一種高催化活性的d-阿洛酮糖 3-差向異構酶的突變體酶及其應用的制作方法
【專利摘要】一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體酶及其應用，屬于酶的基因工程【技術領域】。本發明公開了由來源于梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbolteae）ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構酶（簡稱DPE酶）作為親本，利用基因突變技術，將其68位的酪氨酸Tyr替換為異亮氨酸Ile，獲得單突變體酶Y68I，其催化活性得到提高，具有重要的工業應用價值。
【專利說明】一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發明公開一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體酶及其應用，屬于酶的基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]D-阿洛酮糖3-差向異構酶(DPE酶)屬于D-塔格糖3_差向異構酶(簡稱DTE)家族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構，是生產稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨或與其他酶偶聯合成多種碳水化合物，被廣泛的應用于化學、食品和制藥等領域。DPE酶可分別催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉化，利用D-果糖生產D-阿洛酮糖。
[0003]隨著由過量高能量食物攝入引發的一系列慢性病在世界范圍內的爆發，膳食結構越來越受到人們的關注。新型的蔗糖替代品的開發和研究仍是功能性甜味劑領域具有重要經濟價值和實際意義的當務之急。D-阿洛酮糖是一種稀有糖，具有多種營養和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低熱量的甜味劑。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA認定為GRAS食品，允許用于食品和膳食補充劑中。另外D-阿洛酮糖具有保護胰腺β-胰島細胞，減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在制藥業中有很大的應用前景。
[0004]雖然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但在其在自然界中含量極少且極難獲得。生物法制備D-阿洛酮糖是近年來的一個研究熱點。高效的生物催化劑的開發對工業應用至關重要。因此，開發具有高催化活性的DPE酶對D-阿洛酮糖的生產有重要的意義。本實驗室開發的梭狀芽孢桿菌iClostridium bolteae) DPE酶可以有效促進D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉化(Min Jia, et al.2013, Applied Microbiology and Biotechnology,DOI 10.1007/s00253-013-4924-8)o但為獲得更適合的生物催化劑，通過定點突變的方法，對DPE酶進行分子改造，進一步提高其催化活性和熱穩定性，以期得到酶學性質更適合工業應用的DPE酶。
【發明內容】
[0005]本發明提供一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體酶及其應用，對D-阿洛酮糖的生產有重要的意義。
[0006]本發明的技術方案:一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構酶DPE的突變體酶Y68I，將來源于梭狀芽孢桿菌bolteae) KTCC BAA-613的D-阿洛酮糖
3-差向異構酶進行突變所得的單突變體酶；將原來DPE基因中第68位的酪氨酸Tyr替換為異亮氨酸He，命 名為Y68I。
[0007]與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶Y68I的催化活性獲得提高，與野生菌相比，其尤值降低，左_/尤得到提高。
【權利要求】
1.一種高催化活性的D-阿洛酮糖3-差向異構酶DPE的突變體酶Y68I，其特征在于將來源于梭狀芽孢桿菌(bolteae) ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構酶進行突變所得的單突變體酶；將原來DPE基因中第68位的酪氨酸Tyr替換為異亮氨酸He，命名為Y68I。
2.根據權利要求1所述的DPE的突變體酶Y68I，其特征在于與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶Y68I的催化活性獲得提高，與野生菌相比，其尤值降低，KJKa得到提聞:
Km mMKcst, s'1kcJKm s4 mM'1 野生菌54.4556.101.031 。 Y68I46.0562.741362
3.—種重組表達質粒，其特征在于其中含有權利要求1所述DPE的突變體酶Y68I基因。
4.一種表達宿主，其特征在于其被權利要求3所述的重組表達質粒轉化。
5.權利要求1所述DPE 的突變體酶Y68I的應用，其特征在于在化學、食品和制藥領域中的應用。
【文檔編號】C12N9/90GK103710330SQ201410001913
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】江波, 沐萬孟, 賈敏, 張濤, 黃敏, 周榴明 申請人:江南大學