具有轉半乳糖基化活性的多肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及多肽，具體來說具有轉半乳糖基化活性的多肽和編碼它們的核酸，以及它們在例如乳制品中的用途。
【專利說明】具有轉半乳糖基化活性的多肽 發明領域
[0001] 本發明涉及多肽，具體來說具有轉半乳糖基化活性的多肽和編碼它們的核酸，以 及它們在例如乳制品中的用途。
[0002] 發明背景
[0003] 半乳寡糖（GOS)是在人和動物中的非消化性糖，包含通過糖苷鍵連接的兩個或更 多個半乳糖分子，通常多至九個。GOS還可包括一個或多個葡萄糖分子。GOS的一種有益效 應是它們通過選擇性刺激如細菌的有益結腸微生物增殖而作為益生元化合物起作用以使 消費者得到生理益處的能力。建立的健康效應已對GOS作為各種類型食物的食物成分產生 日益增長的興趣。
[0004] 酶P -半乳糖苷酶（EC 3. 2. 1. 23)通常將乳糖水解成單糖D-葡萄糖和D-半乳糖。 在@ -半乳糖苷酶的正常酶反應中，該酶水解乳糖并且瞬時結合半乳糖單糖于半乳糖-酶 復合物中，該復合物將半乳糖轉移至水的羥基，導致D-半乳糖和D-葡萄糖釋出。然而，在高 乳糖濃度下，一些P _半乳糖苷酶在稱為轉半乳糖基化的過程中能夠將半乳糖轉移至D-半 乳糖或D-葡萄糖的羥基，由此產生半乳寡糖。也在高乳糖濃度下，一些￠-半乳糖苷酶能 夠將半乳糖轉移至乳糖或更高級寡糖的羥基。
[0005] 雙歧桿菌屬是在用于發酵多種乳制品的乳品業中一種最常用的細菌培養物類型。 此外，攝入含有雙歧桿菌屬的制品具有促進健康的效應。這種效應不僅通過腸內容物較低 的PH來實現，而且通過雙歧桿菌屬在個體中繁殖腸菌群的能力來實現，所述個體已具有它 們的通過例如攝取抗生素而擾亂的腸菌群。此外，雙歧桿菌屬具有超過可能有害的腸微生 物的潛力。
[0006] 已知半乳寡糖增強雙歧桿菌屬的生長。這種效應可能通過雙歧桿菌屬利用半乳寡 糖作為碳源的獨特能力來實現。此外，半乳寡糖的飲食補充劑被認為是具有多種長期疾病 保護作用。例如，已顯示半乳寡糖攝取對于大鼠中的結直腸癌的發展具有高度保護性。因 此，對開發便宜且有效的用于生產半乳寡糖的方法有很大關注，所述半乳寡糖在工業中用 于改善飲食補充劑和乳制品。
[0007] 來自兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum)DSM20215的具有約580個氨基酸 (BIF3-d3)截短的胞外乳糖酶已被描述為在含有溶于水中的乳糖的溶液中的轉半乳糖基化 酶（Jorgensen 等人（2001)，Appl. Microbiol. Biotechnol.，57 :647-652)。WO 01/90317 還 將截短變體（0LGA347)描述為轉半乳糖基化酶并且在WO 2012/010597中0LGA347顯示出 將半乳糖部分轉移至D-巖藻糖、N-乙酰基-半乳糖胺和木糖。
[0008] 在WO 2009/071539中，與BIF3-d3比較，差異截短的片段在奶中測試時被描述為 產生有效水解和非常低的GOS產量。
[0009] 上文所述的兩歧雙歧桿菌乳糖酶具有以下缺點：需要如10% (w/w)以上的高乳糖 濃度以便生產GOS或需要高剩余的另一受體分子以產生雜寡糖。此外，已描述的分子主要 具有P _半乳糖基化酶（水解酶）活性。
[0010] 仍需要開發在具有低乳糖底物水平的應用中如在奶中產生GOS方面有效的酶。
[0011] 發明概述
[0012] 本發明的實施方案目的是提供以下多肽：其具有轉半乳糖基化與水解活性的有用 比率且因此當與乳糖一起甚至在低乳糖水平下如在奶基產品中溫育時為GOS的高效生產 者。本發明的實施方案另一目的是提供在乳制品中原位生產半乳寡糖（GOS)的方法。本發 明的實施方案的另一目的是提供用于開發更廉價且更有效的用于生產在工業中使用的半 乳寡糖（GOS)的方法的方法。本發明的實施方案的另一目的是提供以下多肽：其對進一步 截短如通過當在適合的有機體如枯草芽孢桿菌（例如枯草芽孢桿菌株BG3594)中生產時的 蛋白質降解是穩定的。本發明的實施方案的又一目的是提供對在最終配制后的貯藏期間的 進一步截短是穩定的多肽。
[0013] 本發明人已令人驚奇地發現，本文公開的多肽為半乳寡糖的高效生產者，例如當 在含乳糖組合物如奶中溫育時原位生產，其中它們將乳糖有效轉化至G0S，產生較低量的游 離乳糖。乳制品或其它可食的產品中半乳寡糖的存在具有增強有益微生物株（益生菌）如 促進健康的雙歧桿菌屬在產品本身中和/或在消費該產品的人或動物中的生長的優勢。
[0014] 一方面，本文公開了具有轉半乳糖基化活性的多肽，其包含與SEQ ID NO: 1具有至 少90%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述多肽當為枯草芽孢桿菌株BG3594中編碼 所述多肽的核酸序列的表達產物時，為展現出轉半乳糖基化活性的所述核酸序列的唯一多 肽表達產物。
[0015] 一方面，本文公開了具有轉半乳糖基化活性的多肽，選自由以下組成的組：
[0016] a.包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述 多肽由至多980個氨基酸殘基組成，
[0017] b.包含與SEQ ID N0:2具有至少97%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述 多肽由至多975個氨基酸殘基組成，
[0018] c.包含與SEQ ID N0:3具有至少96. 5%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所 述多肽由至多1300個氨基酸殘基組成，
[0019] d.由在至少低嚴格條件下與以下雜交的多核苷酸編碼的多肽：i)SEQ ID N0:9、 10、11、12或13中包含的編碼SEQ ID N0:l、2、3、4或5的多肽的核酸序列；或ii)i)的互 補鏈，
[0020] e.由下述多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與編碼SEQ ID NO: 1、2、3、4或 5的多肽的核苷酸序列或者SEQ ID N0:9、10、ll、12或13中包含的編碼成熟多肽的核苷酸 序列具有至少70%同一性的核苷酸序列，和
[0021] f.包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入和/或保 守性取代的多肽。
[0022] 在另一方面，本文公開了具有轉半乳糖基化活性的多肽，選自由以下組成的組：
[0023] a.包含與SEQ ID N0:3具有至少96. 5%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所 述多肽由至多1300個氨基酸殘基組成，
[0024] b.包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述 多肽由至多980個氨基酸殘基組成，
[0025] c.由在至少低嚴格條件下與以下雜交的多核苷酸編碼的多肽：i)SEQ ID N0:9、 10、11、12或13中包含的編碼SEQ ID N0:l、2、3、4或5的多肽的核酸序列；或ii)i)的互 補鏈，
[0026] d.由下述多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與編碼SEQ ID NO: 1、2、3、4或 5的多肽的核苷酸序列或者SEQ ID N0:9、10、ll、12或13中包含的編碼成熟多肽的核苷酸 序列具有至少70%同一性的核苷酸序列，和
[0027] e.包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入和/或保 守性取代的多肽。
[0028] -方面，本文公開了為SEQ ID N0:22的C-末端截短的片段的多肽，所述多肽具有 轉半乳糖基化活性并且對進一步截短如通過當在適合的有機體如枯草芽孢桿菌（例如枯 草芽孢桿菌株BG3594)中生產時的蛋白質降解是穩定的和/或對在最終配制后的貯藏期間 的進一步截短是穩定的。
[0029] -方面，本文公開了包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列 的多肽，其中所述多肽由至多980個氨基酸殘基組成。
[0030] 一方面，提供了本文公開的包含與SEQ ID N0:2具有至少97%序列同一性的氨基 酸序列的多肽，其中所述多肽由至多975個氨基酸殘基組成。
[0031] 一方面，本文公開了包含與SEQ ID N0:3具有至少96. 5%序列同一性的氨基酸序 列的多肽，其中所述多肽由至多1300個氨基酸殘基組成。
[0032] -方面，本文公開了能夠編碼如本文所述的多肽的核酸。
[0033] -方面，本文公開了包含如本文所述的核酸或能夠表達如本文所述的多肽的表達 載體和/或質粒。
[0034] 一方面，本文公開了能夠表達如本文所述的多肽的細胞。
[0035] -方面，本文公開了表達多肽的方法，所述方法包括獲得如本文所述的細胞和表 達來自所述細胞的多肽，以及任選地純化所述多肽。
[0036] -方面，本文公開了包含如本文所述的多肽的組合物，優選食品組合物，更優選乳 制品。
[0037] -方面，本文公開了用于通過用如本文所述的多肽處理包含乳糖的奶基底物而生 產食品如乳制品的方法。
[0038] -方面，本文公開了通過用如本文所述的多肽處理包含乳糖的底物而獲得的半乳 寡糖或其組合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1示出用于在枯草芽孢桿菌中重組表達的BIF_1326變體的質粒圖譜。
[0040] 圖2示出展示用使用NaCl梯度洗脫的HyperQ柱純化的截短變體的SDS-PAGE。
[0041] 圖3示出轉半乳糖基化活性的比率。比率被計算為存在受體的Abs420除以不存 在受體的Abs420的比率乘以100的比率。處于或低于指數100的變體僅僅為水解變體，而 以上的水平反映相對轉半乳糖基化活性。
[0042] 圖4示出所選變體在30°C的酸奶基質中3小時的半乳寡糖（GOS)產生功效。在該 實例中，GOS為處于和高于DP3的累積量寡糖。
[0043] 圖5示出展示所表達的來自表2的不同變體和檢測出的降解片段的SDS-PAGE凝 膠。下圖示出降解條帶的放大和鑒定。
[0044] 序列表
[0045] SEQ ID NO: 1(在本文也被稱為（BIF_917))為SEQ ID NO: 22的887個氨基酸截短 的片段。
[0046] SEQ ID NO: 2 (在本文也被稱為（BIF_995))為SEQ ID NO: 22的965個氨基酸截短 的片段。
[0047] SEQ ID NO: 3 (在本文也被稱為（BIF_1068))為SEQ ID NO: 22的1038個氨基酸截 短的片段。
[0048] SEQ ID NO: 4 (在本文也被稱為172))為SEQ ID NO: 22的1142個氨基酸截 短的片段。
[0049] SEQ ID NO: 5 (在本文也被稱為（BIF_1241))為SEQ ID NO: 22的1211個氨基酸截 短的片段。
[0050] SEQ ID NO: 6 (在本文也被稱為（BIF_1326))為SEQ ID NO: 22的1296個氨基酸截 短的片段。
[0051] SEQ ID NO:7為兩歧雙歧桿菌糖苷水解酶催化核心。
[0052] SEQ ID N0:8為編碼來自兩歧雙歧桿菌DSM20215的胞外乳糖酶的核苷酸序列。
[0053] SEQ ID N0:9為編碼BIF_917的核苷酸序列。
[0054] SEQ ID NO: 10為編碼BIF_995的核苷酸序列。
[0055] SEQ ID NO: 11為編碼BIF 1068的核苷酸序列。
[0056] SEQ ID NO: 12為編碼BIF_1172的核苷酸序列。
[0057] SEQ ID NO: 13為編碼BIF_1241的核苷酸序列。
[0058] SEQ ID勵：14為編碼8正_1326核苷酸的序列。
[0059] SEQ ID NO: 15為用于產生上述BIF變體的正向引物。
[0060] SEQ ID N0:16 為 BIF917 的反向引物。
[0061] SEQ ID N0:17 為 BIF995 的反向引物。
[0062] SEQ ID N0:18 為 BIF1068 的反向引物。
[0063] SEQ ID NO: 19 為 BIF1241 的反向引物。
[0064] SEQ ID N0:20 為 BIF1326 的反向引物。
[0065] SEQ ID N0:21 為 BIF1478 的反向引物。
[0066] SEQ ID NO: 22為來自兩歧雙歧桿菌DSM20215的胞外乳糖酶。
[0067] SEQ ID N0:23為來自兩歧雙歧桿菌DSM20215的胞外乳糖酶的信號序列。
[0068] 本發明的詳細公開
[0069] 定義
[0070] 根據該詳細描述，下列縮寫和定義適用。應注意到，如本文所使用，單數形式〃一 (a)〃、〃一（an) 〃和〃該（the) 〃包括復數指示物，除非上下文另有明確指出。因此，例如提 及〃多肽〃包括多個此類多肽，并且提及〃制劑〃包括提及本領域技術人員已知的一種或 多種制劑及其等效物等等。
[0071] 除非另有定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人 員通常理解的含義相同的含義。下面提供了下列術語。
[0072] 〃轉半乳糖基化酶〃意指除了別的之外，能夠將半乳糖轉移至D-半乳糖或D-葡 萄糖的羥基、由此生成半乳寡糖的酶。一方面，轉半乳糖基化酶通過酶在乳糖上的反應來鑒 定，其中在任何給定時間所產生的半乳糖的量少于產生的葡萄糖的量。
[0073] 在本發明上下文中，術語〃轉半乳糖基化活性〃意指轉移半乳糖部分至除水之外 的分子。活性可被測量為反應期間在任何給定時間產生的[葡萄糖]-[半乳糖]或通過在 反應期間的任何給定時間產生的GOS的直接定量來測量。該測量可以用數種方法如通過實 施例中所示的HPLC方法進行。當比較轉半乳糖基化活性的測量結果時，它們已在給定的起 始乳糖濃度下進行，如例如3、4、5、6、7、8、9或10% (w/w)。
[0074] 在本發明上下文中，術語〃 P -半乳糖苷酶活性〃意指酶水解P -半乳糖苷例如乳 糖成單糖、葡萄糖和半乳糖的能力。
[0075] 在計算轉半乳糖基化活性：P _半乳糖苷酶活性的語境中，P _半乳糖苷酶活性被 測量為在反應期間的任何給定時間產生的[半乳糖]。這種測量可用數種方法如通過實施 例中所示的HPLC方法進行。
[0076] 在本發明上下文中，使用鄰硝基苯酚-P-D-吡喃半乳糖苷（ONPG)如下計算術語 〃轉半乳糖基化活性的比率〃：比率被計算為存在受體的Abs420除以不存在受體的Abs420 的比率乘以100。處于或低于指數100的變體僅僅為水解變體，而以上的水平描繪相對轉半 乳糖基化活性。
[0077] 轉半乳糖基化活性的比率=(Abs420+纟f*=*/Abs42(T纟其中Abs420 +纖 為在反應中包括纖維二糖時使用下面所述方法3在420nm讀取的吸光度并且Abs42〇j 為使用下面所述方法3但在反應中沒有纖維二糖的情況下在420nm讀取的吸光度。上 述方程僅對吸光度在0. 5與I. 0之間的稀釋度有效。
[0078] 一方面，活性在15min反應、30min反應、60min反應、90min反應、120min反應或 ISOmin反應后測量。因此，一方面，例如相對轉半乳糖基化活性在添加酶后15分鐘、如在添 加酶后30分鐘、如在添加酶后60分鐘、如在添加酶后90分鐘、如在添加酶后120分鐘或如 在添加酶后180分鐘測量。
[0079] 在本發明上下文中，術語〃轉半乳糖基化活性：P _半乳糖苷酶活性的比率〃意指 ([葡萄糖]_[半乳糖]/[半乳糖])。
[0080] 在本發明上下文中，術語[葡萄糖]意指通過HPLC測量的以重量％計的葡萄糖濃 度。
[0081] 在本發明上下文中，術語[半乳糖]意指通過HPLC測量的以重量％計的半乳糖濃 度。
[0082] 在本發明上下文中，術語〃乳糖已被轉半乳糖基化〃意指半乳糖分子已共價連接 于乳糖分子如例如共價連接于乳糖分子中的任何游離羥基或通過內部轉半乳糖基化例如 形成異乳糖而產生的游離羥基。
[0083] 在本發明上下文中，在"奶基測定〃（模擬酸奶應用）中測試本文公開的多肽 在半乳寡糖（GOS)生產中的性能的評價。使用酸奶混合物在96孔MTP板中進行體積為 100 的批次實驗，所述酸奶混合物由98, 60% (w/v)新鮮的經巴氏滅菌的低脂奶（Arla Mini-丨IKTClk )和 1.4% (w/v)Nutrilac YQ-5075 乳清成分（Arla)組成。為了完全水合 Nutrilac YQ-5075,將混合物在攪拌下放置20h，之后加入20mM磷酸鈉（NaPhosphate) (pH 6.5)以確保6. 5的pH。使用單純的或含有各種補充劑如另外的乳糖、巖藻糖、麥芽糖、木 糖或鹽的這種酸奶基質。將90 iU酸奶與IOiU純化的酶或粗酵素混合，用膠帶密封并在 43°C溫育3小時。用IOOiil 10% Na2CO3終止反應。樣品儲存于-20°C。通過HPLC進行 半乳寡糖（GOS)、乳糖、葡萄糖和半乳糖的定量。在Dionex ICS 3000上進行樣品的分析。 IC參數如下：流動相：150mM NaOH,流速：等度，0, 25ml/min，柱：Carbopac PAl，柱溫：RT，注 入體積：10y L，檢測器：PAD，積分：手動，樣品制備：100倍稀釋于Milli-Q水（0, Iml樣品 +9, 9ml水）中以及通過0. 45 y m注射濾器過濾，定量：以標準品的峰面積百分比計的峰面 積。GOS糖楽（Vivanal GOS, Friesland Campina)用作GOS定量的標準品。這種評價的結 果示于圖4中，且于實施例2中進一步描述。
[0084] 在本發明上下文中，術語〃多肽是凍干的〃意指已通過在適當的壓力凍干多肽的 液體且凍干適當時間以除去水而獲得所述多肽。
[0085] 在本發明上下文中，術語〃多肽在溶液中〃涉及可溶于溶劑中而未從溶液中沉淀 出的多肽。用于該目的溶劑包括多肽可產生的任何環境，如水性緩沖液或鹽溶液、發酵液、 或表達宿主的細胞質。
[0086] 在本發明上下文中，術語〃穩定劑〃意指用于穩定多肽的任何穩定劑，例如，多元 醇如例如，甘油或丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物（例如，芳族硼酸酯）。一方 面，穩定劑為甘油。
[0087] 在本發明上下文中，術語〃碳水化合物底物〃意指具有通式Cm(H2O)n的有機化合 物，即，僅由碳、氫和氧（后兩者為2:1原子比率）組成，如二糖。
[0088] 在本發明上下文中，術語〃二糖〃是通過稱為經由脫水反應形成的糖苷鍵的共價 鍵結合在一起的兩個單糖單位，所述脫水反應導致損失一個單糖的氫原子和另一個單糖的 羥基。未經修飾的二糖的化學式為C12H22011。一方面，二糖為乳果糖、海藻糖、鼠李糖、麥 芽糖、蔗糖、乳糖、巖藻糖或纖維二糖。另一方面，二糖為乳糖。
[0089] 術語〃分離的〃意指多肽至少基本上不含至少一種該序列在自然界中與其天然 締合且存在于自然界中的其它組分。一方面，如本文所使用的"分離的多肽"是指為至少 30%純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90%純和至少95%純的多肽，如由 SDS-PAGE 確定。
[0090] 術語〃基本上純的多肽〃在本文意指多肽制劑，其含有按重量計至多10 %、優選至 多8%、更優選至多6%、更優選至多5%、更優選至多4%、至多3%、甚至更優選至多2%、 最優選至多1%、甚至最優選至多〇. 5%的天然與其締合的其它多肽材料。因此，優選的是 基本上純的多肽為按重量計至少92%純、優選至少94%純、更優選至少95%純、更優選至 少96 %純、更優選至少96 %純、更優選至少97 %純、更優選至少98 %純、甚至更優選至少 99%、最優選至少99. 5%純、且甚至最優選100%純的存在于制劑中的總多肽材料。本文公 開的多肽優選呈基本上純的形式。具體來說，優選多肽呈〃基本上純的形式〃，即多肽制劑 基本上不含天然與其締合的其它多肽材料。這可以例如，通過借助于熟知的重組方法或通 過經典純化方法制備多肽來實現。在本文，術語〃基本上純的多肽〃與術語〃分離的多肽 〃和〃分離形式的多肽〃同義。
[0091] 術語〃純化的〃或〃純的〃意指給定組分以高水平狀態存在-例如至少約51 %純 (如至少51 %純）、或至少約75 %純（如至少75 %純）、或至少約80 %純（如至少80 %純）、 或至少約90 %純（如至少90 %純）、或至少約95 %純（如至少95 %純）、或至少約98 %純 (如至少98%純）。組分合意地為存在于組合物中的主要活性組分。
[0092] 關于本發明的術語〃微生物〃包括可包含根據本發明的核苷酸序列或編碼如本文 所定義的具有特定性質的多肽的核苷酸序列和/或由其獲得的產物的任何"微生物"。在 本發明上下文中，〃微生物"可以包括能夠發酵奶基質的任何細菌或真菌。
[0093] 關于本發明的術語〃宿主細胞〃包括以下任何細胞，其包含編碼如本文所定義的 具有特定性質的多肽的核苷酸序列或如上所述并且用于生產如本文所定義的具有特定性 質的多肽的表達載體。一方面，生產為重組生產。
[0094] 在本發明的上下文中，術語〃奶〃應被理解為獲自任何哺乳動物如奶牛、綿羊、山 羊、水牛或駱駝的乳汁分泌物。在本發明上下文中，術語"奶基底物"意指任何生奶和/或 加工奶的材料或源自奶成分的材料。有用的奶基底物包括但不限于任何奶或奶樣產物的溶 液/混懸液，包含乳糖、如全脂或低脂肪奶、脫脂奶、酪乳、重構奶粉、煉乳、干奶粉的溶液、 UHT奶、乳清、乳清滲透物、酸乳清、或乳脂。優選地，奶基底物為奶或脫脂奶粉的水性溶液。 奶基底物可以比生奶更濃縮。在一個實施方案中，奶基底物具有至少〇. 2、優選至少0. 3、至 少0. 4、至少0. 5、至少0. 6或最優選至少0. 7的蛋白質與乳糖的比率。根據本領域已知方 法，奶基底物可被均質化和/或經巴氏滅菌。
[0095] 如本文所使用的〃均質化〃意指充分混合以獲得可溶懸浮液或乳液。其可以進行 以使將奶脂肪破碎成較小的大小，從而其不再與奶分離。這可通過在高壓迫使奶經過小孔 來實現。
[0096] 如本文所使用的〃巴氏滅菌〃意指在奶基底物中減少或消除活生物體如微生物的 存在。優選，通過將指定溫度保持指定的時段實現巴氏滅菌法。指定溫度通常通過加熱來 達到。可以選擇溫度和持續時間以便殺死或滅活某些細菌，如有害細菌，和/或以滅活奶中 的酶。隨后可以進行快速冷卻步驟。在本發明的上下文中，"食品"或"食品組合物"可 以為適用于動物或人消耗的任何可食的食品或飼料產品。
[0097] 在本發明的上下文中，〃乳制品〃可以為任何食品，其中主要成分之一為奶基。優 選地，主要成分為奶基。更優選，主要成分為奶基底物，其已用具有轉半乳糖基化活性的酶 處理。
[0098] 在本發明上下文中，〃主要成分之一 〃意指具有構成超過20%、優選超過30%或 超過40%的乳制品總干物質的干物質的成分，而〃主要成分〃意指具有構成超過50%、優 選超過60%或超過70%的乳制品總干物質的干物質的成分。
[0099] 在本發明上下文中，〃經發酵的乳制品〃應被理解為任何乳制品，其中任何類型的 發酵形成生產工藝的部分。經發酵的乳制品的實例為產品如酸奶、酪乳、鮮奶油、奶渣和鮮 乳酪。經發酵的乳制品的另一實例為奶酪。經發酵的乳制品可通過本領域已知的任何方法 來生產。
[0100] 術語〃發酵〃意指通過微生物如起子培養物的作用使糖轉化為醇或酸。一方面， 發酵包含乳糖至乳酸的轉化。
[0101] 在本發明上下文中，〃微生物〃可以包括能夠發酵奶基質的任何細菌或真菌。
[0102] 在本發明上下文中，術語〃Pfam結構域〃意指在蛋白質序列內的基于多個序列比 對和隱蔽馬爾可夫基序（Hidden Markov Motifs)的存在被鑒定為Pfam-A或Pfam-B的區 域(〃The Pfam protein families database" ：R.D.Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J. E. Pollington, 0. L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E. L. Sonnhammer, S. R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research(2010)Database Issue 38:D211-222.)。作為 Pfam 結構域的例子，可以提及 Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_ hydro (PFOO7O3)、GlycoJiydro 2C (PF〇2836)和細菌 Ig 樣結構域（第 4 組）（PR)7532)。
[0103] 如本文所使用，〃對應于位置的位置〃意指在特定查詢多肽與參照多肽之間進行 如本文所述的比對。參照多肽中對應于特定位置的位置于是被鑒定為比對中具有最高序列 同一性的對應氨基酸。
[0104] 〃變體〃是指多肽或核酸。術語〃變體〃可以與術語〃突變體〃交換使用。變體 包括分別在氨基酸或核苷酸序列中的一個或多個位置處的插入、取代、轉化、截短和/或倒 置。短語〃變體多肽〃、〃多肽變體〃、〃多肽〃、〃變體〃和〃變體酶〃意指具有氨基酸序列 的多肽/蛋白質，所述氨基酸序列具有或包含選定氨基酸序列（如SEQ ID NO: 1、2、3、4或 5)或相較于該選定氨基酸序列被修飾。
[0105] 如本文所使用，〃參照酶"、〃參照序列"、〃參照多肽〃意指任何變體多肽所基于 的酶和多肽，例如SEQ ID NO: 1、2、3、4或5。〃參照核酸〃意指編碼參照多肽的核酸序列。
[0106] 如本文所使用，術語〃參照序列〃和〃主題序列〃可互換使用。
[0107] 如本文所使用，"查詢序列〃意指外源序列，其與參照序列比對以便觀察其是否落 入本發明的范圍之內。因此，此類查詢序列可以為例如現有技術序列或第三方序列。
[0108] 如本文所使用，術語"序列"可以是指多肽序列或核酸序列，取決于上下文。
[0109] 如本文所使用，術語〃多肽序列〃和〃氨基酸序列〃可互換使用。
[0110] 〃變體〃的信號序列可以是相同的或可以與將分泌多肽的野生型芽孢桿菌屬信號 肽或任何信號序列的信號序列不同。變體可被表示為含有異源性多肽的融合蛋白。例如， 變體可包含另一蛋白的信號肽或被設計為有助于鑒定或純化所表達的融合蛋白的序列，如 His-Tag 序列。
[0111] 為了描述預期由本公開涵蓋的各種變體，將采用下列命名以便參考。當取代包括 數字和字母時，例如592P，那么這是指{根據編號系統的位置/被取代的氨基酸}。因此， 例如，在位置592處氨基酸至脯氨酸的取代被命名為592P。當取代包括字母、數字和字母 時，例如D592P，那么這是指{原始氨基酸/根據編號系統的位置/被取代的氨基酸}。
[0112] 因此，例如，在位置592處丙氨酸被脯氨酸的取代被命名為A592P。
[0113] 當兩個或更多個取代在特定位置處可能時，這將由連續字母命名，其可任選地被 被斜線符號〃/〃分開，例如G303ED或G303E/D。
[0114] 參考例如SEQ ID NO: 1、2、3、4或5列出一個或多個位置和取代。例如，可通過將 另一序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一個比對以發現具有最高百分比同一性的比對， 此后確定哪個氨基酸比對與SEQ ID NO: 1、2、3、4或5中任一個的特定位置的氨基酸一致來 發現另一序列中的等同位置。此類比對以及使用一個序列作為第一參照對于本領域普通技 術人員僅僅是常規的工作。
[0115] 如本文所使用，術語〃表達〃是指基于基因的核酸序列生成多肽的過程。該過程 包括轉錄和翻譯兩者。
[0116] 如本文所使用，〃多肽〃與術語〃氨基酸序列"、〃酶"、〃肽〃和/或〃蛋白〃交 換使用。如本文所使用，"核苷酸序列"或"核酸序列"是指寡核苷酸序列或多核苷酸序 列及變體、同源物、片段及其衍生物。核苷酸序列可以具有基因組、合成或重組來源并且可 以為雙鏈或單鏈，不管表示正義鏈或反義鏈。如本文所使用，術語"核苷酸序列"包括基因 組 DNA、cDNA、合成 DNA 和 RNA。
[0117] 〃同源物〃意指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有某種同一性或〃同源性 〃程度的實體。一方面，主題氨基酸序列為SEQ ID NO: 1、2、3、4或5,并且主題核苷酸序列 優選為 SEQ ID 勵:9、10、11、12或13。
[0118] 〃同源序列〃包括與另一序列具有某個百分比，例如80%、85%、90%、95%、或 99%的序列同一性的多核苷酸或多肽。百分比同一性意指當比對時，堿基或氨基酸殘基的 百分比在比較兩個序列時是相同的。在相較于主題序列而取代、缺失或添加氨基酸時，氨基 酸序列并非相同的。通常關于主題蛋白的成熟序列，即，例如在去除信號序列后測量百分比 序列同一性。通常，同源物將包含與主題氨基酸序列相同的活性位點殘基。同源物還保留 酶活性，盡管同源物可以具有與野生型不同的酶性質。
[0119] 如本文所使用，〃雜交〃包括核酸鏈與互補鏈通過堿基配對而連接的過程，以及如 在聚合酶鏈反應（PCR)技術中進行的擴增的過程。變體核酸可以以單鏈或雙鏈DNA或RNA、 RNA/DNA異源雙鏈體或RNA/DNA共聚物形式存在。如本文所使用，"共聚物〃是指包含核糖 核苷酸和脫氧核糖核苷酸兩者的單個核酸鏈。變體核酸可以被密碼子優化以進一步增加表 達。
[0120] 如本文所使用，通過體外化學或酶合成來生產〃合成〃化合物。其包括但不限于， 利用宿主生物體如酵母細胞宿主或選擇的其他表達宿主的最佳密碼子使用產生的變體核 酸。
[0121] 如本文所使用，〃轉化的細胞〃包括已通過使用重組DNA技術而轉化的細胞（包 括細菌和真菌細胞）。轉化通常通過將一個或多個核苷酸序列插入到細胞中而發生。所插 入的核苷酸序列可以為異源性核苷酸序列，即，將被轉化的對細胞而言為非天然的序列，如 融合蛋白。
[0122] 如本文所使用，〃有效連接〃意指所述組分呈允許它們以它們預期方式起作用的 關系。例如，以在與對照序列相容的條件下實現編碼序列的表達的方式連結有效連接于編 碼序列的調節序列。
[0123] 如本文所使用，術語"片段"在本文被定義為具有從氨基和/或羧基末端缺失的 一個或多個（數個）氨基酸的多肽，其中片段具有活性。
[0124] 一方面，術語〃片段〃在本文被定義為具有一個或多個（數個）從SEQ ID NO: 1、 2、3、4或5的多肽的氨基和/或羧基末端缺失的氨基酸的多肽；其中所述片段具有轉半乳 糖基化活性。
[0125] 如本文所使用的術語〃半乳糖結合結構域樣〃被縮寫為術語"GBD〃且與術語 〃GBD 〃可交換。
[0126] 同一件稈度
[0127] 兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關聯性由參數〃同一性〃描述。
[0128] 在一個實施方案中，查詢序列與參照序列之間的序列同一性的程度通過以下確 定：1)通過使用缺省評分矩陣和缺省空位罰分的任何適合的比對程序來比對兩個序列，2) 鑒定精準匹配的數目，其中精準匹配為比對程序已在比對的給定位置上鑒定兩個比對序列 中相同的氨基酸或核苷酸，和3)用參照序列的長度除以精準匹配的數目。
[0129] 在一個實施方案中，查詢序列與參照序列之間的序列同一性的程度通過以下確 定：1)通過使用缺省評分矩陣和缺省空位罰分的任何適合的比對程序來比對兩個序列，2) 鑒定精準匹配的數目，其中精準匹配為其中比對程序已在比對的給定位置上鑒定兩個比對 序列中相同的氨基酸或核苷酸，3)用兩個序列中最長的一個的長度除以精準匹配的數目。
[0130] 在另一個實施方案中，查詢序列與參照序列之間的序列同一性的程度通過以下確 定：1)通過使用缺省評分矩陣和缺省空位罰分的任何適合的比對程序來比對兩個序列，2) 鑒定精準匹配的數目，其中精準匹配為其中比對程序已在比對的給定位置上鑒定兩個比對 序列中相同的氨基酸或核苷酸，3)用"比對長度"除以精準匹配的數目，其中比對長度為包 括空位和序列的突出部分的整個比對的長度。
[0131] 序列同一性比較可以用肉眼進行，或更通常，借助于容易可得的序列比較程序。這 些商購可得的計算機程序使用復雜的比較算法以比對兩個或更多個最能反映進化事件的 序列，所述進化事件可能已導致兩個或更多個序列之間的差異。因此，這些算法用獎勵相同 或相似氨基酸的比對并且懲罰空位的插入、空位延伸和非相似氨基酸的比對的評分系統操 作。比較算法的評分系統包括：
[0132] i)每次插入空位時分配罰分（空位罰分），
[0133] ii)每次現有空位用額外位置延伸時分配罰分（延伸罰分），
[0134] iii)在比對相同的氨基酸時分配高評分，和
[0135] iv)在比對非相同氨基酸時分配變量評分。
[0136] 大多數比對程序允許修正空位罰分。然而，當使用用于序列比較的此類軟件時優 選使用缺省值。
[0137] 根據也被稱為取代矩陣的評分矩陣分配對于非相同氨基酸的比對所給定的評分。 在取代矩陣中提供的評分反映以下事實：一個氨基酸被另一個氨基酸取代的可能性在進化 期間可變化并且取決于待取代的氨基酸的物理/化學性質。例如，極性氨基酸被另一個極 性氨基酸取代的可能性比被疏水性氨基酸取代高。因此，評分矩陣將為相同的氨基酸分配 最高評分，為非相同但相似的氨基酸分配較低評分，并且為非相同非相似的氨基酸分配甚 至更低的評分。最常用的評分矩陣為PAM矩陣（Dayhoff等人.（1978)，Jones等人（1992))、 BLOSUM 矩陣（Henikoff 和 Henikoff (1992))以及 Gonnet 矩陣（Gonnet 等人.（1992))。
[0138] 適用于進行此類比對的計算機程序包括但不限于Vector NTI (Invitrogen Corp.)和 ClustalV、ClustalW 和 ClustalW2 程序（Higgins DG&Sharp PM (1988) ,Higgins 等人.（1992) ,Thompson等人.（1994) ,Larkin等人?（2007)。對不同比對工具的選擇可得 自www. expasy. org的ExPASy Proteomics服務器。可進行序列比對的軟件的另一實例為 BLAST(基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool))，其可得自國家 生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information)的網頁，這目前 可在 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ 找到并且首先描述于 Altschul 等人（1990) J. Mol. Biol. 215 ;403-410 中。
[0139] 在本發明的一個優選實施方案中，比對程序進行全局比對程序，其在序列的全長 上優化比對。在另一個優選實施方案中，全局比對程序是基于Needleman-Wunsch算法 (Needleman, Saul B. JPWunsch, Christian D. (1970)，〃A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins^, Journal of Molecular Biology 48(3) :443-53)。使用 Needleman-Wunsch 算法進行全局比對的現 行程序的實例為 EMBOSS Needle 和 EMBOSS Stretcher 程序，其均可在 http: //www. ebi. ac.uk/Tools/psa/ 得至丨J。
[0140] EMBOSS Needle進行使用Needleman-Wunsch比對算法的最佳全局序列比對以沿 著兩個序列的全長找出它們的最佳比對（包括空位）。
[0141] EMBOSS Stretcher使用對Needleman-Wunsch算法的修正，其允許全局比對較大 序列。
[0142] 在一個實施方案中，序列通過全局比對程序進行比對并且序列同一性通過鑒定由 程序鑒定的精準匹配的數目除以"比對長度"來計算，其中比對長度為包括空位以及序列 突出部分的整個比對的長度。
[0143] 在另一個實施方案中，全局比對程序使用Needleman-Wunsch算法并且序列同一 性通過鑒定由程序鑒定的精準匹配的數目除以"比對長度"來計算，其中比對長度為包括 空位以及序列突出部分的整個比對的長度。
[0144] 在又一個實施方案中，全局比對程序選自由EMBOSS Needle和EMBOSS stretcher 組成的組并且序列同一性通過鑒定由程序鑒定的精準匹配的數目除以〃比對長度〃來計 算，其中比對長度為包括空位以及序列突出部分的整個比對的長度。
[0145] 一旦軟件已生成比對，就可能計算％相似性和％序列同一性。軟件通常將其作為 序列比較的部分且產生數值結果。
[0146] 在一個實施方案中，優選使用ClustalW軟件用于進行序列比對。優選地，在用于 成對比對的下列參數下進行用ClustalW的比對：
[0147]
【權利要求】
1. 具有轉半乳糖基化活性的多肽，其選自由以下組成的組： a. 包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽 由至多980個氨基酸殘基組成， b. 包含與SEQ ID N0:2具有至少97%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽 由至多975個氨基酸殘基組成， c. 包含與SEQ ID N0:3具有至少96. 5%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多 肽由至多1300個氨基酸殘基組成， d. 由在至少低嚴格條件下與以下核酸序列雜交的多核苷酸編碼的多肽：i)SEQ ID N0:9、10、ll、12或13中包含的編碼SEQ ID N0:l、2、3、4或5的多肽的核酸序列；或ii)i) 的互補鏈， e. 由下述多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與編碼SEQ ID N0:l、2、3、4或5的 多肽的核苷酸序列或者SEQ ID N0:9、10、ll、12或13中包含的編碼成熟多肽的核苷酸序列 具有至少70 %同一,I"生的核苷酸序列，和 f. 包含SEQ ID N0:l、2、3、4或5的一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入和/或保守性 取代的多肽。
2. 根據權利要求1的多肽，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性的氨基酸 序列，其中所述多肽由至多980個氨基酸殘基組成。
3. 根據權利要求1的多肽，其包含與SEQ ID N0:2具有至少97%序列同一性的氨基酸 序列，其中所述多肽由至多975個氨基酸殘基組成。
4. 根據權利要求1的多肽，其包含與SEQ ID N0:3具有至少96. 5%序列同一性的氨基 酸序列，其中所述多肽由至多1300個氨基酸殘基組成。
5. 根據前述權利要求中任一項的多肽，其由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:4的氨基酸序列組成。
6. 根據前述權利要求中任一項的多肽，其由SEQ ID NO: 1、或SEQ ID NO: 2的氨基酸序 列組成。
7. 根據前述權利要求中任一項的多肽，其中所述多肽具有高于100%的轉半乳糖基化 活性的比率。
8. 核酸，其能夠編碼前述權利要求中任一項的多肽。
9. 表達載體，其包含根據權利要求8的核酸、或能夠表達根據權利要求1-7中任一項的 多肽。
10. 細胞，其能夠表達根據權利要求1-7中任一項的多肽。
11. 表達多肽的方法，所述方法包括獲得根據權利要求10的細胞并從所述細胞表達所 述多肽，以及任選地純化所述多肽。
12. 組合物，優選食品組合物，更優選乳制品，其包含如權利要求1-7中任一項所定義 的多肽。
13. 生產食品的方法，該方法通過用如權利要求1-7中任一項所定義的多肽處理包含 乳糖的底物來實現。
14. 根據權利要求13的方法，其用于通過用如權利要求1-7中任一項所定義的多肽處 理包含乳糖的奶基底物來生產乳制品。
15.用于生產半乳寡糖的方法，其包括使如權利要求1-7中任一項的多肽或權利要求 10的細胞與包含乳糖的奶基溶液相接觸。
【文檔編號】C12N9/38GK104334720SQ201380029811
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年6月7日 優先權日:2012年6月8日
【發明者】M·K·拉爾森, J·F·克拉米爾 申請人:杜邦營養生物科學有限公司