大豆開花基因GmFT2a啟動子的制作方法
【專利摘要】大豆開花基因GmFT2a啟動子，它涉及大豆開花基因GmFT2a啟動子序列。本發明的目的是提供大豆開花基因GmFT2a啟動子。本發明的大豆開花基因GmFT2a啟動子核苷酸序列如序列表Seq?ID?No：2所示。GmFT2a基因啟動子起開花促進作用，本發明通過大豆遺傳轉化驗證，闡明GmFT2a的啟動子在大豆開花期中起調控開花作用。本發明不但對于揭開大豆開花期和生育期的分子機理具有非常重要的意義，而且也可以利用開發的分子標記進行分子標記輔助育種，加快育種進程，提高育種效率。本發明應用于大豆基因工程領域。
【專利說明】大豆開花基因GmFT2a啟動子
【技術領域】
[0001]本發明涉及大豆開花基因GmFT2a啟動子序列，屬于植物基因工程領域和作物分子育種領域。
【背景技術】
[0002]大豆為人類提供重要的植物蛋白質和油份。在世界范圍內，北至高緯度的北歐瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等廣泛區域內均有大豆栽培，但單個品種或種質資源一般適宜種植的緯度跨度較小，這種區域適應性與大豆光周期和生育期基因或者數量性狀位點(Quantitative Trait Locus, QTL)密切相關。選育生態適應性廣的優良大豆品種是實現高產、優質、高效大豆產業的根本途徑。但常規育種在廣適應品種選育中進展緩慢，利用分子育種手段有望定向調節大豆光周期和生育期，加快廣適應品種的選育。模式植物擬南芥和水稻的研究結果表明，開花素(Fl0rigen，FT蛋白)從葉片轉運到莖尖誘導花的形成(Corbesier 等，2007 ;Tamaki 等,2007)。
[0003]我們從大豆中克隆了 10個FT基因，這10個基因成對的復制在大豆連鎖群上。基因表達分析的結果顯示，在開花誘導條件即短日照條件下，有兩個FT基因(GmFT2a和GmFT5a)在花芽形成期(25~30天左右)，在三出復葉中大量表達，而其他基因表達量極低或者不表達。并且這兩個基因呈現生物鐘規律的基因表達類型，在光照開始4個小時表達強度最高之后逐漸減弱 。在非誘導的長日照條件下，只有一個FT基因(GmFT5a)相對表達，從而導致了在此條件下大豆開花期較晚，生育期延長。利用大豆光敏色素A基因的雙突變體(Harosoy_e3e4)研究則發現,在長日照條件下，Harosoy-e3e4的開花期與其野生型植株在短日照條件下的開花期一致。而且，在雙突變體中，在花芽形成期，GmFT2a和GmFT5a的表達被大量誘導而且呈現與短日照完全相同的生物鐘規律的基因表達。這些研究結果從分子水平上初步揭示了大豆開花期和生育期的分子機理，即(I)在誘導的短日照條件下，有兩個FT基因參與表達導致花期很短，然而在非誘導的長日照條件下，只有一個FT基因參與表達從而導致開花期變長；(2)大豆經過自身進化使光敏色素A基因失活來適應在高緯度區域生存，而這一進化過程又是最終通過調控兩個大豆中主要的FT基因表達來實現的；(3)在長日照條件下，長日照植物擬南芥的光敏色素A基因誘導FT基因的表達，而短日照植物大豆的光敏色素A基因卻抑制FT基因的表達，說明短日照植物含有與長日照植物不同的光周期反應調控機制(Kong等2010)。此外，通過大豆遺傳轉化技術，研究者進一步驗證了GmFT2a具有大豆開花促進功能(Sun等2011)。Jiang等(2013)研究表明大豆光周期敏感性和開花時間與GmFT2a的啟動子多態性密切相關。但是，GmFT2a基因的啟動子如何影響著大豆生育期(開花期及成熟期)是一個非常重要的科學問題，相關研究鮮有報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供大豆開花基因GmFT2a啟動子。
[0005]本發明的大豆開花基因GmFT2a啟動子核苷酸序列如序列表Seq ID No:2所示。[0006]本發明的有益效果:
[0007]本發明是在克隆出大豆開花基因GmFT2a (Kong等2010)的基礎上，進一步對GmFT2a基因的啟動子序列進行深入系統的研究，我們已證實GmFT2a基因具有促進大豆開花的功能，本發明對不同品種中GmFT2a基因的啟動子序列進行了研究，并確定了 GmFT2a的啟動子對大豆生開花期關系密切。
[0008]通過QTL技術分析可知，從大豆品種TK780中獲得的開花基因GmFT2a的啟動子具有序列表中Seq ID No:1的核苷酸序列，從大豆品種H4中獲得的開花基因GmFT2a的啟動子具有序列表中的Seq ID No:2的核苷酸序列，兩者相比，除少數SNP外，如Seq ID No:1所示的序列，在GmFT2a基因上游958bp處有一個42堿基的插入，在1677bp處有一個10堿基的缺失。如Seq ID No: 2所示的序列，GmFT2a基因上游958bp有一個42堿基的缺失，在1677bp處有一個10堿基的插入。通過生物信息學分析，結果表明Seq ID No:1比Seq IDNo:2多出2個順式元件，分別和雙組份信號系統的細胞分裂素信號途徑、花粉的成熟和萌發相關。
[0009]進一步的大豆遺傳轉化實驗表明，轉GmFT2a基因啟動子序列Seq ID No:2的植株比轉對照GmFT2a基因啟動子序列Seq ID No:1的植株早開花，說明GmFT2a基因啟動子序列Seq ID No:2起開花促進作用。
[0010]本發明要解決開花期及成熟期長的問題，提供了大豆開花基因FT啟動子，本發明為分子手段培育廣適應作物品種創造了條件，將在植物的遺傳改良中發揮重要作用，本發明通過大豆遺傳轉化驗證，表明含開花基因GmFT2a啟動子轉基因植株與對照相比，其促進開花的功能明顯增強，闡明GmFT2a的啟動子在大豆開花期中起調控開花作用。
[0011]本研究不但對于揭開大豆開花期和生育期的分子機理具有非常重要的意義，而且同時也可以利用開發的分子標記進行分子標記輔助育種，加快育種進程，提高育種效率，本發明應用于大豆基因工程領域。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為pTFlOL l-GmFT2a_P質粒過表達載體結構示意圖，其中FT2a_P表示GmFT2a的啟動子；
[0013]圖2為未轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因與轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆開花時間圖，其中I為未轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆，2為轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆；
[0014]圖3為未轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆營養生殖狀態圖；
[0015]圖4為轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆開花狀態圖。
【具體實施方式】
[0016]【具體實施方式】一:本實施方式的大豆開花基因GmFT2a啟動子核苷酸序列如序列表 Seq ID No:2 所示。
[0017]本實施方式是在分子水平上首次成功地克隆、驗證大豆開花基因GmFT2a的啟動子的功能。
[0018]本實施方式是在克隆出大豆開花基因GmFT2a (Kong等2010)的基礎上，進一步對GmFT2a基因的啟動子序列進行深入系統的研究，我們已證實GmFT2a基因具有促進大豆開花的功能，本實施方式對不同品種中GmFT2a基因的啟動子序列進行了研究，并確定了GmFT2a的啟動子對大豆生開花期關系密切。
[0019]通過QTL技術分析可知，從大豆品種TK780中獲得的開花基因GmFT2a的啟動子具有序列表中Seq ID No:1的核苷酸序列，從大豆品種H4中獲得的開花基因GmFT2a的啟動子具有序列表中的Seq ID No:2的核苷酸序列，兩者相比，除少數SNP外，如Seq ID No:1所示的序列，在GmFT2a基因上游958bp處有一個42堿基的插入，在1677bp處有一個10堿基的缺失。如Seq ID No: 2所示的序列，GmFT2a基因上游958bp有一個42堿基的缺失，在1677bp處有一個10堿基的插入。通過生物信息學分析，結果表明Seq ID No:1比Seq IDNo:2多出2個順式元件，分別和雙組份信號系統的細胞分裂素信號途徑、花粉的成熟和萌發相關。
[0020]進一步的大豆遺傳轉化實驗表明，轉GmFT2a基因啟動子序列Seq ID No:2的植株比轉對照GmFT2a基因啟動子序列Seq ID No:1的植株早開花，說明GmFT2a基因啟動子序列Seq ID No:2起開花促進作用。
[0021]本實施方式利用PCR方法從大豆中克隆出大豆開花基因GmFT2a的啟動子。
[0022]本實施方式通過大豆遺傳轉化手段，將GmFT2a的啟動子序列Seq ID No:2連著GmFT2a基因在一起轉入大豆品種TK780 (GmFT2a的啟動子序列Seq ID No:1，屬功能缺失型)，能使大豆品種TK780早花10天左右。
[0023]通過以 下試驗驗證本發明的效果:
[0024](I)大豆開花基因GmFT2a啟動子的獲得
[0025]利用SSR標記構建大豆重組自交系H4XTK780的連鎖圖譜，在以elnlRIL群體背景下，定位到了一個QTLs，位于J連鎖群的GmFT2a基因位點。通過對H4和TK780的重測序結果分析表明，兩者間GmFT2a基因cDNA序列沒有差異。分別以大豆品種H4和TK780的葉片為材料，采用CTAB法提取DNA，通過Fl與Rl引物擴增GmFT2a基因的啟動子，PCR反應條件如下:94°C預變性5min, 94°C變性30s, 56°C退火30s, 72°C延伸lmin,共35循環，再72°C延伸90秒，將PCR產物在ABI3130測序儀(ABI公司)上進行測序；
[0026]其中，引物Fl的序列為GCCGATCATGACAGTGCATG ;弓丨物Rl的序列為CTTCCACTAGGCATGGGATA。
[0027]測序結果表明大豆品種TK780中開花基因GmFT2a的啟動子具有序列表中Seq IDNo:1的核苷酸序列，大豆品種H4中開花基因GmFT2a的啟動子具有序列表中的Seq ID No:2的核苷酸序列。
[0028]大豆GmFT2a的啟動子序列Seq ID No:1與GmFT2a的啟動序列Seq ID No:2相t匕，除少數SNP外，前者在GmFT2a基因上游958bp處有一個42堿基的插入，在1677bp處有一個10堿基的缺失，從而改變GmFT2a基因的功能。
[0029](2)大豆開花基因GmFT2a啟動子的功能驗證
[0030]利用F2和R2為引物，以(I)中H4中開花基因GmFT2a的啟動子為模板通過PCR進行5’與3’擴增，PCR反應條件:94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸90秒，共35循環，再72°C延伸lOmin，獲得含有Pst1-XbaI雙酶酶切位點的大豆開花基因GmFT2a的啟動子；將獲得的含有酶切位點的大豆開花基因GmFT2a的啟動子克隆到pTFlOl.1-GmFT質粒中，替換35S啟動子，獲得pTFlOl.l-GmFT2a_P質粒，以大豆品種TK780為材料，利用農桿菌介導法進行遺傳轉化，獲得轉基因大豆，將含有H4型啟動子的轉基因大豆與未轉入H4型GmFT2a的啟動子的大豆在長日照條件下種植，觀察大豆生長及開花狀態。
[0031]其中，pTFlOl.1質粒在2006年《Plant Cell Reports))中刊登的名稱為〃 Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived frommature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation，，的文章中公開，由文章的作者惠贈；大豆品種TK780和H4由北海道大學Abe交警惠贈。
[0032]其中，引物F2的序列為CTGCAGGCCGATCATGACAGTGCATG ;引物R2的序列為TCTAGACTTCCACTAGGCATGGGATA。
[0033]其中pTFlOl.l-GmFT2a_P質粒結構示意圖如圖1所示。
[0034]未轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆營養生殖狀態圖如圖3所示，轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆開花狀態圖如圖4所示，由圖3和圖4可以看出，當轉入H4型GmFT2a的啟動子的大豆開花時，未轉入H4型GmFT2a的啟動子的大豆還沒有開花，表明轉入H4型GmFT2a的啟動子能互補TK780中GmFT2a的啟動子功能缺失，同時也進一步說明GmFT2a的啟動子是此QTL的候選基因。
[0035]未轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因與轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆開花時間圖如圖2所示，其中I為未轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆品種TK780，2為轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆品種TK780，由圖2可以看出，TK780的開花時間約平均33.75天，而轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆品種TK780的開花時間平均為23天，表明轉入Seq IDNo:2啟動子序列連著GmFT2a`基因的大豆開花時間比未轉入Seq ID No:2啟動子序列連著GmFT2a基因的大豆開花時間早10天，從而說明GmFT2a的啟動子在大豆開花中起促進功能，同時也進一步說明GmFT2a的啟動子是此QTL的候選基因。
【權利要求】
1.大豆開花基因GmFT2a啟動子，其特征在于大豆開花基因GmFT2a啟動子核苷酸序列如序列表Seq ID No:2所 示。
【文檔編號】C12N15/113GK103805604SQ201410031873
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】孔凡江, 劉寶輝, 李瑩, 曹東 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所