一種稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記及其方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記，所述SNP位點位于水稻基因組11號染色體第6525745位核苷酸，該位點核苷酸由C突變為T，氨基酸由半胱氨酸（Cys）突變為酪氨酸（Tyr），由引物對SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2從水稻基因組DNA中擴增出來的核苷酸序列，經特異性酶切之后電泳檢測，與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的分子標記。還公開了所述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記PiaSNP的檢測方法及其應用，本發明的Pia功能特異性分子標記以PCR技術為基礎，不僅能區分水稻品種的基因型，而且能夠方便、快捷、直接地實現了目標基因Pia在水稻種質資源以及育種后代中的鑒定，特別是等位基因之間的鑒別，且不受環境以及人為因素的影響。
【專利說明】一種稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記及其方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記及其方法與應用，屬于分子生物學和水稻育種領域。
【背景技術】
[0002]稻痕病是水稻最嚴重的病害之一。由子囊菌Magnaportheoryzae引起的稻痕病是一種世界性的水稻流行性病害，全球每年因稻瘟病水稻產量損失約占總產量的10%-15%，稻瘟病還導致稻米品質下降，每年經濟損失高達50億美元。稻瘟病是我國三大水稻病害之一，每年都有不同程度的發生。近年，在西南、長江中游和東北等稻區嚴重發生，年發病面積330萬-570萬公頃，產量損失達數億公斤，嚴重影響我國水稻生產和糧食安全。防治稻瘟病最有效、最經濟、最根本的控制措施是發掘水稻自身的抗性基因資源，培育和利用持久、高抗品種資源。
[0003]全基因組關聯分析(Genome-wideAssociationStudy, GffAS)是一種對全基因組范圍內的常見遺傳變異(單核苷酸多態性和拷貝數)總體關聯分析的方法，它能夠在全基因組范圍內進行整體研究，能夠一次性對疾病進行輪廓性概覽，適用于復雜疾病的研究。在全基因組層面上，開展大樣本、反復驗證的基因與疾病的關聯研究，可以全面揭示疾病發生、發展與治療相關的遺傳基礎。與圖位克隆法(map-basedcloning)相比,全基因組關聯分析具有以下幾個方面優點:1) GWAS研究不再需要在研究之前構建任何假設；2)可用自然群體，無需一定是遺傳群體，大大縮短了研究年限；3)能夠一次性通過監測成千上萬個SNPsji全基因組范圍內整體研究；4) GWAS研究的精度大大提高，例如由玉米的作圖精度10-30cM(Salvi, 2005)提高到GWAS的精度1500bp (Remington，2001 )。隨著基因組測序技術的提高及測序成本的降低，并結合生物信息學的高度發展，GffAS成為挖掘和剖析水稻抗稻瘟病基因及其相關遺傳機制最有效的方法之一。
[0004]水稻稻瘟病抗性基因按抗性表現程度可以分為完全抗性和部分抗性兩種類型。前者由1-3對主效顯性基因控制，也有隱性基因、不完全顯性基因、修飾基因和各種基因互作的控制方式；表現為病菌不能侵染或不能繁殖產生孢子，具有小種特異性，如已報道的P1-b (Wang 等，1999)、P1-ta (Bryan 等，2000)、Pi_9 (Qu 等，2006)。而后者一般由多個微效基因控制，具有一效多因特征；表現為病葉面積較小，病斑數目較少以及病斑大小較小，具有部分抗性的水稻在一定程度上能控制病原菌的無限繁殖，避免毀滅性病害發生，無小種特異性，具有持久抗性，如p1-21 (Fukuoka等，2001)。截至2013年8月，已至少報道68個抗稻瘟病位點共83個主效基因，其中P1-a、Pbl、P1-56等24個基因已被成功克隆，主要集中分布在11號、12號及6號染色體上，而在3號染色體至今尚未報道存在與稻瘟病抗性相關位點(www.ricedata.cn/gene)。
【發明內容】
[0005]為解決上述現有技術的不足，本發明的首要目的在于提供一種稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記。
[0006]本發明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記PiaSNP的檢測方法。
[0007]本發明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記PiaSNP的應用。
[0008]本發明目的是通過如下技術方案來實現的:[0009]一種稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記，所述SNP位點位于水稻基因組11號染色體第6525745位核苷酸(Chrll_6525745)，該位點核苷酸由C突變為T，氨基酸由半胱氨酸(Cys)突變為酪氨酸(Tyr)，由引物對SEQ ID N0.1和SEQIDN0.2從水稻基因組DNA中擴增出來的核苷酸序列，經特異性酶切之后電泳檢測，與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的分子標記。
[0010]所述引物對的核苷酸序列如下所示:
[0011]SEQ ID N0.1:5’ -GCTCCTTCTTCAATTACTGGGAATGGTCGA-3’ ；
[0012]SEQ ID N0.2:5’ -CTTGCAGTATCTCAAACTGG-3’。
[0013]所述的特異性酶切為SalI酶切。
[0014]所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標記PiaSNP的檢測方法，通過805，158個高質量的SNP對IN366群體進行全基因組關聯分析，獲得能與稻瘟病抗性基因Pia緊密連鎖的I處SNP位點(Chrll_6525745)，再通過引物設計分別得到SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，對水稻DNA擴增得到稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標記PiaSNP。
[0015]所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特異性分子標記PiaSNP的方法，包含以下步驟:
[0016](I)通過常規PCR法擴增，獲得稻瘟病抗性基因Pia的I個等位基因與I個感病等位基因序列；
[0017](2)利用多序列比對軟件工具(如MegAlign)，將步驟(1)所獲得的序列翻譯成蛋白質序列后進行比對，得到稻瘟病抗性基因Pia所特異的I處單堿基差異，該差異位于該基因的外顯子，最終導致功能特異性氨基酸的改變；
[0018](3)根據步驟(2)所得到的I處SNP，設計出引物對SEQ ID N0.1和SEQIDN0.2 ;并用該引物對對不同水稻的總DNA進行PCR擴增反應，所得擴增產物經特異性酶切之后電泳檢測驗證，獲得與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的核苷酸片段；
[0019](4)對步驟(3)所獲得的分子標記在不同的水稻品種中進行驗證，從而確定稻瘟病抗性基因Pia的功能特異性分子標記PiaSNP。步驟(3)中在上述SNP處設計帶有錯配堿基的功能特異性上游引物PiaSNP-F，如SEQ ID N0.1所示；在上述SNP下游100~200bp處設計功能特異性下游引物PiaSNP-RJn SEQ ID N0.2所示；
[0020]進一步的，所述PiaSNP的PCR擴增反應體系如下:
[0021]
【權利要求】
1.一種稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記，其特征在于:所述SNP位點位于水稻基因組11號染色體第6525745位核苷酸(Chrll_6525745)，該位點核苷酸由C突變為T，氨基酸由半胱氨酸(Cys)突變為酪氨酸(Tyr)，由引物對SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2從水稻基因組DNA中擴增出來的核苷酸序列，經特異性酶切之后電泳檢測，從而確定稻瘟病抗性基因Pia的功能特異性分子標記PiaSNP。
2.如權利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如下所示:
SEQ ID N0.1:5’ -GCTCCTTCTTCAATTACTGGGAATGGTCGA-3’ ；
SEQ ID N0.2:5’ -CTTGCAGTATCTCAAACTGG-3’。
3.如權利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記，其特征在于:所述的特異性酶切為SalI酶切。
4.根據權利要求2或3任一項所述的稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記檢測方法，其特征在于:使用805，158個高質量的SNP對IN366群體進行全基因組關聯分析，獲得能與稻瘟病抗性基因Pia緊密連鎖的I處SNP位點(Chrll_6525745)，再通過引物設計分別得到SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，對水稻DNA擴增得到Pia功能特異性分子標記PiaSNP。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，具體包含以下步驟: (1)通過常規PCR法擴增，獲得稻瘟病抗性基因Pia的I個等位基因與I個感病等位基因序列； (2)利用多序列比對軟件工具，將步驟(1)所獲得的序列翻譯成蛋白質序列后進行比對，得到稻瘟病抗性基因Pia所特異的I處單堿基差異，該差異位于該基因的外顯子； (3)根據步驟(2)所得到的序列差異及dCAPS標記設計原理，設計出引物對SEQIDN0.1和SEQ ID N0.2 ;并用該引物對對不同水稻的總DNA進行PCR擴增反應，所得擴增產物經特異性酶切之后電泳檢測驗證，獲得與稻瘟病抗性基因Pia呈特異性帶型的核苷酸片段； (4)對步驟(3)所獲得的分子標記在不同的水稻品種中進行驗證，從而確定稻瘟病抗性基因Pia的功能特異性分子標記PiaSNP。
6.如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于:所述PiaSNP的PCR擴增反應體系如下:
7.如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于:PCR結束后，利用限制性內切酶SalI對所獲得的PCR產物進行酶切，反應體系如下:
8.權利要求1所述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子標記PiaSNP的應用，包括對水稻種質資源的篩選和鑒定，以及作為分子標記輔助育種方面的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789306SQ201410033115
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】魏興華, 王彩紅, 徐群, 馮躍, 袁筱萍 申請人:中國水稻研究所