一種齊口裂腹魚cGnRH Ⅱ基因克隆的方法
【專利摘要】本發明涉及一種齊口裂腹魚cGnRH?II基因克隆的方法，具體包括以下步驟：(1)腦組織RNA的提取：總RNA提取采用TIANGEN試劑；(2)RACE擴增，具體包括：(2a)cDNA第一鏈合成；(2b)PCR擴增；(2c)RACE引物設計；(2d)5’-RACE；(2e)3’-RACE；(3)目的片段進行分離和回收；(4)感受態細胞制備；(5)連接和轉化；(6)質粒DNA抽提。本發明技術提供了一種高效、方便的獲取齊口裂腹魚chicken?GnRHII基因的全長序列的方法，填補了該基因在齊口裂腹魚上的空白，為進一步研究齊口裂腹魚的該基因奠定了基礎。
【專利說明】—種齊口裂腹魚cGnRH II基因克隆的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種齊口裂腹魚cGnRH II基因克隆的方法，屬于基因克隆【技術領域】。【背景技術】
[0002]促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasinghormone, GnRH),又稱促黃體素釋放激素(lutein1-zing hormone-releasing hormone, LHRH),是由下丘腦分泌的十肽激素，是動物生殖過程中最重要的激素之一。GnRH脈沖式釋放刺激垂體促性腺激素(GTH)的合成和分泌從而調節性激素的分泌，是性腺軸系的原動力，對性腺還可能具有直接作用。GnRH已被證明是下丘腦一垂體一性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadalaxis, HPG)的關鍵信號分子。GnRH家族中最保守的是chicken GnRH II (chicken-11-typeGonadotropin-releasing hormone, cGnRH II)，它隨同其他分子形式的GnRH共同存在于大多數脊椎動物中，存在于所有的有頜類包括人類中。
[0003]近年來，隨著PCR技術的快速興起和成熟，cDNA末端快速擴增技術(RapidAmplification of cDNA Ends, RACE)為簡潔方便的基因克隆發展道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技術由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA末端的方法，又稱為錨定或單邊PCR，一般有兩種RACE方法，分別用于擴增3'端或5'端。5' RACE比3' RACE更具有挑戰性，其特異性較低，產物可能是單一產物、多個產物，甚至是不能分辨的連續條帶。最終質量取決于擴增所使用錨定引物的特異性、目的mRNA5端結構的復雜度和豐度及產物的長度等因素。可利用巢式引物擴增(最多進行三輪巢式擴增)，增加逆轉錄保溫溫度和PCR退火溫度，降低擴增反應中的鎂離子濃度等方法增加5' RACE的特異性。SMART反轉錄酶法RACE技術比較而言是中最為成熟的。但是對于不同的試驗對象仍然需要一定的改進。DTT是一種蛋白質保護劑， 此外還有解開mRNA鏈5'端高級結構的作用。RACE技術的成功應用已經顯示出它是一種高效簡便的技術手段。它除了在獲得全長cDNA序列方面的應用外，隨著生物學各項技術的交叉利用，對RACE技術的改良和發展，伴隨著優化條件下PCR擴增效率和忠實度的提高以及PCR產物克隆技術的進步，相信RACE技術在基因克隆以及RNA剪接、基因家族和基因表達變化等多項領域。
[0004]目前，所采用的技術有:RT_PCR克隆:是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)以及分子克隆相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細胞基因中，然后用質粒PCR產物測序。該技術缺點在于:克隆未知基因的方法比如通過篩選文庫等有個共同的弊病，即實驗操作繁瑣，周期較長、工作量繁重，且不易得到全長cDNA序列。另外，也有采用分段PCR克隆法:將目的基因分成幾段來分別克隆，然后做亞克隆測序拼接。成本高，工作量大耗時，一個基因分成幾段就需要做幾次克隆，然后再做序列接拼。該技術缺點為:克隆未知基因的方法比如通過篩選文庫等有個共同的弊病，即實驗操作繁瑣，周期較長、工作量繁重，且不易得到全長cDNA序列。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種高效、方便的獲取齊口裂腹魚ch1cken GnRH 11基因的全長序列的方法，填補了該基因在齊口裂腹魚上的空白，為進一步研究齊口裂腹魚的該基因奠定了基礎。
[0006]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。
[0007]一種齊口裂腹魚cGnRH 11基因克隆的方法，具體包括以下步驟:
[0008](1)腦組織RNA的提取--總RNA提取采用TaKaRa試劑，具體步驟如下:
[0009](1a)從_80°C冰箱中取出凍存組織，取1OOmg左右，放入高溫滅菌處理過的研缽中，加入液氮，磨成粉末；
[0010](1b)向1.5ml離心管于加入1ml預冷的Tr1zol裂解液，迅速把組織粉末放置于離心管中，劇烈振蕩5m1n，使其充分溶解；
[0011](1c)VC條件下12000rpm離心1Om1n,然后吸取上清的Tr1zol裂解液至新的1.5ml離心管中,冰上放置5分鐘；
[0012](1d)吸取0.2ml氯仿加入離心管中，激烈振蕩15s，室溫靜置5m1n，4°C條件下13000rpm離心lOm1n，將上層水相轉移至新的EP管中；
[0013](1e)加入0.5ml異丙醇，顛倒數次混勻，冰上沉淀10分鐘；
[0014](lf)4°C條件下12000rpm離心10分鐘，在管底可見膠狀RNA沉淀，小心地棄上清；
[0015](1g)加入冷的75%乙醇1ml，混勻，4°C條件下7500rpm離心5分棄上清；傾斜離心管，用槍頭吸去管壁的液體，待RNA略干后，加入20~50 μ 1DEPC水溶解，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C凍存備用。
[0016]⑵RACE 擴增:
[0017](2a) cDNA 第一鏈合成:使用 Pr1merScr1pt RT reagent K1t W1th gDNAEraser (TaKaRa)逆轉錄試劑盒，具體步驟為:齊口裂腹魚全腦總RNAl μ g，50 μ mol/L Ol1go (dT)弓丨物 1yL, 5 XM-MLV bufferlO μ L, 10mmol/L dNTP2.5 μ L, 40U/μ L RNase1nh1b1tor0.5μ L,200U/y L RTase M-MLV1 μ L ;于 42°C反應 lh。反應結束后置于 _20°C保存。
[0018](2b)PCR擴增:采用Prem1er5和DNAMAN軟件，根據GenBank中公布鯉科魚類ch1cken GnRH 11的保守序列的一致性，分布設計四對引物，在B1o-Rad PCR擴增儀上進行，變性溫度、退火溫度和延伸溫度根據引物的Tm值和目的片段大小而定；PCR擴增得到部分cDNA片段序列，序列由華大集團有限公司測序。
[0019](2c) RACE引物設計:根據已獲得ch1cken GnRH 11保守序列分別設計設計RACE的巢式引物:3’上游特異性引物1，3’上游特異性引物2 ;5’下游特異性引物1，5’下游特異性引物。
[0020](2d)5’ -RACE:按照試劑盒的操作流程進行，首先進行反轉錄反應，制備5f -RACE-Ready cDNA，其具體流程為:
[0021]①取0.5μ 1 Eppendorf 管，加入 1 μ 1全腦總 RNA、1 μ 15' -CDS 引物、1 μ 1 SMART1 ol1go引物(10 μ mol/L)和2 μ 1滅菌水，輕輕混勻，于70°C加熱2m1n，置冰上冷卻2m1n ;
[0022]②離心使液體沉底.加入2μ 15X第1鏈緩沖液、1μ 1 DTT(20mmol/L)、1 μ 1dNTP (1Ommo 1/L)和1μ 1 MMLV逆轉錄酶(200U/μ 1)，隨后用小槍頭輕輕吹打混勻；[0023]③離心使液體沉底.反轉錄于42°C 1.5h，加入100 μ I滅菌水，于70°C加熱2min終止反轉錄反應，凍存于_20°C備用；
[0024]④隨后,采用通用引物混合物(universal primer mix, UPM)和下游特異性引物I進行“ Touchdown” PCR擴增，向50 μ I PCR反應管中加入以下試劑:34.5μ I去離子水、5 μ 110XAdvantage2PCR 緩沖液、I μ I dNTP (10mmol/L)、I μ 150 X Advantage2PolymeraseMix,5 μ I UPM(IOX) U μ I P121 (10 μ mol/L)和 2.5 μ 15’-RACE-Ready cDNA，振蕩混勻、離心沉底，覆以2滴石臘油，在Bio-Rad PCR分析儀啟動PCR反應；
[0025]⑤將前一步獲得的反應液為模板，以下游特異性引物2和UPM為引物，用Ex Taq酶PCR，反應條件如下:94°C變性5min ;94°C反應30s，72°C反應3min，進行5次循環；94°C反應30s，70°C反應30s，72°C反應2min，進行5次循環；94°C反應30s，68°C反應30s，72°C反應2min，進行25次循環；然后72°C延伸IOmin ；
[0026]⑥用1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收所需條帶，克隆至pMD-19T載體上，進行測序。
[0027](2e) 3’ -RACE:3’ RACE第一鏈cDNA合成反應50 μ L體系包括:齊口裂腹魚全腦總RNAly g, 50 μ mol/L Oligo (dT)引物 I μ L，5 XM-MLV bufferlO μ L, 10mmol/LdNTP2.5 μ L,40U/y L RNase Inhibitor0.5 μ L, 200U/μ L RTase M-MLVl μ L ;于 42°C 反應 Ih ;降落和巢式PCR方法體系同5’ -RACE。
[0028](3)目的片段的分離和回收，具體步驟如下:
[0029](3a)從電泳板上切割含目的DNA片段的凝膠塊；
`[0030](3b)凝膠稱重后并將其放入1.5mL管中，將其適當切小，加速溶解；每IOOmg凝膠加入 400 μ LSolution SN。
[0031](3c)凝膠溶解:55~60°C,保溫5_10min,每2min混勻一下,使凝膠溶解,膠完全融化后每 400 μ L Solution SN 中加入 Solution BlOO μ L,混勻；
[0032](3d)將3S柱裝入2mL洗管，將上述混合液轉移至3S柱，室溫放置2min.室溫10000r/min 離心 lmin,穩定 45S ；
[0033](3e)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入700 μ Lffash Solution,室溫 10000r/min 離心 lmin。
[0034](3f)重復步驟3e —次。
[0035](3g)取下3S柱，倒掉收集管中廢液，將3S柱放入同一收集管中，室溫10000r/min離心2min。
[0036](3h)將3S柱放入新的離心管中，在3S柱子膜中央加30 μ L ddH20，不加蓋室溫放置 2min。
[0037](3i)蓋上離心管，室溫10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，-20°C保存備用。
[0038](4)感受態細胞制備，具體步驟如下:
[0039]用無菌鉬絲直接醮取E.coli DH5a菌株，在LB平板表面劃線，37°C倒置培養過夜；從LB平板上挑取單菌落，接種于3mL LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜；取30μ L培養液接種于3mL LB液體培養基，37°C震蕩培養2.5h，至肉眼能看到微微渾濁；將培養液轉入 1.5mLEppendorf 管，冰浴 IOmin ;4°C、4000r/minX5min,棄上清;用預冷的 75mmol/L CaCl2750 μ L輕輕懸浮細胞，冰浴30min ;4 °C、4000r/min X 4min,棄上清；加入預冷的75mmol/L CaCl2(內含甘油終濃度為15 %) 200 μ L，輕輕懸浮，冰浴至少4h，即成感受態細胞懸液，分裝后-80°C保存。
[0040](5)連接和轉化:
[0041](5a)連接:在微離心管中依次加入PCR純化產物4 μ L (約0.4 μ g)，載體PMD19-T1 μ L, Solution 15 μ L ;16°C水浴反應 12h。
[0042](5b)轉化:取200 μ L ToplO感受態細胞懸液，加入連接溶液10 μ L，輕輕混勻，冰上放置30min ;42°C水浴1.5min，冰上放置2.5min，加入lmL37°C預熱的液體培養基，37°C預表達lh，使細胞恢復正常生長狀態；4°C，3500r/minX5min，將菌液濃縮至200μ?，分別加入10 μ L的IPTG和X-gal，輕輕懸浮細胞，將菌液均勻涂布在含Amp+的LB固體培養基上，37°C正面放置30min，待菌液完全被培養基吸收后，37 1:倒置培養過夜。
[0043](6)質粒DNA抽提:挑取轉化后的白色單菌落，分別接種于2mL含適當Amp+抗生素的LB培養基，37°C下225r/min振蕩培養過夜，具體按照質粒小量快速抽提試劑盒的說明書進行操作，使用BamH I和Sal I酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽性克隆菌液大約500mL進行測序。.[0044]該發明的有益效果在于:本發明技術提供了一種高效、方便的獲取齊口裂腹魚chicken GnRH II基因的全長序列的方法，填補了該基因在齊口裂腹魚上的空白，為進一步研究齊口裂腹魚的該基因奠定了基礎。 【具體實施方式】
[0045]下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發明。
[0046]實施例
[0047]一種齊口裂腹魚cGnRH II基因克隆的方法，具體包括以下步驟:
[0048](1)腦組織RNA的提取--總RNA提取采用TaKaRa試劑，具體步驟如下:
[0049](1a)從_80°C冰箱中取出凍存組織，取IOOmg左右，放入高溫滅菌處理過的研缽中，加入液氮，磨成粉末；
[0050](1b)向1.5ml離心管于加入Iml預冷的Trizol裂解液，迅速把組織粉末放置于離心管中，劇烈振蕩5min，使其充分溶解；
[0051](1c)VC條件下12000rpm離心IOmin,然后吸取上清的Trizol裂解液至新的
1.5ml離心管中,冰上放置5分鐘；
[0052](1d)吸取0.2ml氯仿加入離心管中，激烈振蕩15s，室溫靜置5min，4°C條件下13000rpm離心lOmin，將上層水相轉移至新的EP管中；
[0053](1e)加入0.5mi異丙醇，顛倒數次混勻，冰上沉淀10分鐘；
[0054](lf)4°C條件下12000rpm離心10分鐘，在管底可見膠狀RNA沉淀，小心地棄上清；
[0055](1g)加入冷的75%乙醇1ml，混勻，4°C條件下7500rpm離心5分棄上清；傾斜離心管，用槍頭吸去管壁的液體，待RNA略干后，加入20~50 μ IDEPC水溶解，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C凍存備用。
[0056](2) RACE 擴增:
[0057](2a) cDNA 第一鏈合成:使用 PrimerScript RT reagent Kit With gDNAEraser (TaKaRa)逆轉錄試劑盒，具體步驟為:齊口裂腹魚全腦總RNAl μ g，50 μ mol/L Oligo (dT)弓丨物 lyL，5XM-MLV bufferlO μ L，IOmmo 1/L dNTP2.5 μ L, 40U/μ L RNaseInhibitor0.5μ L,200U/y L RTase M-MLV1 μ L ;于 42°C反應 lh。反應結束后置于 _20°C保存。
[0058](2b) PCR擴增:采用Premi er5和DNAMAN軟件，根據GenBank中公布鯉科魚類chicken GnRH II的保守序列的一致性，分布設計四對引物，在Bio-Rad PCR擴增儀上進行，變性溫度、退火溫度和延伸溫度根據引物的Tm值和目的片段大小而定；PCR擴增得到部分cDNA片段序列，序列由華大集團有限公司測序。
[0059](2c) RACE引物設計:根據已獲得chicken GnRH II保守序列分別設計設計RACE的巢式引物:3’上游特異性引物1，3’上游特異性引物2 ;5’下游特異性引物1，5’下游特異性引物。
[0060](2d)5’ -RACE:按照試劑盒的操作流程進行，首先進行反轉錄反應，制備 -RACE-Ready cDNA，其具體流程為:
[0061]①取0.5μ I Eppendorf 管，加入 I μ I全腦總 RNA、I μ 15' -CDS 引物、I μ I SMARTI oligo引物(10 μ mol/L)和2 μ I滅菌水，輕輕混勻，于70°C加熱2min，置冰上冷卻2min ;
[0062]②離心使液體沉底.加入2μ 15X第I鏈緩沖液、1μ I DTT(20mmol/L)、I μ IdNTP (IOmmo 1/L)和1μ I MMLV逆轉錄酶(200U/μ I)，隨后用小槍頭輕輕吹打混勻；
[0063]③離心使液體沉底.反轉錄于42°C 1.5h，加入100 μ I滅菌水，于70°C加熱2min終止反轉錄反應，凍存于_20°C備用；
[0064]④隨后,采用通用引物混合物(universal primer mix, UPM)和下游特異性引物I進行“ Touchdown” PCR擴增，向50 μ I PCR反應管中加入以下試劑:34.5μ I去離子水、5 μ 110XAdvantage2PCR 緩沖液、I μ I dNTP (10mmol/L)、I μ 150 X Advantage2PolymeraseMix,5 μ I UPM(IOX)、1 μ I Ρ121 (10 μ mol/L)和2.5 μ 15’-RACE-Ready cDNA，振蕩混勻、離心沉底，覆以2滴石臘油，在Bio-Rad PCR分析儀啟動PCR反應；
[0065]⑤將前一步獲得的反應液為模板，以下游特異性引物2和UPM為引物，用Ex Taq酶PCR，反應條件如下:94°C變性5min ;94°C反應30s，72°C反應3min，進行5次循環；94°C反應30s，70°C反應30s，72°C反應2min，進行5次循環；94°C反應30s，68°C反應30s，72°C反應2min，進行25次循環；然后72°C延伸IOmin ；
[0066]⑥用1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收所需條帶，克隆至pMD-19T載體上，進行測序。
[0067](2e) 3’ -RACE:3’ RACE第一鏈cDNA合成反應50 μ L體系包括:齊口裂腹魚全腦總RNAly g, 50 μ mol/L Oligo (dT)引物 I μ L，5 XM-MLV bufferlO μ L，IOmmo 1/L dNTP2.5 μ L,40U/y L RNase Inhibitor0.5 μ L, 200U/μ L RTase M-MLVl μ L ;于 42°C 反應 Ih ;降落和巢式PCR方法體系同5’ -RACE。
[0068](3)目的片段的分離和回收，具體步驟如下:
[0069](3a)從電泳板上切割含目的DNA片段的凝膠塊；
[0070](3b)凝膠稱重后并將其放入1.5mL管中，將其適當切小，加速溶解；每IOOmg凝膠加入 400 μ LSolution SN。
[0071](3c)凝膠溶解:55~60°C,保溫5_10min,每2min混勻一下,使凝膠溶解,膠完全融化后每 400 μ L Solution SN 中加入 Solution BlOO μ L,混勻；
[0072](3d)將3S柱裝入2mL洗管，將上述混合液轉移至3S柱，室溫放置2min.室溫lOOOOr/min 離心 lmin,穩定 45S ；
[0073](3e)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入700 μ LWash Solution,室溫 10000r/min 離心 lmin。
[0074](3f)重復步驟3e —次。
[0075](3g)取下3S柱，倒掉收集管中廢液，將3S柱放入同一收集管中，室溫10000r/min離心2min。
[0076](3h)將3S柱放入新的離心管中，在3S柱子膜中央加30 μ L ddH20，不加蓋室溫放置 2min。
[0077](3i)蓋上離心管，室溫10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，-20°C保存備用。
[0078](4)感受態細胞制備，具體步驟如下:
[0079]用無菌鉬絲直接醮取E.coli DH5a菌株，在LB平板表面劃線，37°C倒置培養過夜；從LB平板上挑取單菌落，接種于3mL LB液體培養基中，37°C震蕩培養過夜；取30μ L培養液接種于3mL LB液體培養基，37°C震蕩培養2.5h，至肉眼能看到微微渾濁；將培養液轉入 1.5mLEppendorf 管，冰浴 IOmin ;4°C、4000r/minX5min,棄上清；用預冷的 75mmol/L CaCl2750 μ L輕輕懸浮細胞，冰浴30min ;4 °C、4000r/min X 4min,棄上清；加入預冷的75mmol/L CaCl2 (內含甘油終濃度為15 %) 200 μ L，輕輕懸浮，冰浴至少4h，即成感受態細胞懸液，分裝后-80°C保存。
`[0080](5)連接和轉化:
[0081](5a)連接:在微離心管中依次加入PCR純化產物4 μ L (約0.4 μ g)，載體PMD19-T1 μ L, Solution 15 μ L ;16°C水浴反應 12h。
[0082](5b)轉化:取200 μ L ToplO感受態細胞懸液，加入連接溶液10 μ L，輕輕混勻，冰上放置30min ;42°C水浴1.5min，冰上放置2.5min，加入lmL37°C預熱的液體培養基，37°C預表達lh，使細胞恢復正常生長狀態；4°C，3500r/minX5min，將菌液濃縮至200μ?，分別加入10 μ L的IPTG和X-gal，輕輕懸浮細胞，將菌液均勻涂布在含Amp+的LB固體培養基上，37°C正面放置30min，待菌液完全被培養基吸收后，37 1:倒置培養過夜。
[0083](6)質粒DNA抽提:挑取轉化后的白色單菌落，分別接種于2mL含適當Amp+抗生素的LB培養基，37°C下225r/min振蕩培養過夜，具體按照質粒小量快速抽提試劑盒的說明書進行操作，使用BamH I和Sal I酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽性克隆菌液大約500mL進行測序。
[0084]以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種齊口裂腹魚CGnRH II基因克隆的方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)腦組織RNA的提取--總RNA提取采用TaKaRa試劑； (2)RACE擴增，具體包括: (2a) cDNA 第一鏈合成:使用 PrimerScript RT reagent Kit With gDNAEraser (TaKaRa)逆轉錄試劑盒，具體步驟為:齊口裂腹魚全腦總RNAl μ g，50 μ mol/L Oligo(dT)弓丨物 lyL，5XM-MLV buffer 10 μ L，IOmmo 1/L dNTP2.5 μ L, 40U/μ L RNaseInhibitor0.5μ L,200U/y L RTase M-MLV1 μ L ;于 42°C反應 Ih ;反應結束后置于 _20°C保存； (2b)PCR擴增:采用Premier5和DNAMAN軟件，根據GenBank中公布鯉科魚類cGnRH II的保守序列的一致性，分布設計一對引物，在Bio-Rad PCR擴增儀上進行，變性溫度、退火溫度和延伸溫度根據引物的Tm值和目的片段大小而定；PCR擴增得到部分cDNA片段序列予以測序； (2c)RACE引物設計:根據已獲得cGnRH II保守序列分別設計設計RACE的巢式引物:3’上游特異性引物1，3’上游特異性引物2 ;5’下游特異性引物1，5’下游特異性引物； (2d)5’ -RACE:按照試劑盒的操作流程進行，首先進行反轉錄反應，制備5' -RACE-Ready cDNA ； (2e)3，-RACE:3’ RACE第一鏈cDNA合成反應50yL體系包括:齊口裂腹魚全腦總RNAly g,50ymol/L Oligo (dT)引物 I μ L，5 XM-MLV bufferlO μ L, 10mmol/LdNTP2.5 μ L,40υ/μ L RNase Inhibitor0.5 μ L, 200U/μ L RTase M-MLVl μ L ;于 42°C 反應 Ih ;降落和巢式PCR方法體系同5’ -RACE ； (3)目的片段進行分離和回收； (4)感受態細胞制備，具體步驟如下:用無菌鉬絲直接醮取E.coli DH5a菌株，在LB平板表面劃線，37°C倒置培養過夜；從LB平板上挑取單菌落，接種于3mL LB液體培養基中，37 °C震蕩培養過夜；取30μ L培養液接種于3mL LB液體培養基，37 °C震蕩培養2.5h，至肉眼能看到微微渾池；將培養液轉入1.5mL Eppendorf管，冰浴IOmin ；4°C>4000r/minX5min,棄上清；用預冷的75mmol/L CaCl2750 μ L輕輕懸浮細胞，冰浴30min ;4°C、4000r/minX4min，棄上清；加入預冷的75mmol/L CaCl2 (內含甘油終濃度為15% ) 200 μ L，輕輕懸浮，冰浴至少4h，即成感受態細胞懸液，分裝后_80°C保存； (5)連接和轉化: (5a)連接:在微離心管中依次加入？0?純化產物4 4 1^(約0.4 4 8)，載體？1?19-11 μ L，Solution Ι5μ L ;16°C水浴反應 12h ; (5b)轉化:取200 μ L ToplO感受態細胞懸液，加入連接溶液10 μ L，輕輕混勻，冰上放置30min ;42°C水浴1.5min，冰上放置2.5min，加入lmL37°C預熱的液體培養基，37°C預表達lh，使細胞恢復正常生長狀態；4°C，3500r/minX5min,將菌液濃縮至200 μ L，分別加入10 μ L的IPTG和X-gal，輕輕懸浮細胞，將菌液均勻涂布在含Amp+的LB固體培養基上，37°C正面放置30min，待菌液完全被培養基吸收后，37°C倒置培養過夜； (6)質粒DNA抽提:挑取轉化后的白色單菌落，分別接種于2mL含適當Amp+抗生素的LB培養基，37°C下225r/min振蕩培養過夜，具體按照質粒小量快速抽提試劑盒的說明書進行操作，使用BamH I和Sal I酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽性克隆菌液大約500mL進行測序。
2.根據權利要求1所述的齊口裂腹魚cGnRHII基因克隆的方法，其特征在于:所述步驟(I)中腦組織RNA的提取的具體步驟如下: (Ia)從_80°C冰箱中取出凍存組織，取IOOmg左右，放入高溫滅菌處理過的研缽中，加入液氮，磨成粉末； (Ib)向1.5ml離心管于加入Iml預冷的Trizol裂解液，迅速把組織粉末放置于離心管中，劇烈振蕩5min，使其充分溶解； (Ic) 4°C條件下12000rpm離心IOmin,然后吸取上清的Trizol裂解液至新的1.5ml離心管中，冰上放置5分鐘； (Id)吸取0.2ml氯仿加入離心管中，激烈振蕩15s，室溫靜置5min，4 °C條件下13000rpm離心lOmin，將上層水相轉移至新的EP管中； (Ie)加入0.5ml異丙醇，顛倒數次混勻，冰上沉淀10分鐘； (If) 4°C條件下12000rpm離心10分鐘，在管底可見膠狀RNA沉淀，小心地棄上清； (Ig)加入冷的75%乙醇1ml，混勻，4°C條件下7500rpm離心5分棄上清；傾斜離心管，用槍頭吸去管壁的液體，待RNA略干后，加入20~50 μ I DEPC水溶解，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C凍存備用。
3.根據權利要求1所述的齊口裂腹魚cGnRHII基因克隆的方法，其特征在于:所述步驟(2)中制備Y -RACE-Ready cDNA的具體流程為:
①取0.5μ1 Eppend orf 管，加入 1μ I 全腦總 RNA、ly 15' -CDS 引物、I μ I SMART Ioligo引物(10ymol/L)和2μ I滅菌水，輕輕混勻，于70°C加熱2min，置冰上冷卻2min ； ②離心使液體沉底.加入2μ 15X第I鏈緩沖液、I μ I DTT(20mmol/L)、1 μ IdNTP(10mmol/L)和1μ I MMLV逆轉錄酶(200U/μ I)，隨后用小槍頭輕輕吹打混勻； ③離心使液體沉底.反轉錄于42°C1.5h，加入100 μ I滅菌水，于70°C加熱2min終止反轉錄反應，凍存于_20°C備用； ④隨后，采用通用引物混合物(universalprimer mix, UPM)和下游特異性引物I進行“Touchdown” PCR擴增，向50 μ I PCR反應管中加入以下試劑:34.5μ I去離子水、5 μ 110XAdvantage2PCR 緩沖液、I μ I dNTP (10mmol/L)、I μ 150 X Advantage2PolymeraseMix,5 μ I UPM(IOX)、1 μ I Ρ121 (10 μ mol/L)和2.5 μ 15’-RACE-Ready cDNA，振蕩混勻、離心沉底，覆以2滴石臘油，在Bio-Rad PCR分析儀啟動PCR反應； ⑤將前一步獲得的反應液為模板，以下游特異性引物2和UPM為引物，用ExTaq酶PCR，反應條件如下:94°C變性5min ;94°C反應30s，72°C反應3min，進行5次循環；94°C反應30s，70°C反應30s，72°C反應2min，進行5次循環；94°C反應30s，68°C反應30s，72°C反應2min，進行25次循環；然后72°C延伸IOmin ； ⑥用1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收所需條帶，克隆至pMD-19T載體上，進行測序。
4.根據權利要求1所述的齊口裂腹魚cGnRHII基因克隆的方法，其特征在于:所述步驟(3)中目的片段的分離和回收的具體步驟如下: (3a)從電泳板上切割含目的DNA片段的凝膠塊； (3b)凝膠稱重后并將其放入1.5mL管中，將其適當切小，加速溶解；每IOOmg凝膠加入，400 μ LSolution SN;(3c)凝膠溶解:55~60°C,保溫5-10min,每2min混勻一下,使凝膠溶解,膠完全融化后每 400 μ L Solution SN 中加入 Solution BlOO μ L，混勻； (3d)將3S柱裝入2mL洗管，將上述混合液轉移至3S柱，室溫放置2min.室溫1000Or/min離心Imin,穩定45S ； (3e)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入700 μ LffashSolution,室溫 10000r/min 離心 Imin ； (3f)重復步驟3e —次； (3g)取下3S柱，倒掉收集管中廢液，將3S柱放入同一收集管中，室溫10000r/min離心2min ； (3h)將3S柱放入新的離心管中，在3S柱子膜中央加30 μ L ddH20，不加蓋室溫放置2min ； (3i)蓋上離心管，室溫10000r/min離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，-20°C保 存備用。
【文檔編號】C12N15/10GK103805596SQ201410040443
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月25日 優先權日:2014年1月25日
【發明者】楊世勇, 王韜, 李志瓊 申請人:四川農業大學