miR-150抑制劑在制備結直腸癌耐藥逆轉劑上的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種耐藥逆轉劑，更具體地說，涉及一種逆轉結直腸癌治療耐藥性的耐藥逆轉劑。發明提供了miR-150抑制劑在制備結直腸癌耐藥逆轉劑上的應用，尤其是miR-150抑制劑在制備HCT-116系和/或HT-29系結直腸癌細胞耐藥逆轉劑上的應用。
【專利說明】m i R-1 5 O抑制劑在制備結直腸癌耐藥逆轉劑上的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種耐藥逆轉劑，更具體地說，涉及一種逆轉結直腸癌治療耐藥性的耐藥逆轉劑。
【背景技術】
[0002]結直腸癌(Colorectal Cancer, CRC)是世界第三常見的惡性腫瘤。在我國，隨著人民生活水平的不斷提高，飲食習慣的改變以及人口老齡化，結直腸癌發病率快速增長。現有的結直腸癌治療方案除了手術治療，還需要化放療作為輔助的治療手段。但是由于腫瘤對藥物的耐藥性的存在，嚴重影響結直腸癌治療的效果。
[0003]MicroRNA是一類長約18~25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，參與和調控幾乎所有細胞生物學過程，包括時序發育，細胞凋亡，脂肪代謝，神經元發育，細胞分化，細胞增殖等在內的多種生理過程。它通過與靶基因的非編碼區域結合抑制靶基因的表達。據預測，人類基因組中可能存在多達三分之一的蛋白編碼基因受microRNA的調控。在人類多數的腫瘤細胞中都發現microRNA的異常表達，而且在不同的癌癥發生過程中幾乎都伴隨著microRNA的表達改變。50%以上的人類microRNA基因位于腫瘤相關基因區域，如脆性位點，雜合子丟失區、擴增區或是通常的斷裂區。microRNA基因高頻地出現在這些與腫瘤密切相關的易變基因組中，提示著它跟腫瘤發生與發展密切相關。在結直腸癌中，microRNA的異常表達與腫瘤的發生和發展顯著相關，同時某些特定的microRNA作為調節化療敏感性的重要生物分子，參與了結直腸癌化療耐受。最新研究表明microRNA-150 (miR-150)在眾多的腫瘤中的異常表達并在一系列生化過程中扮演的重角色。研究者通過生物信息學方法發現上千個潛在靶基因，并通過進一步的實驗證實c-Myb、MUC4、ZEBl、AKT2、DKCl、EGR2、P2X7和p53是miR-150的直接靶基因。通過分析它們的調控通路以及在細胞的作用，我們推測它們其中某些靶基因與化療`藥物的耐藥性密切相關。如P53蛋白在p53誘導凋亡途徑及抑制細胞的增殖中起關鍵性作用。EGR2在PTEN生長抑制通路中作為腫瘤抑制因子，它通過調控Fas ligand在T細胞的表達水平從而誘導細胞凋亡。另外EGR2在腫瘤細胞的活性也能夠影響依賴P53蛋白誘導凋亡通路的活性。P2X7在caspase-9線粒體誘導凋亡途徑中作用腫瘤抑制因子參與其中。致癌基因c-myb在細胞中被證實能夠增強細胞的增殖及抑制細胞的凋亡。
[0004]目前，miR-150在結直腸癌的研究仍然較為欠缺。發明人前期的研究發現miR-150在結直腸癌臨床病人組織的異常表達與腫瘤耐藥密切相關。然而，由于癌癥的發病機制復雜，不同癌癥亞型的增值和凋亡機制及其調控通路也各異，因此，盡管miR-150的異常表達已被知曉與眾多腫瘤調控通路相關，但是，由于不同腫瘤甚至相同腫瘤不同亞型的凋亡途徑的復雜性，如果將miR-150作為多種不同亞型的癌癥患者調控通路的通用指標，其特異性和準確率均較低，因此，目前對于miR-150在癌癥的耐藥檢測以及耐藥逆轉方面的應用仍非常有限。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種準確率高的針對特定類型結直腸癌患者耐藥性的檢測試劑。
[0006]本發明的另一個目的在于提供一種有效逆轉結直腸癌耐藥性的逆轉劑。
[0007]本發明的進一步目的在于提供一種針對特定類型結直腸癌耐藥性的逆轉劑。
[0008]發明通過以下技術方案實現上述目的:
[0009]首先，在結直腸癌患者耐藥性的檢測試劑方面，本發明所提供的是一種針對HCT-116和/或HT-29系結腸癌的耐藥性檢測試劑——miR-150檢測試劑。
[0010]優選地，本發明提供了一種準確率、靈敏度遠遠高于現有技術的針對HT-29型結腸癌的耐藥性檢測試劑-miR-150檢測試劑。
[0011]盡管此前的研究表明，miR-150在結直腸癌患者中耐藥患者病人的表達水平高于敏感患者。然而，該結果并沒有針對不同類型的癌癥患者作出區分。本發明人將不同類型的癌癥細胞進行區分之后，發現在有些類型(例如SW620)中，耐藥細胞miR-150表達水平對比非耐藥細胞，并沒有非常顯著的提高。而在HCT-116和HT-29中，尤其是在HT-29中，耐藥細胞miR-150表達水平對比非耐藥細胞顯示出非常顯著的提高。
[0012]因此，將miR-150檢測試劑作為HCT-116和/或HT-29系結腸癌的耐藥性檢測試劑，尤其是作為HT-29型結腸癌的耐藥性檢測試劑，準確率和靈敏度將大大提高。
[0013]除此，發明提供了一種有效逆轉結直腸癌耐藥性的逆轉劑——miR-150抑制劑。所述的結直腸癌為高表達miR-150的結直腸癌。
[0014]優選地，發明提供了 miR`-150抑制劑在制備HCT-116系和/或HT-29系結直腸癌細胞耐藥逆轉劑上的應用。尤為優選地，是HT-29系結直腸癌細胞。
[0015]發明人根據前期的研究結果推測miR-150可能通過負調控c-myb、EGR2、P2X7及p53的表達,從而影響化療藥物耐藥性的產生與發展。
[0016]進一步地，發明人發現，在使用細胞周期藥物進行化療時，miR-150在HCT-116和/或HT-29細胞中起到抗凋亡作用。其可能的機理是由于miR-150負調控癌基因c-myb，抑制細胞增殖，而緩慢的細胞增長速度可以讓更少的細胞進入藥物起作用的DNA復制期，增加了對藥物的耐藥性，從而逃過了化療。結直腸癌細胞系HCT-116及HT-29過表達miR-150能夠抑制細胞的增殖，導致細胞耐藥性的增加使細胞對藥物的敏感性降低。當存在miR-150抑制劑的情況下，可以消除miR-150的抗凋亡作用，這對耐藥患者的治療來說是尤為重要的。
[0017]所述的miR-150抑制劑可以是常見的任一抑制劑，例如，能夠與miR-150與其靶之間的結合發生相互作用的序列；包含有能夠與miR-150結合的核苷酸序列；包含與成熟miR-150的序列的至少6個核苷酸基本上互補的核苷酸序列；包含與miR-150的種子序列基本上互補的核苷酸序列；包含能夠在生理條件下與成熟miR-150結合的核苷酸序列；能夠降低成熟miR-150在細胞內水平的值機等等。
[0018]優選地，所述的耐藥是由所述藥干擾P53依賴誘導凋亡途徑所引起。優選地，所述的藥指5-氟尿嘧啶(5-FU)類藥物。
[0019]5-氟尿嘧啶作為結直腸癌患者主要化療用藥已經沿用了將近半個世紀，其主要的毒性作用可以從以下這兩方面進行解釋:[0020](I) 5-FU在體內能活化生成5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸后，與胸甘酸合成酶結合，抑制此酶的活性，使脫氧胸甘酶缺乏，DNA復制障礙。(2) 5-FU也可代謝為5-氟尿嘧啶核苷，作為偽代謝物形式摻入到RNA中，影響RNA功能和蛋白質合成。但是由于腫瘤對藥物耐受性的存在，化療耐藥已經成為有效治療結直腸癌病人的主要障礙。
[0021]發明人發現，在結直腸癌耐藥細胞中，miR-150的存在使得5_FU的使用并不能提高細胞的凋亡率。并且，5-FU的使用還會明顯提升miR-150的表達水平，提升的程度與5-FU的濃度相關，這進一步惡化了癌癥細胞的耐藥性。尤其是在HCT-116及HT-29細胞中，這種惡化程度更為突出。因此，在采用5-FU類藥物進行化療時，miR-150抑制劑的存在尤其重要，其將能抑制miR-150的過表達，破壞miR-150的抗凋亡作用，對逆轉耐藥患者的耐藥性起到尤為重要的作用。
[0022]與現有技術相比，本發明的針對特定類型的結直腸癌患者耐藥性的檢測試劑，將對該特定類型的耐藥診斷具有此前無法比擬的準確率和靈敏度。從而為后續的治療方案的合理決策提供了堅實的基礎。
[0023]本發明所針對的特定類型的結直腸癌耐藥性的逆轉劑，將能更有針對性地有效逆轉患者的耐藥性，尤其是在5-FU化療中，該逆轉劑從根本上遏制了 5-FU類藥物所引起的細胞的耐藥機制，逆轉了細胞的耐藥性。在HCT-116及HT-29中，采用miR-150抑制劑作為耐5-FU逆轉劑的有效率分別達到了 30.8%和37.7%。【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1顯示了 miR-150作為耐藥指標在不同結直腸癌細胞中的表達差異，以及miR-150對HCT-116和HT-29細胞耐藥性的影響；
[0025]其中，(a)miR-150 在 Caco-2，HCT-116, HT-29 和 SW620 細胞中的表達水平(*p<0.05); (b)轉染了 RNA模擬物miR-150的HCT-116和HT-29細胞的miR-150的表達水平；(c，d)在一系列 5-FU 濃度下(O μ M，2 μ M，4 μ M，6 μ M，8 μ M，10 μ M，12 μ M)過表達 miR-150的HCT-116和SW620降低5-FU誘導的細胞毒性作用。
[0026]圖2為miR-150過表達對HCT-116和HT-29細胞增殖和凋亡的影響；
[0027](a，b)過表達miR-150抑制HCT-116和HT-29細胞的增殖；(c)過表達miR-150能夠在HCT-116和HT-29細胞中逆轉5-FU誘導的凋亡；(d)過表達miR-150能夠在HCT-116和HT-29中逆轉5-FU誘導的凋亡的量化結果。
[0028]圖3顯示了 5-FU提高了 HCT-116和HT-29細胞中miR-150的表達水平；
[0029](a,b)HCT-116 和 HT-29 在不同濃度 5-FU 的處理下(O μ M, 2 μ M, 4 μ M, 6 μ M, 8 μ M,10 μ Μ) miR-150的表達水平；(c) 5-FU在10 μ M的濃度下提高了 miR-150在HCT-116和HT-29的表達水平，但是對SW480細胞的miR-150的表達沒有影響(*P〈0.05)。
【具體實施方式】
[0030]以下【具體實施方式】是對本發明技術方案的進一步闡釋，而非限制。
[0031]實施例1不同類型結直腸癌細胞系中miR-150表達與耐藥性的關系
[0032]細胞的培養:
[0033]結直腸癌細胞系Caco-2，HCT-116, HT-29和SW620由中山大學胃腸病學研究所保存，Caco-2 用含 10% 胎牛血清(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)的 DMEM(Gibco, China)培養基，HCT-116, HT-29 和 SW620 用含 10% 胎牛血清(Invitrogen，Grand Island, NY, USA)的RPMI1640 (Gibco，China)培養基，置于含5%的二氧化碳、37°C恒溫潮濕的培養箱中培養。
[0034]5-FU暴露試驗:
[0035]將5-FU (Sigma, China)粉劑用DMSO配制成濃度為0.1M的儲存液備用。細胞以
0.25 X IO6個/孔的密度接種于6孔板后培養24小時，加入5-FU使得終濃度分別為2 μ Μ，4 μ Μ，6 μ Μ，8 μ Μ，10 μ Μ，以溶劑DMSO為空白對照，分別培養24、48、72小時。
[0036]miR-150表達水平的檢測:
[0037]按照TRIZOL試劑(Invitrogen，USA)的生產商說明書中的步驟提取細胞總RNA。步驟如下:(1)吸棄培養基，用Iml的PBS沖洗兩次，每孔加入TRIZOL試劑1ml，室溫放置5min ; (2)將細胞裂解液全部轉移到1.5ml的EP管中，加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，室溫下靜置5min, 12，000g,4°C離心15min ; (3)取上層水相轉移到另外一個新的無RNase的離心管內，加入等體積的異丙醇，輕柔混勻，室溫放置IOmin, 12, 000g,4°C離心15min ； (4)棄上清，加入75%乙醇洗滌RNA沉淀，7，500g, 4°C離心5min，棄上清，空氣干燥RNA沉淀lOmin，用 DEPC 水溶解 RNA。用 All-1n-One miRNA qRT-PCR Detection Kit (Gene Copoeia, China)試劑盒進行RT-PCR擴增。所得定量數據由7500software v2.0.6 (Applied Biosystems)導出，每個樣品的threshold cycle (Ct)值代表所測基因的表達水平，由Λ ACt方法計算出來的值代表miR-150與內參基因的差異，最后由方法處理數據，得出數據代表miR-150的表達水平。
[0038]結果如圖1所示。`在HCT-116，HT-29結直腸癌細胞系中，過表達miR-150與腫瘤細胞耐藥性密切相關。發明人的microRNAs基因芯片結果顯示miR-150在結直腸癌患者中耐藥患者病人的表達水平是敏感患者的2.28倍(Dou, R., et al., Mult1-microarrayidentifies lower AQP9expression in adjuvant chemotherapy nonresponders withstage III colorectal cancer.Cancer Lett, 2013.336 (I):p.106-13.)。前期研究顯不不同結直腸癌細胞系對5-FU的化療敏感度不同，由IC50 (半數抑制濃度)得到它們的耐藥關系從小到大為Caco-2，HCT-116, HT-29和SW620。為了進一步探討miR-150與化療耐藥的關系，參照發明人前期研究從各個結直腸癌細胞系所測得的IC50 (半數抑制濃度)，在這四種細胞系中檢測miR-150的表達水平，該實驗中，Caco-2的Λ CT值為參照值，U6為內參。數據顯示(圖1)，
[0039]結果顯示出了前述研究所預期之外的結果。除了 SW620以外，HCT-116&HT_29隨著細胞耐藥性的增加，miR-150的表達水平隨之增加，尤其是對于HT-29，miR-150的表達與耐藥性關聯度遠遠高于其他細胞(圖1)。
[0040]緊接著發明人用microRNA的模擬物miR-150及miR-NC瞬時轉染HCT-116及HT-29，miciORNA模擬物最終濃度為50nM。轉染4_6小時后更換不含抗生素的新鮮完全培養基。為了檢測miR-150的轉染效率，轉染細胞培養3天后提取細胞總RNA進行RT-PCR檢測miR-150的表達水平，結果顯示轉染miR-150的細胞(處理組)的miR-150的表達水平明顯高于對照組(圖lb)。在確定轉染效率后，我們進行5-FU的藥物毒性實驗，將瞬時轉染了microRNA模擬物的HCT-116及HT-29，培養24小時更換濃度為8 μ M的5-FU，培養3天后用WST-1檢測細胞吸光度。試驗結果證實了過表達miR-150的HCT-116及HT-29相比轉染了對照micoRNA模擬物的細胞(miR-NC)更能抵抗5-FU的誘導作用。(圖lc，d)
[0041]可見，在結直腸癌細胞系HCT-116及HT-29中過表達miR-150能夠導致細胞更耐5-FU (圖1)。但這個情況并非對所有結直腸癌細胞系均適用。
[0042]在耐藥性的判斷方面，將不同的結直腸癌細胞系進行區分，將miR-150檢測試劑特定地用作HCT-116或HT-29結直腸癌細胞系耐藥性的檢測試劑，將能獲得大大提高的準確率，分別達78.5%和85.9%ο
[0043]實施例2miR_150在不同類型結直腸癌細胞系中的抗凋亡作用
[0044]miR-150 瞬時轉染 HCT-116 和 HT-29:
[0045]當細胞接種于培養板24小時細胞密度達到50%后，按照生產商說明以脂質體Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA)為載體用 microRNA 的模擬物 miR-150 及 miR-NC 瞬時轉染HCT-116及HT-29，microRNA模擬物最終濃度為50nM。轉染4_6小時后更換不含抗生素的新鮮完全培養基。為了驗證轉染效果，另外設置實驗細胞轉染后三天提取總RNA通過實時定量PCR驗證miR-150過表達效果。
[0046]細胞增殖試驗:
[0047]使用WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Roche Applied Science,USA)進行細胞增殖實驗。即接種于96孔板的細胞轉染后分別培養24、48、72小時，培養基每兩天更換一次，當培養細胞達到設定天數后，快速把10 μ I的WST-1加到孔中，培養30min后，使用酶標儀(BioRad，China)檢測吸光度，直到90min為止，酶標儀檢測設定波長為450nm，參考波長為630nm。
[0048]細胞凋亡試驗:`
[0049]細胞轉染后24小時，更換終濃度為8 μ M的5_FU的完全培養基(不含抗生素)，以DMSO為溶劑對照組，繼續培養48小時后用胰酶消化細胞，用PBS (Phosphate BufferedSaline)重懸細胞3次以完全除去培養基，使用(Annexin V-FITC apoptosis Detectionkit, BD Biosciences, USA)試劑盒進行細胞凋亡實驗。(I)按照I X 106/ml的濃度將沖洗后的細胞用IXBinding Buffer重懸；(2)取100 μ I的細胞懸液于流式檢測管中，再加入5μ I的APC Annexin V和5 μ I的PI混合均勻，溫室避光孵育20min ;(3)按照每50 μ I的細胞體積加入Intrapred試劑I混合均勻，室溫避光孵育15min ； (4)加入400 μ I的IXBinding Buffer重懸，I小時內進行細胞凋亡檢測。數據用流式細胞術分析軟件BDFACSDiva Software v6.1.3 計算。
[0050]統計學分析:
[0051]數據繪圖及分析分別使用Graphpad Prism(version5.0)和 SPSS(versionl8.0)software。所有試驗最少重復兩次,兩樣品獨立T檢驗評價數據統計學意義,設定P〈0.05差異有統計學意義。
[0052]為了研究miR-150在結直腸癌中的作用，我們進行了細胞增殖實驗。我們發現miR-150能夠抑制HCT-116及HT-29細胞的增殖，結果如圖2所示在第五天，HCT-116實驗組的抑制率為63.7%±8.5%，對照組為27.4±14%(圖2a)。HT-29實驗組的抑制率為65.1%±10.9%，對照組為 29.2±9.1%(圖 2b)。
[0053]凋亡逃逸在腫瘤對化療藥物耐受的形成與發展中有重要作用，為此，我們進行細胞凋亡實驗。我們用miR-150與miR-NC轉染HCT-116與HT-29，繼續培養48小時后，用檢測凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率，發現與對照組相比，轉染miR-150的細胞的凋亡率均有所下降，下降幅度分別達到22.3% (HCT-116)和9.6% (HT-29)，miR-150在這里起了抗凋亡的作用(圖2c)，圖2e，2f展示的就是凋亡率的量化分析。為了進一步證實miR-150抗凋亡的作用，轉染后我們用8μ M的5-FU與細胞共培養48小時再檢測其凋亡率，溶劑作為對照。發現加了 5-FU的細胞的凋亡率未見增加或者比對照組的凋亡率更低(圖2d，2f)，因此我們推測這種現象可能與miR-150負調控凋亡誘導因子p53(Zhang, N., X.Wei, and L.Xu, miR-150promotes the proliferation of lung cancercells by targeting P53.FEBS Lett, 2013.587 (15):p.2346-51.)> EGR2 (ffu, Q., etal., MiR-150promotes gastric cancer proliferation by negatively regulating thepro-apoptotic gene EGR2.Biochem Biophys Res Commun, 2010.392(3):p.340-5.)和P2X7(Zhou, L.,et al., MicroRNAs miR_186and miR-150down_regulate expression ofthe pro-apoptotic purinergic P2X7receptor by activation of instability sitesat the3' -untranslated region of the gene that decrease steady-state levels ofthe transcript.J Biol Chem, 2008.283(42):p.28274-86.)抑制凋亡有關。
[0054]綜合上述兩個實施例的結果，采用miR-150抑制劑作為HCT-116及HT-29的耐藥逆轉劑，消除miR-150的凋亡抑制作用，從而逆轉細胞耐藥性(耐5-FU)。發明人采用miR-150抑制劑的逆轉HCT-116及HT-29耐藥性方面的有效率分別達到了 30.8%和37.7%。
[0055]實施例3 5-FU對HCT-116及HT-29中miR-150表達水平的上調作用
[0056]已有研究報道5-FU能夠調控某些microRNA的表達水平，如在結直腸癌中，引起DNA損傷的藥物能夠通過上調P53的表達從而上調miR-34a，miR-16-1, miR-143, miR-145和miR-206的表達水平。同時5-FU也能夠下調MiR_200b，miR-210和miR-224的表達水平。為了探明5-FU對miR-150可能的調控作用，我們用一系列濃度的5-FU處理HCT-116及HT-29檢測miR-150的表達水平。
[0057]實驗結果如圖3所示在HCT-116及HT-29中，5-FU能夠明顯提升miR-150的表達水平(圖3a，3b)。進一步的實驗證明5-FU上調miR-150的表達具有細胞特異性，它能夠顯著提高miR-150在HCT-116和HT-29中的表達水平，但不影響miR-150在SW480的表達水平。
[0058]由圖2和圖3的結果，miR-150可以抑制5_FU誘導的凋亡，而5_FU同時也會提升miR-150的表達，進一步惡化了細胞的耐藥性而阻礙了治療的順利進行，可見，miR-150抑制劑在針對5-FU化療過程中的細胞耐藥逆轉方面具有尤為突出的意義和作用，尤其適用于HCT-116和HT-29系的結直腸癌5-FU耐藥逆轉。
【權利要求】
1.miR-150抑制劑在制備結直腸癌耐藥逆轉劑上的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的結直腸癌為高表達miR-150的結直腸癌。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的結直腸癌為HCT-116系和/或HT-29系O
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的結直腸癌為HT-29系。
5.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的耐藥是由所述藥干擾P53依賴誘導凋亡途徑所引起。
6.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的藥為細胞周期藥物。
7.如權利要求1 所述的應用，其特征在于所述的藥5-FU類藥物。
8.miR-150檢測試劑在制備結直腸癌患者耐藥性檢測試劑中的應用，所述的直腸癌為HCT-116 系和 / 或 HT-29 系。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的直腸癌為HT-29系。
【文檔編號】C12Q1/68GK103721268SQ201410020449
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】楊湘玲, 杜曉陽, 黃蘭蘭, 王曉艷, 王瑞鑫, 董功航, 汪建平, 劉煥亮 申請人:中山大學附屬第六醫院