一種植物抗旱相關蛋白TaRBP2及其編碼基因和應用的制作方法

一種植物抗旱相關蛋白TaRBP2及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種植物抗旱相關蛋白TaRBP2及其編碼基因和應用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本發明的抗旱相關蛋白及其編碼基因對改良、增強擬南芥抗逆性，提高產量、加速抗逆分子育種進程，以及有效節省水資源具有十分重要的理論和實際意義。
【專利說明】-種植物抗旱相關蛋白TaRBP2及其編碼基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種植物抗旱相關蛋白TaRBP2及 其編碼基因和應用。

【背景技術】
[0002] 小麥作為我國重要的糧食作物之一，在國民經濟中占有非常重要的地位。然而，每 年因干旱、鹽堿等逆境脅迫條件對我國小麥造成的減產約800億公斤，嚴重影響著小麥的 產量和品質，制約著我國小麥糧食安全。隨著現代分子生物學的發展，利用基因工程技術從 分子水平上深入研究植物與非生物逆境之間的關系，揭示植物對逆境脅迫信號傳導及基因 表達調控分子機理，為培育作物抗逆新種質提供了理論基礎。
[0003] 真核生物基因表達是一個被高度調控的過程，其主要涉及到三方面：轉錄、轉錄后 及翻譯后。基因表達調控首先就是在轉錄水平，主要是一些轉錄因子參與調節在各種內外 環境刺激下特定基因RNA的合成。另外，就是在蛋白質水平的翻譯后調控，如激酶磷酸化、 泛素連接酶等被公認為能在時空上控制細胞內功能蛋白的產生。然而，對于介于上述兩方 面之間的轉錄后調控的認識還特別少。近幾年，通過研究低等真核生物如酵母、克氏錐蟲 等越來越多的發現表明：轉錄后調控RNA的作用因子為一系列RNA結合蛋白（RNA-Binding Proteins, RBPs)〇
[0004] RBPs在mRNA存在的各個主要環節中都發揮著重要作用，如mRNA的剪接、RNA轉 運、RNA穩定性與講解、細胞內定位、翻譯調控、多腺苷化作用及序列編輯等。在細胞核內 RBP結合在mRNA前體（Pre-mRNA)上調節促進內含子的剪切及拼接形成成熟的mRNA ;RBP還 能調節成熟mRNA從細胞核轉運到細胞質；RBP能調節mRNA識別定位目標，如mRNA識別定位 線粒體；RBP還參與調控mRNA的穩定性，調節mRNA的退化；在調控mRNA的翻譯過程中RBP 也發揮重要作用。在這些復雜過程中RNA結合蛋白通過與RNA相互作用形成核糖核蛋白復 合體（Ribonucleoprotein Complex),直接或間接地參與了這些過程。RNA結合蛋白種類很 多，估計占細胞編碼蛋白的6-8%，但迄今為止只有為數不多的幾種RBP，如HuR、AUFl、TTP、 TlAl及CUGBP2等被證實可特異參與mRNA拼接、穩定性、翻譯和其他層面的基因調控。
[0005] RBP具體參與細胞內外調控信號共同作用來調節mRNA形成的各個環節是非常復 雜的(如圖1-2)。例如RBP家族成員之一的sam68,介導細胞外信號作用下RNA的選擇性剪 接，如佛波酯處理的T細胞中⑶44拼接改變。SAM68的RNA結合活性通過磷酸化和調控其 與其它蛋白的相互作用來調節，如佛波酯處理的T細胞刺激RAS/MAP激酶通路，激活ERK磷 酸化Sam68,誘導CD44選擇性剪接。Sam68除調節轉錄后基因表達的作用外，還與轉錄因子 如CBP相互作用來調節基因表達。Sam68的KH結構域出現在細胞有絲分裂間期的Gl向S 過渡以刺激阻止有絲分裂。
[0006] RBPs基因家族在植物生長發育等多種生理活動中發揮重要的調控作用，其作用于 基因表達調控過程的轉錄后調控，這類基因控制生成的RBPs與相關的RNA相互作用形成 核糖核蛋白復合體（Ribonuc leoprote in Complex, RNP Comp lex),從而直接或間接地參與 mRNA的代謝調控[8~]。眾多的RBPs氨基酸序列有一定的同源性，目前已經發現許多RNA結 合結構域（RNA-binding domain，RBD)，包括 RNA 識別基序（RNA Recognition Motif，RRM)、 KH 結構域、鋅指結構（Zine finger)、RGG box、DEAD/DEAH box、Pumilio/FBF(PUF)、雙鏈 RNA 結構域（double-stranded RNA bindingdomain, dsRBD)、富含精氨酸基序（Arginine-rich motif)、Sm-protein模體等[11]。這些結構域各自具有特定的保守序列及不同的功能，一些 RBP含有1個或者多個相同結構域拷貝，而另外一些RBP則含有2個或者更多不同的結構 域。
[0007] 對RBP各種模體/結構域研究得較清楚的是RRM，也稱為RNP motif [12_15]。RRM基 序是空間上反向平行的P折疊和a螺旋形成的三明治結構，約由90個氨基酸組成，中間 有兩段保守序列，定義為RNPl和RNP2。RNPl有8個保守的氨基酸殘基，RNP2有6個保守 的氨基酸殘基，同時RNPl和RNP2位于P折疊的中間，分別為0 3和￠/1' RRM基序中的 3 -折疊創造了一個平的、外露的RNA結合表面，第二個和第三個0 -折疊組成了帶正電荷 的平臺邊緣[12，13]。KH結構域的交聯和保守序列為RNA連接提供了一個潛在的位于兩個螺 旋之間環中心的表面 [17]。鋅指結構域中位于DNA大凹槽內的螺旋在DNA連接中起主導作 用，但在RNA連接作用方面研究較少 [18]。RGG box結構域在揭開RNA二級結構時起作用[4]。
[0008] 富含甘氨酸RNA結合蛋白（GR-RBP)至少在氨基端含有一個典型的RRM結構域， 同時在羧基端富含長度可變的甘氨酸序列。GR-RBPs是植物中豐度較高的蛋白，植物中 GR-RBPs基因最早在玉米中被克隆，隨后相繼在擬南芥、煙草、大麥等多種植物中被克隆得 至IJ。研究表明，這種蛋白參與了植物對多種逆境條件的反應調節，如冷害、干旱、水澇、傷 害、鹽壓、外源脫落酸（AB A)或水楊酸（SA)處理等[19,29]。在眾多植物中研究較多、較深入的 是擬南芥的GRBPs。遺傳學和生理學方面的數據提供了清楚的證據表明GRRBPs在植物抗逆 反應中起重要作用。研究表明擬南芥中的GRRBP1、GRRBP2、GRRBP3、GRRBP4、GRRBP7、GRRBP8 基因表達量在低溫條件下顯著增加。干旱、鹽分壓力也會引起GRRBP1、GRRBP4和GRRBP7轉 錄產物不同程度地增加。與低溫條件下GRRBP2表達量增加相對應，擬南芥GRRBP2突變株 低溫條件下與野生型相比表現出發芽、幼苗生長延遲的現象；而過量表達GRRBP2植株發芽 時間提早，幼苗生長更好，而且對凍害表現出更強的耐受力 [25]。
[0009] GR-RBPs基因家族參與植物激素、生理節奏、冷凍、機械傷害、干旱等抗逆調控[19]。 早在1992年Sturm從胡蘿卜中克隆分離出編碼受傷口誘導富含甘氨酸蛋白的cDNA，分析 證明在受到機械傷害過程中富含甘氨酸蛋白參與異質核RNA的生物合成和特定mRNA成熟 反應 [2°]。Dunn等發現大麥中1個GR-RBP參與低溫脅迫調控，還控制mRNA的穩定性；同 時，通過實驗證明其在體外還能磷酸化 [21]。研究還發現高粱中1個編碼GR-RBP的基因受 到鹽和ABA (Abscisic Acid,脫落酸）誘導表現出上調控[22]。Nakaminami等通過實驗證明 小麥中一種冷激結構域蛋白WCSPl與單鏈DNA/RNA結合行為的必須條件是具有富含甘氨酸 區域，而富含甘氨酸與這個蛋白的熱穩定性沒有必然的關系 [23]。Sahi等研究表明水稻幼 苗中0sGR-RBP4基因能調控多種非生物脅迫，0sGR-RBP4為核蛋白，其主體主要定位在細胞 質中，可能結合并穩定應力誘導的轉錄過程 [24]。同時，Kim等研究證明水稻中OsGR-RBPl、 0sGR-RBP4和0sGR-RBP6都有使冷敏感大腸桿菌突變體BX04在低溫環境存活的能力；并 且OsGR-RBPl、0sGR-RBP4能夠保護冷敏感擬南芥AtGR-RBP7突變植株在寒冷和冰凍條件 下的生長缺陷 [25]。Chen等研究發現煙草中四種GR-RBPs分別命名為NtRGP-la，NtRGP-lb， NtRGP-2, NtRGP-3,其中 NtRGP-2 與 NtRGP-3 與擬南芥中 AtGR-RBP 基因接近，NtRGP-Ia 和 NtRGP-Ib與禾本科中GR-RBP基因接近；同時，四種NtRGPs特別是NtRGP-Ia和NtRGP-3受 到水、創傷、嚴寒和高溫等處理的強烈誘導，受PEG、干旱和水楊酸處理較弱誘導，不受ABA 處理影響 [26]。Kim等研究表明擬南芥AtGR-RBP7在寒冷脅迫環境中涉及mRNA從細胞核轉 出到細胞質；同時，AtGR-RBP7還影響擬南芥在高鹽、脫水脅迫條件下的生長和抗逆性，使 植株具有抗凍性，這些調控過程都是通過在保衛細胞中調節氣孔開閉來完成 [27]。景潤春等 實驗發現RRM RNA結合蛋白基因家族參與了細胞核與細胞質的相互作用，同時，細胞質雄 性不育性的形成與育性恢復均與細胞質內線粒體基因組變異與轉錄后調控有關 [28]。董霞 等研究表明富含甘氨酸的RNA結合蛋白GRPs基因可作為煙草水楊酸代謝途徑中的一個標 記基因研究其途徑對逆境的應答 [29]。
[0010] 綜上所述，GR-RBPs蛋白在調節植物的逆境反應，提高植物的抗逆性中起著至關重 要的作用，對抗逆育種和農業生產會產生巨大推動作用和經濟效益。因此，利用抗逆相關 RBP蛋白基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要應用前景。


【發明內容】

[0011] 本發明的目的是提供一種植物抗旱相關蛋白TaRBP2。
[0012] 本發明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱相關蛋TaRBP2的基因。
[0013] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0014] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的轉基因細胞系。
[0015] 本發明的另一目的提供上述植物抗旱相關蛋白TaRBP2的應用。
[0016] 本發明所提供的抗旱、耐鹽相關蛋白TaRBP2,來源于小麥品種京花9,其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 本發明的蛋白由232個氨基酸殘基組成。自SEQ ID NO. 1的氨基末端第31-73位 氨基酸殘基是RRM結合域，自SEQ ID NO. 1的第154-185位氨基酸殘基為絲氨酸/蘇氨酸 結合域。
[0018] SEQ ID NO. 1
[0019]

【權利要求】
1. 一種植物抗旱相關蛋白TaRBP2,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種植物抗旱相關基因 TaRBP2,其特征在于，編碼權利要求1所述的植物抗旱相關 蛋白 TaRBP2。
3. 如權利要求2所述的植物抗旱相關基因 TaRBP2,其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 包含權利要求2或3所述植物抗旱相關基因 TaRBP2的重組載體。
5. 包含權利要求2或3所述植物抗旱相關基因 TaRBP2的轉基因細胞系。
6. 權利要求1所述植物抗旱相關蛋白TaRBP2提高植物抗寒性的應用。
7. 權利要求2或3所述植物抗旱相關基因 TaRBP2的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK104292318SQ201410117687
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年3月27日 優先權日:2014年3月27日
【發明者】高世慶, 趙昌平, 唐益苗, 楊濤 申請人:北京市農林科學院