官或生物體之內的原生 質體、配子、懸浮培養物、小孢子、花粉粒等。
[0043] 如本文使用的術語"啟動子"指核酸片段，其起控制一個或多個基因的轉錄的作 用，相對于基因的轉錄起始位點的轉錄方向位于上游，并且從結構上識別為存在DNA-依賴 性RNA聚合酶結合位點、轉錄起始位點和任何其它DNA序列，包括，但不限于轉錄因子結合 位點、遏制子或激活蛋白結合位點以及本領域技術人員已知直接或間接地調節從該啟動子 轉錄的量的任何其它核苷酸序列。可選擇地，術語"啟動子"在本文中也包括5'UTR區（5' 非翻譯區）（例如啟動子在本文中可包括基因的翻譯起始密碼子的一個或多個上游部分 (5'），因為該區域可在調節轉錄和/或翻譯方面有作用。"組成型"啟動子是在大部分生理 和發育條件下在大部分組織中有活性的啟動子。"可誘導的"啟動子是生理地（例如通過外 部應用某些化合物）或發育調節的啟動子。"組織特異性"啟動子僅僅在特定類型的組織或 細胞中有活性。"植物或植物細胞中的啟動子活性"指啟動子在植物或植物細胞內驅動轉錄 的啟動子的一般能力。其沒做出有關于啟動子的時空活性的任何暗示。
[0044] 術語"蛋白質"或"多肽"可互換地使用，并且指由氨基酸鏈組成的分子，與具體作 用方式、尺寸、3維結構或來源無關。因此，蛋白質的"片段"或"部分"仍然可以稱為"蛋白 質"。"分離蛋白"用于指不再位于其自然環境中的蛋白質，例如位于體外或重組的細菌或植 物宿主細胞中。
[0045] "轉基因植物"或"轉化植物"在本文中指例如通過將非沉默突變引入內源基因或 其部分中而已經轉化的植物或植物細胞。這樣的植物已經遺傳修飾，以例如在基因中引入 一個或多個突變、插入和/或缺失和/或在基因組中引入基因沉默構建物。轉基因的植物 細胞可以指處于分離物或組織培養中的植物細胞，或者包含在植物或分化的器官或組織中 的植物細胞，這兩種都可能性都明確地包括在本文中。因此，在說明書或權利要求書中提及 植物細胞不是僅指培養物中分離的細胞或原生質體，而且指任何植物細胞，無論其位于任 何位置，或在任何類型的植物組織或器官中。
[0046] 靶核苷酸交換（TNE)是一種方法，通過該方法一條與染色體或附加體基因中的位 點部分互補的合成寡核苷酸在特定位點引導單個核苷酸的逆轉。已經描述了 TNE使用多種 寡核苷酸和祀標。一些報道的寡核苷酸是RNA/DNA嵌合體，含有末端修飾以賦予核酸酶耐 受性。
[0047] 如本文使用的術語"干旱脅迫"或"干旱"指與植物對水可獲得性受限有關的次佳 (sub-optimal)環境條件。當例如不下雨或下雨少和/或當植物的灌溉常常比所需更少時， 可能出現水可獲得性受限。當例如土壤中存在水但植物不能有效地吸取時，也可能出現植 物對水的可獲得性受限。例如，當土壤強結合水時或水具有高含鹽量時，植物可能更難從土 壤吸取水。因此，許多因素可能有助于導致植物的水可獲得性受限，即干旱。植物經歷"干 旱"或"干旱脅迫"的影響可能是植物不能具有最佳生長和/或發育。經歷干旱的植物可具 有枯萎癥狀。例如，植物可以在其中不提供水（例如，沒有降雨和/或灌溉植物）的特定控 制條件經歷至少15天的時期。
[0048] 術語"改善的抗旱性"指當具有改善的抗旱性的植物經歷干旱或干旱脅迫時，不 會顯示如沒有具有改善的抗旱性的植物中觀察到的影響或顯示減輕的影響。正常植物具 有一定水平的抗旱性。通過在所選控制條件下比較對照植物與具有改善的抗旱性的植物， 可容易地確定植物是否具有改善的抗旱性，因此，在一定時期之后，即當植物經歷干旱或干 旱脅迫時，可以觀察到對照植物干旱癥狀。與對照植物相比，具有改善的抗旱性的植物將 顯示較少和/或減少的已經歷干旱的癥狀，例如枯萎。本領域技術人員知道如何選擇合適 的條件，例如像實施例中的控制條件。當植物具有"改善的抗旱性"時，經干旱或干旱脅迫 時能夠持續正常生長和/或正常發育，否則將導致正常植物的生長減慢和/或發育減慢。 因此，"改善的抗旱性"是通過比較植物而確定的相對術語，其中在干旱脅迫下最能夠持續 (正常）生長的植物是具有"改善的抗旱性"的植物。本領域技術人員熟知如何選擇用于測 定植物抗旱性的合適條件和如何測量干旱癥狀，例如在例如如下提供的手冊描述的：IRRI， Breeding rice for drought prone environments,Fischer等，2003,和CIMMYT,Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize ：from theory to practice, Banzinger 等，2000。Snow 和 Tingey，1985,Plant Physiol，77,602-7,和 Harb 等，Analysis of drought stress in Arabidopsis，A0P2010，Plant Physiology Review 中提供了測定 植物改善的抗旱性的方法的實例，并且如下述實施例部分中描述的。

【具體實施方式】
[0049] 本發明涉及通過破壞所述植物中功能性UPL3蛋白質的表達來改善植物的抗旱 性。改善是相對于其中這樣的改變沒有被引入或不存在且其中功能性UPL3蛋白質的表達 未受損的對照植物而言。換句話說，與對照植物，即非改變的植物相比，根據本發明改變的 植物能夠在水可獲得性減少、（暫時性）缺水或干旱條件下較好地生長和存活。應理解，根 據本發明改變（例如破壞）功能性UPL3蛋白質的表達可包括遺傳修飾，例如遺傳修飾UPL3 基因表達或靶核苷酸交換。
[0050] 遺傳修飾包括在感興趣的核酸序列中引入突變、插入、缺失和/或將基因沉默構 造插入靶向感興趣的核酸序列的植物或植物細胞的基因組中。遺傳修飾編碼mRNA的核酸 序列（例如基因）不僅涉及修飾對應于mRNA序列的外顯子序列，而且涉及使基因組DNA的 內含子序列和/或核酸序列的（其它）基因調節序列（例如基因）的突變。
[0051] 在本發明的上下文中，功能性UPL3蛋白質可以是如下蛋白質：當在具有被破 壞的內源性UPL4基因的擬南芥T-DNA插入系，例如本文列舉的At4g38600敲除系，如 SALK_037636C(http://www. arabidopsis. org/servlets/TairObject ? type = stock&id =3501631890)中表達時，產生與其中所述功能性UPL3蛋白質未表達的、具有被破壞的內 源性UPL3基因的擬南芥T-DNA插入系（例如At4g38600敲除系，如SALK_037636C)的抗旱 性相比抗旱性受損的植物。
[0052] 如本文使用的術語"被破壞的內源性UPL3基因"指被破壞（例如切斷（例如利用 T-DNA插入所述UPL3基因中的方式））植物基因組中的天然存在的UPL3基因。破壞所述 內源性UPL3基因可以導致所述內源性UPL3基因不表達，因此，不存在內源性UPL3蛋白質 (功能性的或非功能性的）。
[0053] 如本文使用的術語"對照植物"指相同種類的植物，優選相同種類，優選相同遺傳 學背景的植物。
[0054] 本發明還涉及通過修飾所述植物中功能性UPL3蛋白質的表達而調節植物的抗旱 性。調節是相對于其中這種修飾沒有被引入或不存在的相似植物（優選地相同種類和/或 品種的，并且優選相同遺傳學背景）而言的。
[0055] 在一個方面，本發明提供一種生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方 法，其包括破壞植物中UPL蛋白質的表達的步驟，所述UPL蛋白質包括包含至少一個根據 PR)0632的Pfam HECT結構域和至少一個根據模型SSF48371的超家族ARM重復單元的氨基 酸序列。
[0056] 在另一個方面，本發明涉及一種用于生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植 物的方法，該方法包括破壞所述植物中功能性UPL3蛋白質表達的步驟。
[0057] 如本文使用的"使功能性UPL3蛋白質的表達受損"可以指UPL3基因的表達已經 受損，和/或UPL3基因的表達正常，但是得到的mRNA的翻譯被抑制或阻止（例如，通過RNA 干擾），和/或UPL3蛋白質的氨基酸序列改變，使得優選地在生理條件下，尤其是在相同的 生理條件下，與如SEQ ID N0:2所述蛋白質的泛素蛋白連接酶比活性相比，其泛素蛋白連接 酶比活性降低。備選地，可以通過同時表達特異性結合所述UPL3蛋白質的抗體而使UPL3 蛋白質變得無功能，從而降低其比活性。如果UPL3蛋白質的泛素蛋白連接酶比活性統計學 顯著地低于如SEQ ID N0:2中所述蛋白質的泛素蛋白連接酶比活性，則可認為該蛋白質的 泛素蛋白連接酶比活性"降低"。UPL3蛋白質的泛素蛋白連接酶比活性可以例如降低至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。可以通過例如使用定向誘 變來改變啟動子序列，實現植物的內源性UPL3基因的表達減少。
[0058] 本發明人相信由于低表達，例如通過RNA干擾，或者降低UPL3蛋白質的活性/功 能性，或上述一種或多種，破壞功能性UPL3蛋白質的表達（例如通過表達和/或活性的降 低、抑制或缺失）導致功能性UPL3蛋白質不存在或水平降低，并且所述功能性UPL3蛋白質 不存在或水平降低導致所述植物對水的需要的減少或抗旱性改善。
[0059] 已知泛素蛋白連接酶蛋白質（UPL)參與酵母菌和動物中調節蛋白的選擇性降解 (Huibregtse 等，（1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, 2563-2567 ;Pickart(2001)Annu. Rev. Biochem. 70, 503-533)。用多個泛素鏈修飾呈遞用于降解的蛋白質，然后被26S蛋白酶 體識別。這些泛素蛋白連接酶蛋白質的一個重要類型是由HECT E3s形成的，其包括在C末 端稱為HECT結構域的保守的350個氨基酸結構域（基于其與人E6-相關蛋白（E6-AP)的 C-末端的同源性）（Huibregtse 等，（1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2563-2567)。HECT 結構域包括圍繞催化泛素轉移所需位置不變的半胱氨酸的高度保守區。
[0060] 根據 Downes 等（2003, Plant J 35, 729-742)，植物也含有 HECT E3s，擬南芥中存 在 7 個：UPL1、UPL2、UPL3、UPL4、UPL5、UPL6 和 UPL7。Downes 等進一步描述了可以基于相 應基因的內含子/外顯子位置、蛋白質序列和長度、以及HECT結構域的上游存在另外的蛋 白質基序將UPL1、UPL2、UPL3、UPL4、UPL5、UPL6和UPL7按結構分成四個子家族：UPL1/2、 UPL3/4、UPL5和UPL6/7。HECT結構域上游存在多種結構域表明的UPL1-UPL7家族的單獨成 員具有不同的革巴標和功能的集合（參見Downes等，2003，The Plant Journal, 35,729-742， 特別是其圖1，關于不同UPL蛋白質的不同特性的更多信息）。
[0061] 在擬南芥中，可通過例如由于不存在來自泛素連接酶4的C-末端的225-殘基區 域650個氨基酸而使泛素蛋白連接酶4與泛素蛋白連接酶3區別開（Downes等，（2003) Plant J35, 729-742)。
[0062] 其他人已經報道在擬南芥中發現的泛素蛋白連接酶4具有與泛素蛋白連接酶3約 54%的氨基酸序列同一性（Downes等，（2003)Plant J35,729-742)。泛素蛋白連接酶3的 基因座名稱為At4g38600/At4g38610, 0RF名稱為F20M13. 160/F20M13. 170(兩者都是根據 www.uniprot. org/uniprot/Q6ffffff4)〇
[0063] 擬南芥的UPL3蛋白質包括1888個氨基酸（如SEQ ID NO:2中所述）。編碼擬南 芥的UPL3蛋白質的cDNA包含4506個核苷酸（SEQ ID NO: 1中所述）。
[0064] 如本文使用的"UPL3蛋白質"包含SEQ ID N0:2中所述的蛋白質、及其片段和變 體。UPL3蛋白質的變體包括，例如優選地在全長上與SEQ ID N0:2具有至少30%、35%、 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高，例如 100%的氨基酸序列同一'丨生的蛋白質。使用如上定義的Needleman和Wunsch算法及GAP缺 省參數，通過雙序列比對確定氨基酸序列的同一性。如果UPL3蛋白質具有泛素蛋白連接酶 活性，則其可以被認為是功能性的。
[0065] 由 Downes 等（(2003) Plant J. 35, 729-742)知道在編碼 UPL3 的基因中具有 T-DNA 插入的擬南芥植物。該UPL3突變體顯示毛狀體發育異常。
[0066] 在另一個方面，提供一種用于生產具有改善的抗旱性的方法，該方法包括破壞編 碼UPL3蛋白質的基因在所述植物中表達的步驟。
[0067] 根據本發明，"表達受損"指功能性UPL3蛋白質和包含與其具有超過仙1%』。 1%、 60 %、70 %、80 %、90 %、95 %序列同一性的氨基酸序列的其變體不存在的或存在減少。其也 指本文所述包括至少一個Pfam HECT結構域（PR)0632)和至少一個超家族ARM重復（模型 SSF48371)的蛋白質不存在或存在減少。本領域技術人員熟知本領域其可獲得許多機制，以 在例如轉錄水平或翻譯水平破壞基因或蛋白質的表達。
[0068] 在另一個方面，提供一種用于增強植物抗旱性的方法，所述方法包括破壞基因或 蛋白質在所述植物中表達的步驟，其中所述基因編碼的氨基酸序列（或蛋白質）包括至少 一個Pfam HECT結構域（PR)0632)和至少一個超家族ARM重復（模型SSF48371)，如下所述 確定的。應當理解，短語"至少一個超家族ARM重復模型SSF48371"包括來自SEQ ID N0:1 中描述的UPL3基因的四個犰狳（Armadillo)重復序列。因此，短語"至少一個超家族ARM 重復模型SSF48371"指包括四個犰狳重復序列。
[0069] 如本文使用的"Pfam"或"PFAM"指涵蓋許多常見蛋白質家族的多重序列比對和隱 Markov模型的大集合，可從http://pfam. sanger. ac. uk/獲得。Pfam數據庫含有蛋白質家 族的大集合，每個代表多重對比。這些比對常用于每個蛋白質結構域家族的隱馬爾可夫模 型（HMM)。該比對代表進化保守結構，并且感興趣的蛋白質中結構域的存在可以指示其生物 功能。由Pfam比對構建的分布型譜隱馬爾可夫模型（profile HMM)用于自動識別屬于現有 蛋白質家族的新蛋白質，即使通過排列比對的同源性似乎是低的。通過使用HMMER軟件，查 詢針對Hidden Markov Model的蛋白質序列的氨基酸序列識別同一蛋白質家族中的其它蛋 白質。HMMER軟件（來自http://hmmer. janelia.org/，版本3.0)能夠使用該HMM在新序 列中搜索該結構域的存在。通過考慮僅HMMER在其序列的命中數（其高于默認包含閾值）， 獲得可能的候選蛋白質命中數。
[0070] Pfam version 24. 0(2009年10月）含有11912個蛋白質家族的比對和模型（參 見 The Pfam protein families database:R. D. Finn 等，Nucleic Acids Research(2010) Database Issue 38:D211-222)。Pfam是基于稱為Pfamseq的序列數據庫，其是基于 UniProt releasel5. 6 (Swiss-Prot release 57. 6 和 SP-TrEMBL release 40.6)。
[0071] Pfam數據庫中的比對代表可能與蛋白質功能相關的進化保守結構。從Pfam比對 構建的該隱馬爾可夫模型（HMM)用于確定蛋白質是否屬于現有蛋白質家族。這就是事實， 即使比對的同源性很低。例如，一旦參與某些特性（例如對干旱的敏感性）的蛋白質被識別 出，并且例如破壞其表達將賦予增強的特性（例如增強抗旱性），本領域技術人員可以通過 使用 HMMER 軟件（http://hmmer· janelia. org/，version· HMMER version 3. 0 公布于 2010 年3月28日），針對表征Pfam結構域的隱馬爾可夫模型（本發明中的Pfam HECT PR)0632 模型），比較蛋白質（和候選DNA編碼的）的氨基酸序列，確定同一蛋白質家族中的其它蛋 白質。
[0072] 在確定存在上述Pfam HECT結構域（PR)0632)之后，候選蛋白質還必須滿足要 求：包含至少一個超家族 ARM 重復（HMM 模型 SSF48371 ;http://supfam. org/SUPERFAMILY/ cgi-bin/scop. cgi ? ipid = SSF48371，如可以通過例如使用 InterProScan 應用程序 (http://www. ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/;Quevillon 等，（2005)33(2)W116_W120; E.M.Zdobnov and R.Apweiler(2001)Bioinformatics，17, 847 - 848)確定。Quevillon 及 其同事描述了 InterProScan是一種將來自InterPro集團成員數據庫的不同蛋白質特征 (signature)識別方法合并成一個資源（應用中具有不同的公開可用的數據庫）的工具。可 以分析蛋白質以及DNA序列。基于網頁的版本是學術和商業組織從EBI (http://www. ebi. ac.uk/InterProScan/)可訪問的。
[0073] SUPERFAMILY注釋（annotation)是基于隱馬爾可夫模型的集合，其代表SC0P超家 族水平的結構蛋白結構域。超家族將具有進化關系的結構域聚合在一起。針對隱馬爾可夫 模型從超過1，400個全序列基因組掃描蛋白質序列而產生注釋。
[0074] 所有軟件都以默認設置使用。
[0075] 總之，對于HECT結構域的隱馬爾可夫模型（PF00632模型http://pfam. sanger. ac.uk/family? acc = PF00632)是從 Pfam 數據庫（版本 24,來自 http://pfam. sanger. ac.uk/)獲得的，并放入單獨的文件中。使用HMMER軟件確定特征為Pfam HECT結構域 的氨基蛋白序列。另外，通過使用來自InterProScan application (http://www.ebi. ac. uk/Tools/pfa/iprscan/)的超家族程序包（使用 SSF48371 模型 http://supfam. org/ SUPERFAMILY/cgi-bin/scop. cgi ? ipid = SSF48371)進一步減少過濾的蛋白質集合，以查 找ARM重復。
[0076] 滿足兩個要求（具有Pfam HECT PR)0632結構域和超家族SSF48371模型Arm重 復）的（植物）蛋白質是根據本發明的蛋白質；并且破壞其表達可在對植物提供改善的/ 增強的抗旱性方面是有用的，本文公開了這樣的蛋白質和cDNA的實例。本領域技術人員熟 知如何基于上述提供的信息進行測定和檢測。
[0077] 不受理論的束縛，本發明人推測根據本發明的蛋白質中存在這一結構域組合增強 了植物對于干旱的敏感性，而破壞具有這些結構域的這類蛋白質的表達改善了植物的抗旱 性。
[0078] 轉錄水平的破壞可能是在轉錄調控序列（包括啟動子、增強子、起始子、終止子或 內含子剪切序列）中引入一個或多個突變的結果。這些序列通常位于根據本發明的基因的 編碼序列的5'、3'或該編碼序列內。也可以通過基因編碼區中核苷酸的缺失、取代、重排或 插入獨立地或同時地提供表達的破壞。
[0079] 例如，在編碼區中，核苷酸可以被取代、插入或缺失，導致引入一個、兩個或更多個 過早（premature)終止密碼子。而且，插入、缺失、重排或取代可以導致編碼的氨基酸序列 中的修飾，從而提供功能性UPL3蛋白質的受損表達。甚至更大部分的基因可以被移除，例 如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或者甚至100%的基因（編碼 區）被從植物中存在的DNA中移除，從而破壞功能性UPL3蛋白質的表達。
[0080] 備選地，可以將一個、兩個、三個或更多個核苷酸引入編碼UPL3蛋白質的一個或 多個基因中，其導致例如移碼，或導致引入編碼另外的氨基酸的序列，或引入不編碼氨基酸 的序列，或引入大的插入片段，從而破壞功能性UPL3蛋白質的提供/表達。
[0081] 換句話說，如上所述編碼UPL3蛋白質的核苷酸序列中核苷酸的缺失、取代或插入 可導致例如移碼、引入終止密碼子、或引入無義密碼子。特別地，通常接受引入終止密碼子 和引入移碼突變作為有效的方式，以產生敲除種植，即具有特定蛋白質的表達和/或活性 降低、被抑制或缺失的敲除植物的有效方式。
[0082] 移碼突變（也稱為框架錯誤或閱讀框移位）是一種由核苷酸序列中不能被3可整 除的大量核苷酸的indel (插入或缺失）導致的遺傳突變。由于基因表達利用密碼子的三 聯體性質，插入或缺失可改變讀碼框（密碼子組），導致與原始完全不同的翻譯。序列中缺 失或插入發生的越早，生成蛋白質的改變越多。移碼突變通常將導致對突變之后密碼子的 閱讀，以編碼不同的氨基酸，但是可能存在由遺傳密碼冗余造成的例外。此外，原始序列中 終止密碼子（"UAA"、"UGA"或"UAG"）不會被閱讀，替代的終止密碼子可產生較早或更遲 的位點。生成的蛋白質可異常短或異常長。
[0083] 在編碼如本文定義的UPL3蛋白質的核苷酸序列中引入終止密碼子可導致轉錄過 早終止，其通常產生縮短的、不完整的或無功能的UPL3蛋白質。優選地，最初在轉錄方向引 入終止密碼子。在核苷酸序列中引入終止密碼子越早，生成蛋白質越短，并且改變越多。在 編碼UPL3蛋白質的核苷酸序列中引入無義密碼子可產生轉錄mRNA，其中，例如一個密碼子 不再編碼UPL3中天然存在的氨基酸，例如通常編碼UPL3蛋白質的功能必要的氨基酸的密 碼子。因此，這樣的UPL3蛋白質可能沒有功能。
[0084] 換句話說，破壞可包括使本文公開的基因中的一個或多個核苷酸突變，導致蛋白 質表達產物較少或甚至完全不存在（即，不存在當沒有如上述修飾的根據本發明的基因時 將獲得蛋白質），或導致存在無功能的蛋白質。
[0085] 因此，在本文公開的方法的一個實施方式中，破壞是所述基因中一個或多個突變 的結果，導致較少的蛋白質表達產物的存在或不存在蛋白質表達產物。
[0086] 如本文較少使用的術語抑制/存在指與其中表達未受損的對照植物相比，蛋白質 表達降低至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至99%。術語"蛋白 質表達不存在"指實際上不存在任何表達產物，例如與對照相比少于5%、4%、3%、2%或甚 至少于1%。
[0087] 如本領域技術人員理解，通過使用誘變化合物（例如甲磺酸乙酯（EMS)或能夠在 核苷酸序列中（隨機）引入突變的其它化合物）也可以在編碼如本文定義的UPL3的核苷 酸序列中引入突變。所述誘變化合物或所述其它化合物可用作產生具有在編碼UPL3蛋白 質的核苷酸序列中的突變的植物的工具。
[0088] 備選地，在編碼根據本發明的（UPL3)蛋白質的核苷酸序列中引入的突變受在 編碼這樣的蛋白質的核苷酸序列中引入的轉移-DNA(T-DNA)的影響，例如某些細菌種屬 (例如根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens))的腫瘤-誘導（Ti)質粒的T-DNA。 T-DNA元件可以被引入所述核苷酸序列中，產生無功能的蛋白質或蛋白質的表達缺失，因 此減小了根據本發明的方法獲得的植物對水的需要（參見例如Krysan等，1999The Plant Cell, Vol 11. 2283?2290)。使用轉座因子插入可以獲得同樣的優點（參見，例如Kunze 等，（1997)Advances in Botanical Research 27341-370 或 Chandlee(1990)Physiologia Planta 79(1) 105 - 115)。
[0089] 優選地，通過靶核苷酸交換（TNE)進行在編碼根據本發明的蛋白質的核苷酸序列 中突變的引入，例如像W02007073170中所述。通過使用TNE，可以改變編碼UPL3的核苷酸 序列中的特定核苷酸，由此，例如可以引入終止密碼子，其可例如產生編碼根據本發明具有 活性降低或消失的縮短的蛋白質的核苷酸序列。
[0090] 在另一個實施方式中，提供一種如上面公開的方法，其中功能性UPL3蛋白質的表 達破壞是通過無功能的蛋白質表達引起的。如上述，本領域技術人員在確定根據本發明的 基因的功能性方面沒有問題。例如，可以通過將沒有任何修飾的對照基因引入其中根據本 發明的蛋白質的表達已經受損植物中進行補充研究，并且研究抗旱性。
[0091] 備選地，可以進行類似于如下實施例中所述那些實驗的實驗，并通過與合適的對 照/野生型植物相比較，測定其中將一個或多個突變引入根據本發明的基因中的植物的抗 旱性。
[0092] 也可以在翻譯水平提供破壞，例如通過引入過早終止密碼子或通過影響（例如蛋 白質折疊的）的翻譯后修飾。
[0093] 與機制無關，通過功能性UPL3蛋白質不存在或存在減少而表示根據本發明的破 壞。如上面解釋，如本文使用的術語表達抑制或存在減少指與其中表達未受損的對照植 物相比，蛋白質表達降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至 99%。術語"蛋白質表達不存在"指實際上不存在任何表達產物，例如與對照相比少于5%、 4%、3%、2%或甚至少于1%。
[0094] 根據另一個實施方式，破壞是由基因沉默引起的，例如使用RNA干擾或RNA沉默。 [0095] 借助于本領域技術人員容易獲得的分子生物學方法，基因的破壞也可以通過基 因沉默實現，例如使用RNA干擾技術、dsRNA或其它表達沉默技術（參見例如，Kusaba等， (2004)Current Opinion in Biotechnology 15:139 - 143 或Preuss and Pikaard(2003) in RNA Interference (RNAi)?Nuts&Bolts of siRNA Technology (pp. 23-36)，? 2003by DNA Press，LLC Edited by:David Engelke，Ph.D.)或，如上已經討論的敲除。
[0096] 在另一個優選的實施方式中。且如上已經討論的，提供一種根據本發明的方法，其 中所述破壞是由至少一個核苷酸的插入、缺失和/或取代引起的。例如，在根據本發明的基 因中可以插入、缺失或取代1、2、3...10、40、50、100、200、300、1000或甚至更多的核苷酸。還 預期所述基因的編碼區或非編碼區中插入、缺失和/或取代的組合。.
[0097] 在本文公開的方法的另一個實施方式中，所述方法包括破壞所述植物中編碼UPL3 蛋白質的超過1個、例如2、3、4、5或所有基因的表達的步驟。
[0098] 在該實施方式中，如上所述且存在于具體植物中超過一個基因的表達受損。例如， 存在于植物中的編碼UPL3蛋白質的一個、兩個、三個、四個或所有基因的表達受損。通過同 時破壞上述多個基因（當植物中存在時）的表達，可以獲得更加改善的抗旱性。
[0099] 在另一個實施方式中，根據本發明的方法提供的植物可用于生產其它植物和/或 由其衍生的植物產品。術語"植物產品"指可以從生長的植物獲得的那些材料，并且包括壓 碎的、磨碎的或仍完整的、與其它材料混合的、干燥的、冷凍等的果實、葉子、植物器官、植物 脂肪、植物油、植物淀粉、植物蛋白質級分。通常，如上述，可通過例如本文所公開的修飾為 使功能蛋白的表達受損的基因的存在識別這樣的植物產品。
[0100] 優選地，在屬于十字花科（包括甘藍型油菜（油菜籽）、茄科（包括番茄）、或葫蘆 科（包括甜瓜和黃瓜）、或禾本科（包括稻屬（包括稻）或玉米屬（包括玉蜀黍（玉米）））、 或豆科（包括豆類、豌豆或菜豆）的植物中，根據本發明的UPL3蛋白質的表達和/或活性 受損（例如降低、抑制或缺失）。優選地，根據本發明的方法應用于番茄、稻、玉蜀黍、甜瓜或 黃瓜，從而提供與相應未轉化的植物相比具有對水的需求減小或抗旱性改善的植物。
[0101] 還提供通過根據本發明的方法可獲得的植物細胞、植物或其衍生的植物產品，其 中所述植物細胞、植物或植物產品顯示與沒有經根據本發明的方法的對照植物相比功能性 UPL3蛋白質的表達降低。
[0102] 還提供植物細胞、植物或其衍生的植物產品，特征在于在所述植物細胞、植物或其 衍生的植物產品中，編碼UPL3蛋白質的至少一個（優選所有）基因的表達受損，例如當對 應于從所述至少一個基因轉錄的mRNA序列的cDNA序列包括SEQ ID NO: 1所示序列，或對 應于從所述基因轉錄的mRNA序列的cDNA包括與SEQ ID NO: 1的序列（優選在全長上）至 少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%同一性的序列，和/或其中由所述至少一個基因 編碼的氨基酸序列包括SEQ ID N0:2所示的序列，和具有與SEQ ID N0:2的序列大于30%、 35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%同一性的氨基酸序列，和/或其中由所述至 少一個基因編碼的氨基酸序列包括如上定義的至少一個Pfam HECT結構域（PR)0632)和至 少一個超家族ARM重復（模型SSF48371)。優選地，所述植物不是如實施例中所述的擬南芥 T-DNA插入突變體。
[0103] 在另一個方面，本發明涉及其中基因或核苷酸序列用于向植物提供提高的抗旱性 的用途，其中對應于從所述基因轉錄的mRNA序列的CDNA包括SEQ ID NO: 1所示序列的基 因，或對應于從所述基因轉錄的mRNA序列的cDNA包括與其至少40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%、95%同一性的序列，和/或其中由所述基因編碼的氨基酸序列包括SEQ ID N0:2 所示序列和與其大于30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%同一性的氨基酸 序列，和/或其中由所述基因編碼的氨基酸序列包括如上定義的至少一個Pfam HECT結構 域（PR)0632)和至少一個超家族ARM重復（模型SSF48371)。
[0104] 在該實施方式中，根據本文公開的內容，所述基因可用作改善植物抗旱性的靶標， 或者所述基因可用于鑒別參與干旱敏感性和抗性的新的蛋白質。
[0105] 在另一個實施方式中，提供具有擬南芥種屬的SEQ ID No. 1或2的UPL3序列在 擬南芥植物抗旱性篩選中的用途。另外，提供其中UPL3序列為與其它植物種屬的SEQ ID No. 1或2類似的序列并且其中在其它植物種屬的植物中篩選的用途。此外，提供用于篩選 具有改善的抗旱性的植物或植物細胞的方法，所述方法包括步驟：
[0106] -提供擬南芥種屬的植物細胞或植物的異質種群；
[0107] -提供具有SEQ ID No. 1或2的UPL3序列；
[0108] -測定所述植物細胞或植物的UPL3基因的至少一部分的序列；
[0109] -比較由所述植物細胞或植物測定的UPL3序列與提供的UPL3序列；
[0110] -鑒別其中UPL3序列包括突變的植物細胞或植物。
[0111] 備選地，在該方法中，提供的植物細胞或植物屬于其它種屬，并且其中提供的UPL3 基因序列為其它種屬的相似序列。
[0112] 因此，通過使用擬南芥種屬的UPL3序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2或來自其它 種屬的相似序列，可以鑒別可提供改善的抗旱性的植物種屬中突變的UPL3序列。擬南芥種 屬的UPL3序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2在其它種屬中的相似序列定義為與其具有至 少 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少99%序列同一性的序列。相 似的UPL3蛋白質可以具有與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2基本上相同的功能。
[0113] 在該方法中，提供所述種屬的植物細胞或植物的異質種群。所述異質種群可以例 如通過如下提供：使植物細胞接受引入隨機突變的誘變劑，從而提供植物細胞的異質種群。 因此，所述異質種群可以來源于單個植物品種，其接受隨機誘變以便后代獲得多種突變，從 而提供異質種群。許多誘變劑是本領域已知的，例如離子輻射、UV-射線、和誘變化學物（例 如疊氮化物、溴化乙錠或甲磺酸乙酯（EMS))。因此，本領域技術人員知道如何提供植物或植 物細胞的異質種群。而且，本領域技術人員也可提供多種植物作為異質種群，即來自多個種 屬的非單一品種。多種植物顯示遺傳多樣性，它們遺傳上是不同的，但是因為植物來自同一 種屬，所以它們是基本上相同的。在任何情況下，植物細胞或植物的異質種群可以具有至少 95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或至少 99. 9%的序列同一性。
[0114] 通過測定含有來自異質種群的植物或植物細胞的序列的UPL3基因序列的至少一 部分序列，然后比較這些序列與提供的UPL3基因序列（對照），可以鑒別包括UPL3基因序 列突變的植物細胞或植物。應理解，可以通過序列的比對進行這樣的比較，并且突變為在植 物種屬的相似（對照）UPL3序列中至少一個核酸或氨基酸位置的不同。這樣，鑒別具有可 以提供改善的抗旱性的UPL3基因突變（例如，插入、缺失、取代）的植物或植物細胞。
[0115] 優選地，選擇具有將導致功能性UPL3蛋白質的表達破壞的突變的植物，例如上 述已經列舉的。將破壞功能性UPL3蛋白質表達的突變可以是如下突變：破壞開放讀碼框 (引入移碼或終止密碼子），或通過改變編碼蛋白質的正常功能必需的氨基酸的密碼子中 核苷酸來破壞或以其它方式改變編碼蛋白質功能，從而導致與非改變的蛋白質相比對干旱 (draught)的抗性改善（例如增強）。該方法也可用于例如篩選和選擇已經經祀向上述UPL3 基因序列的遺傳修飾的植物。而且，所述UPL3序列也可用于篩選檢測其中經歷干旱的植物 的（異基因）種群。可提供顯示改善的耐旱性的植物。
[0116] 在另一個實施方式中，提供具有擬南芥種屬的SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的UPL3 的至少一部分作為培育抗旱擬南芥植物的標記物的用途。而且，所述UPL3序列可以是其它 種屬的相似序列，其中所述標記物用于培育其它種屬的抗旱植物。
[0117] 本發明還涉及其中功能性UPL3蛋白質的表達受損的植物、植物細胞或植物產品 用于在干旱脅迫條件下生長的用途，其中所述功能性UPL3蛋白質為如下蛋白質：當在具有 被破壞的內源性UPL3基因的擬南芥T-DNA插入系中表達時，其得到與其中所述功能性UPL3 蛋白質未表達、具有被破壞的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗 旱性受損的植物，其中所述干旱脅迫條件引起其中所述功能性UPL3蛋白質的表達未受損 的對照植物、植物細胞或植物產品比其中功能性UPL3蛋白質的表達被破壞的植物、植物細 胞或植物產品更早地顯示干旱脅迫癥狀，例如枯萎癥狀。
[0118] 在一個方面，本發明涉及通過本文教導的方法可獲得的或獲得的植物、植物細胞 或植物產品。另外，本發明提供來源于這樣的植物的種子。
[0119] 本發明還涉及其中功能性UPL3蛋白質的表達受損的植物、植物細胞或植物產品， 其中所述功能性UPL3蛋白質為如下蛋白質：當在具有被破壞的內源性UPL3基因的擬南芥 T-DNA插入系中表達時，其產生與其中所述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞的內源 性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。所述植物、植物 細胞或植物產品可以包括例如被破壞的內源性UPL3基因。
[0120] 所述植物、植物細胞或植物產品可以是任何植物或植物細胞，或者可以來源 于任何植物，例如單子葉植物或雙子葉植物，但是所述植物最優選屬于茄科。例如， 植物可以屬于爺屬（包括番爺屬（lycopersicum))、煙草屬、辣椒屬、碧冬爺屬及其它 屬。可合適地使用下述宿主：煙草（煙草種，例如本生煙草（N. Benthamiana)、皺葉煙 草（N. Plumbaginifolia)、普通煙草（N. Tabacum)等）、蔬菜種（例如番爺（Solanum lycopersicum)(例如，如搜桃番爺變種cerasiforme或醋栗番爺變種pimpinellifolium、 或樹番爺（S. betaceum，同種異名 Cyphomandra betaceae))、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、 爺子（Solanum melongena)、爺瓜（Solanum muricatum)、可可果（Solanum sessiliflorum) 和奎東爺（Solanum quitoense)、辣椒類（甜椒（Capsicum annuum)、小米椒（Capsicum frutescens)、風鈴辣椒（Capsicum baccatum))、觀賞物種（例如，矮牽牛（Petunia hybrida)、肢花矮牽牛（Petunia axillaries)、匍匍性青紫矮牽牛（P.integrifolia))。
[0121] 備選地，所述植物可以屬于任何其它科，例如葫蘆科或禾本科。合適的宿主植物 包括例如玉米/谷類（玉蜀黍種（Zea species)、小麥（小麥種（Triticum species)、 大麥（例如大麥（Hordeum vulgare))、燕麥（例如燕麥（Avena sativa))、高粱（高粱 (Sorghum bicolor))、黑麥（黑麥（Secale cereale))、大豆（野生大豆屬種（Glycine spp)，例如大豆（G. max))、棉花（棉屬種（Gossypium species)，例如陸地棉（G. hirsutum)、 海島棉（G.barbadense))、蕓苔屬種（Brassica spp.)(例如，甘藍型油菜（B.napus)、芥菜 (B. Juncea)、甘藍（B. Oleracea)、完菁（B. Rapa)等）、向日葵（Helianthus annus)、紅花、 山藥、木薯、紫花苜猜（Medicago sativa)、稻（稻屬種（Oryza species),例如秈稻栽培種 (0· sativa indica cultivar-group)或粳稻栽培種（japonica cultivar-group)、飼料草、 珍珠稗（狼尾草屬種（Pennisetum spp·)，例如珍珠栗（P.glaucum)，樹種（松屬（Pinus)、 楊樹、冷杉、車前草（plantain)等）、茶樹、咖啡樹、油棕、椰樹，蔬菜種例如豌豆、西葫蘆、豆 類（例如菜豆屬種（Phaseolus species))、黃瓜、朝鮮薊、蘆筍、西蘭花、大蒜、韭菜、萵苣、 洋蔥、蘿卜、蕪菁、抱子甘藍、胡蘿卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠菜、菊苣、茴香、甜菜）、結肉質果 植物（葡萄、桃子、李類（plums)、草莓、芒果、蘋果、李樹（plum)、櫻桃、杏、香蕉樹、黑莓、越 橘、柑橘、獼猴桃、無花果、檸檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、橙子、葡萄柚等）、觀賞物種（例 如，玫瑰花、矮牽牛花、菊花、百合、大丁草屬種）、草本類（薄荷、歐芹、羅勒、百里香、等）、木 本樹（例如，楊屬種、柳屬種、櫟屬種、桉屬種）、纖維物種例如亞麻（Linum usitatissimum) 和大麻（Cannabis sativa)、或者模式生物（例如擬南芥）。
[0122] 優選的宿主是"作物植物"，即人類種植和培育的植物物種。可以種植作物植物用 于食物目的（例如田間作物）、或用于觀賞目的（例如，產生用于切枝的花、用于草坪的草 等）。如本文定義的作物植物也包括從其中收獲非食用產物的植物，例如用于燃料的油、塑 料聚合物、藥物制品、軟木等。
[0123] 優選地，本發明的植物、植物細胞或植物產品不是擬南芥或蕪菁植物、植物細胞或 植物產品。
[0124] 本發明的植物、植物細胞或植物產品可以為例如番茄或蕪菁植物、植物細胞或植 物產品。
[0125] 因此，本發明涉及例如其中功能性UPL3蛋白質的表達受損的番茄、陸地棉、大豆、 小麥屬植物、大麥、燕麥、高粱、黑麥或甘藍型油菜植物、植物細胞或植物產品，其中所述功 能性UPL3蛋白質為如下蛋白質：當在具有被破壞的內源性UPL3基因的擬南芥T-DNA插入 系中表達時，其產生與其中所述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞的內源性UPL3基因 的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。所述植物、植物細胞或植物 產品可以包括被破壞的內源性UPL3基因。
[0126] 文中列舉的所有文獻的全部內容均通過引用合并于此。
[0127] 實施例
[0128] 實施例1干旱實駘
[0129] 從諾 丁漢擬南芥種子中心（NASC ;School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE125RD United Kingdom)獲得用 根癌土壤桿菌載體PR0K2轉化擬南芥（At)種子產生的功能性UPL3蛋白質缺失的（NASC ID:N670558, AGI代碼At4g38600和SALK_037636C ;下文稱為突變體種子或突變體植物）。 使用At Col-0 (Columbia, N60000)作為對照；下文稱為對照種子或植物。
[0130] 生長培養基：
[0131] 使用包含一份沙和蛭石與兩份堆肥的土壤混合物（沙：蛭石：堆肥=1:1:2)。該 混合物增加水滲透，因此促進每個盆均勻的水吸收和更好的排水。在播種之前，將種子在黑 暗濕潤的條件下于4°C下保持3天，進行層積處理。
[0132] 將突變體和對照種子都種在含有?4cm直徑的8X5 = 40個盆的長方形盤中，每 個盆的密度為5株植物。在發芽（DAG)之后10天，從盤中盆的底部向所有植物提供營養液 (EC = 1. 5)，并且在15DAG，通過將盆轉移到干的盤中而使植物經歷干旱（15、16、17或18 天）。然后，給植物加水，1周后觀察植物恢復。
[0133] 在預干旱篩選中，包括每個基因型三個盆平行測定。完成實驗所需的總時間約為 36?39天。
[0134] 干旱測定檢查
[0135] -旦植物達到2個真葉階段，將其間苗保持嚴格每個盆5株植物。在10DAG，植物 接受營養物（EC = 1. 5)，并且在15DAG，將每個盆轉移到干的盤。從這一天起，植物不再接 受任何水。每天，觀察植物，尤其是對照（或野生型）（Col-Ο)的枯萎癥狀。在干旱（D0D) 第15天時，Col-Ο完全枯萎，并且加水時不能恢復。將這一天確定為其永久枯萎點（PWP)。 從這一天起，向突變體的一個平行測定加水，觀察恢復癥狀，并照相。與對照相比，突變體顯 示在干旱下多存活至少2天，并使其經進一步嚴格的篩選。
[0136] 實施例2干旱實駘
[0137] 生長培養基：
[0138] 在預篩選實驗中，將與實施例1中相同的突變體和對照植物種植在如上所述類似 的盤裝置中。通過從15DAG中斷供水而使植物受脅迫，直到對照植物達到其PWP。在該期 間，每隔一天，將各盆在盤內隨機擺放（shuffled)，以減少位置效應且允許均勻蒸發。在第 1OT0D天，對照植物達到PWP，并且當加水時沒有恢復。從15D0D開始，每天給來自突變體的 一個盆平行測定加水，并檢查干旱脅迫恢復。照相，并對恢復情況評分。突變體顯示在對照 達到其PWP之后至少3天以上才從干旱脅迫恢復。
[0139] 圖1顯示比較突變體和對照（左側）的圖片，表明突變體（右欄）關于對干旱脅 迫的抗性的優異效果。
[0140] 實施例3干旱實駘
[0141] 植物材料.具有被破壞的AT4G38600基因（SALK_037636C)的TDNA插入系從諾丁 漢擬南芥種子中心（NASC)獲得。通過使用浸花法轉化（floral dip transformation)穩 定地轉化擬南芥植株而產生互補系（Bent等，2006. Methods Mol. Biol. Vol. 343:87-103)。 由包括番茄（西紅柿）和水稻（rice)和模式物種擬南芥（UPL4 ;AT5G02880)的幾種作物品 種鑒別擬南芥（AT4G38600)UPL3基因的同系物。
[0142] 表1.擬南芥UPL3基因的同系物
[0143]

【權利要求】
1. 用于生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破壞植物 中UPL蛋白質表達的步驟，和可選擇地再生所述植物，所述UPL蛋白質包括包含至少一個根 據PF00632的Pfam HECT結構域和至少一個根據模型SSF48371的超家族ARM重復的氨基 酸序列。
2. 用于生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破壞植 物、植物細胞或植物原生質體中功能性UPL3蛋白質表達的步驟，和可選擇地再生所述植 物，其中所述功能性UPL3蛋白質包括包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少30%同一性的 氨基酸序列。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述功能性UPL3蛋白質包括包含至少一個根據 PR)0632的Pfam HECT結構域和至少一個根據模型SSF48371的超家族ARM重復的氨基酸序 列。
4. 根據權利要求2或3中任一項所述的方法，其中所述功能性UPL3蛋白質為如下蛋白 質：當在具有被破壞的內源性UPL3基因的擬南芥T-DNA插入系中表達時，其產生與其中所 述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系 的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
5. 用于生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破壞植 物、植物細胞或植物原生質體中功能性UPL3蛋白質表達的步驟，和可選擇地再生所述植 物，其中所述功能性UPL3蛋白質包括具有至少一個根據PF00632的Pfam HECT結構域和至 少一個根據模型SSF48371的超家族ARM重復的氨基酸序列。
6. 用于生產具有與對照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破壞功能 性UPL3蛋白質的表達的步驟，和可選擇地再生所述植物，其中所述功能性UPL3蛋白質由包 括具有與SEQ ID NO: 1的核酸序列至少60%同一性的核酸序列的核酸序列編碼。
7. 根據權利要求5?6中任一項所述的方法，其中所述功能性UPL3蛋白質為如下蛋白 質：當在具有被破壞的內源性UPL3基因的擬南芥T-DNA插入系中表達時，其產生與其中所 述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系 的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
8. 根據權利要求2?7中任一項所述的方法，其中所述破壞功能性UPL3蛋白質的表達 的步驟包括使編碼所述功能性UPL3蛋白質的核酸序列突變。
9. 根據權利要求8的方法，其中使所述核酸序列突變包括至少一個核苷酸的插入、缺 失和/或取代。
10. 根據權利要求1?8中任一項所述的方法，其中所述破壞表達的步驟包括基因沉 默。
11. 根據權利要求2?10中任一所述的方法，所述方法包括破壞所述植物中兩種或更 多種功能性UPL3蛋白質表達的步驟。
12. 根據權利要求1?11中任一項所述的方法，所述方法進一步包括由具有改善的抗 旱性的植物生產植物或植物產品的步驟。
13. 與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少30%同一性的氨基酸序列或與SEQ ID N0:1 的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列在植物抗旱性篩選中的用途。
14. 具有SEQ ID N0:2的UPL3氨基酸序列或SEQ ID NO: 1的UPL3核酸序列在擬南芥 植物抗旱性篩選中的用途。 15. SEQ ID N0:1的UPL3核酸序列的至少一部分或SEQ ID N0:2的UPL3氨基酸序列的 至少一部分作為培育抗旱性擬南芥植物的標記物的用途。
16. 如權利要求2?7中任一項所定義的功能性UPL3蛋白質用于調節、優選地增強植 物抗旱性的用途。
17. 其中功能性UPL3蛋白質的表達受損的植物、植物細胞或植物產品用于在干旱脅迫 條件下生長的用途，其中所述功能性UPL3蛋白質為如下蛋白質：當在具有被破壞的內源性 UPL3基因的擬南芥T-DNA插入系中表達時，其產生與其中所述功能性UPL3蛋白質未表達、 具有被破壞的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植 物，其中所述干旱脅迫條件引起其中所述功能性UPL3蛋白質的表達未受損的對照植物、植 物細胞或植物產品比其中功能性UPL3蛋白質的表達被破壞的植物、植物細胞或植物產品 更早地顯示的干旱脅迫癥狀，例如枯萎癥狀。
18. 其中功能性UPL3蛋白質的表達被破壞的番爺、陸地棉、大豆、小麥屬植物、大麥、燕 麥、高粱、黑麥或甘藍型油菜植物、植物細胞或植物產品，其中所述功能性UPL3蛋白質為如 下蛋白質：當在具有被破壞的內源性UPL3基因的擬南芥T-DNA插入系中表達時，其產生與 其中所述功能性UPL3蛋白質未表達、具有被破壞的內源性UPL3基因的所述擬南芥T-DNA 插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
19. 根據權利要求18所述的番爺、陸地棉、大豆、小麥屬植物、大麥、燕麥、高粱、黑麥或 甘藍型油菜植物、植物細胞或植物產品，包含被破壞的內源性UPL3基因。
【文檔編號】C12N15/82GK104204207SQ201380009842
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年2月18日 優先權日:2012年2月17日
【發明者】安妮·德斯萊特斯·梅斯, 瑪麗克·海倫娜·阿德里安娜·范·赫爾滕, 希塔爾·阿尼爾庫馬爾·迪克西特, 埃韋特-賈恩·布盧姆, 杰斯·大衛·蒙克沃爾德, 馬修·維塔比萊·迪萊奧, 馬丁·德·福斯 申請人:凱金公司